zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Nông - Lâm - Ngư

» Nông nghiệp

Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 2 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng

Chia sẻ: Bạch Khinh Dạ Lưu | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:19

Báo xấu

13
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 2 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng cung cấp đến học viên các kiến thức về ứng dụng nuôi cấy mô trong chọn giống cây trồng, khái niệm nuôi cấy mô thực vật, nguyên lý của nuôi cấy mô, các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô, các dạng nuôi cấy mô,... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 2 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng

Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Nuôi cấy mô thực vật là gì? ỨNG DỤNG NUÔI CẤY MÔ TRONG • Nuôi cấy tế bào trần, tế bào, mô hoặc cơ quan CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG thực vật để tái sinh cơ quan hoặc cây hoàn chỉnh trong điều kiện vô trùng (vi nhân giống) - Gọi chung là NUÔI CẤY MÔ. Dr. Vũ Thị Thúy Hằng • Đây là khái niệm chung sử dụng cho tất cả các dạng nuôi cấy trong điều kiện vô trùng dẫn đến sinh trưởng và biệt hóa của mẫu cấy. Nguyên lý của nuôi cấy mô (NCM) Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô NCM dựa trên các nguyên lý sau: • Môi trường nuôi cấy • Chất khoáng, chất điều tiết sinh trưởng, hocmon, nguồn TÍNH TOÀN NĂNG carbon Tiềm năng di truyền của tế bào thực vật để tạo ra cây hoàn • Yếu tố môi trường chỉnh • Ánh sáng, nhiệt độ, quang hợp, chiếu sáng, vô trùng, KHẢ NĂNG BIỆT HÓA môi trường TB giữ được khả năng biệt hóa và phát sinh hình thái • Nguồn mẫu cấy SỰ PHẢN PHÂN HÓA TẾ BÀO • Chủ yếu thường mẫu mô ở đỉnh sinh trưởng Khả năng của tế bào phản ứng với kích thích khởi phát quá • Di truyền trình phát triển dẫn tới sự phát sinh cơ quan. • Các loài khác nhau thể hiện khả năng nuôi cấy mô khác nhau • Trong nhiều trường hợp, các kiểu gen khác nhau trong cùng một loài cũng phản ứng khác nhau với nuôi cấy Tác nhân gel hóa Môi trường nuôi cấy Đối với NCM môi trường sử dụng có thể là bán rắn/đặc hay lỏng. Môi trường đặc cần tác nhân gel. Natri alginate, agar-agar là những tác nhân được sử dụng chủ yếu Chất điều hòa sinh trưởng Nguyên tố đa lượng Nguyên tố vi lượng - Kali (K) - Kẽm (Zn) 1. Auxin: - Phốt pho (P) - Mangan (Mn) - Magie (Mg) - Boron (B) Mục đích của chất điều tiết sinh trưởng là phân chia tế bào và - Canxi (Ca) - Đồng (Cu) sinh trưởng. Vd. IAA, 2 4-D, NAA - Na - Sắt (Fe) Chất điều hòa - Sulfur… - Cobalt (Co) sinh trưởng 2. Cytokinin: - Auxin - I, Ni ... - Cytokinin Chức năng chính là phân chia tế bào. Đây là những dẫn xuất của purin. Vd: Zeatin, BAP, KN, TDZ; 3. Gibberellin Vitamin Đường Tác nhân gel hóa - Thiamine (B1) - Sucrose - Agar Điều hòa sự kéo dài tế bào, sử dụng phổ biến là GA3 - Nicotinic acid (niacin) - Agarose - Pyridoxine (B6) - Các loại khác - Gelrite 4. Abscisic acid - Myo-inositol Ức chế phân bào, thường sử dụng trong phát sinh phôi soma 1 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Sự điều khiển của auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy Cytokinin • 2 hormones ảnh hưởng đến phân hóa tế bào: - Chồi; phôi • Auxin: Kích thích rễ phát triển Mẩu lá • Cytokinin: Kính thích mầm phát triển Mầm • Nhìn chung, tỷ lệ của 2 hocmon này sẽ quyết định sự phát triển cây: Rễ •  Auxin ↓Cytokinin = Rễ phát triển Auxin •  Cytokinin ↓Auxin = Mầm phát triển - rễ; Mô sẹo • Auxin = Cytokinin = Mô sẹo phát triển - callus Sự điều khiển của auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy Môi trường MS Murashige , T. and Skoog, F. (1962): Physiol. Plant., 15: 473-497 PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ 1. Không gian chuẩn bị môi trường Diện tích này có các thiết bị: . Cân phân tích . Máy đo pH . Máy khử trùng/Autoclave . Tủ lạnh 2. Buồng vô trùng Cần để phân lập mẫu cấy và cấy mẫu 3. Khu nuôi cấy Buồng nuôi cấy chiếu sáng cường độ 2000 lux, nhiệt độ 25°±1°C 2 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Quy trình tổng quát trong nuôi cấy mô B1. Nguồn mẫu cấy Là mẫu mô được cắt khỏi mô hoặc cây Bước 1: Chọn vật liệu nuôi cấy Cơ quan dự trữ tươi Chồi ngọn Bước 2: Khử trùng Mầm, hoặc đỉnh sinh trưởng Bước 3: Tạo chồi Rễ, các phần của hoa Lá và lá mầm. Bước 4: Tạo rễ Phải sử dụng mẫu cấy vô trùng cho NCM Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng mô cấy: Bước 5: Cấy cây vào môi trường thích hợp mùa vụ, sinh lý, chất lượng cây nguồn, kích thước. Bước 6: Trồng cây trong vườn ươm B2. KHỬ TRÙNG B6 - Thích nghi khí hậu Khử trùng để tránh sự nhiễm tạp - Cây con in vitro phải được thích nghi khí Rửa bằng nước máy hậu/tôi luyện để dưa ra môi trường sống tự nhiên. - Tất cả các điều kiện kiểm soát phải giảm dần Làm sạch bằng chất tẩy để cây có thể tự thích nghi với điều kiện môi Teepol, Dettol, Tween- 20, trường. - Giá thể sử dụng: đa dạng, có thể sử dụng vermiculate, peat moss làm giá thể. Khử trùng bằng các chất khử trùng như 70% cồn, HgCl2, NaOCl Cây được thích nghi khí hậu PHẦN 2. CÁC DẠNG NUÔI CẤY Trong nhà lưới * Phân loại theo nguồn mẫu nuôi cấy  Nuôi cấy cơ quan/Organ culture  Nuôi cấy callus/Callus culture  Nuôi cấy tế bào trần/Protoplast culture Tất cá các dạng nuôi cấy như noãn, bầu, bao phấn, phôi, nội nhũ đều nằm trong các phạm trù này 3 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 NUÔI CẤY CƠ QUAN Phân loại theo cấu trúc hình thành khi nuôi cấy Nuôi cấy noãn, Nuôi cấy bầu, bao phấn, phôi, nội nhũ • Phát sinh chồi/Plantlets • Cây con/Seedlings • Mô sẹo/Callus NUÔI CẤY CALLUS • Phát sinh phôi soma/Somatic Embryogenesis Nuôi cấy TB đơn Nuôi cấy huyền phù/dung dịch treo NUÔI CẤY PROTOPLAST 2.1. Phát sinh chồi/plantlets 2.1.1. Hình thành chồi trực tiếp từ mô phân sinh đỉnh • Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng/ Meristem culture • Nuôi cấy chồi/ Shoot culture 2.1.2. Hình thành chồi bất định/Adventitious shoot formation Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật A. Mô sẹo từ Catharanthus roseus. (B) Nuôi cấy dịch tế bào từ Coryphanta • Tái tạo cây nhị bội (Diploid plant regeneration) spp. (C) Nốt sần C. roseus. (D) Đầu rễ từ C. roseus. (E) Tái sinh cây từ C. roseus callus. (F) Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của • Tái tạo cây đơn bội/tam bội (Haploid and triploid Agave tequilana. (H) Phôi vô tính của cây Coffea canephora. (I) Nuôi cấy rễ regeneration) cây Psacalium decompositum. - Chồi hình thành trực tiếp từ mô phân sinh đỉnh (đỉnh sinh - Chồi mới bất định hình thành từ mầm mới. trưởng, chồi nách). Nguồn mẫu cấy là đoạn lóng, lá, rễ hoặc các bộ phận khác mà Nguồn mẫu cấy: chồi mầm hoặc một đoạn thân nhỏ có không phải là mô phân sinh/đỉnh sinh trưởng. đốt/mắt Phát sinh cơ quan gián tiếp Mô phân Chồi mới sinh Lóng Chồi phát sinh trực tiếp Chồi mới Chồi nách Lá 4 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 2.1.1 Hình thành chồi từ mô phân sinh Nuôi cấy chồi Hình thành chồi cành Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Mẫu cấy có một số đốt/mắt - Sử dụng đỉnh sinh trưởng kích trên thân thước < 1 mm - Sử dụng trong vi nhân giống, loại bỏ bệnh do virut Các chồi được kích thích Tách các cụm chồi và chuyển mọc thành cụm chồi sang môi trường nuôi cấy khác Nuôi cấy chồi: - Sử dụng một phần đoạn thân có một số đốt/mắt - Hình thức phổ biến để vi nhân giống Nuôi cấy chồi (tiếp) Nuôi cấy chồi (tiếp) Nuôi cấy mắt Chồi đứng - Đoạn thân dài được cắt thành các đoạn nhỏ có - Chồi mang một số đốt được đặt nằm ngang trên bề mặt môi trường; chứa mắt và đặt thẳng đứng trong môi trường - Thân nhú mọc; - Cụm chồi được tách chuyển sang - Chồi mới mọc dài và quá môi trường nuôi cấy khác trình lại lặp lại. Nuôi cấy chồi (tiếp) - Pseudocorms Nuôi cấy chồi (tiếp) - Minitubers Pseudocorms là cấu trúc hình thành khi hạt phong lan nảy mầm Minitubers (củ siêu nhỏ) sản xuất các cây có củ như Phong lan nuôi cấy mô có thể khoai tây, khoai sọ. cho rất nhiều pseudocorms. Mỗi một củ siêu nhỏ dùng để nhân giống 5 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Nuôi cấy chồi (tiếp) – Vi ghép 2.1.2. Hình thành chồi bất định - Vi ghép là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nhưng thông qua dinh dưỡng tự nhiên của Tái tạo cây nhị bội gốc ghép; - Đỉnh sinh trưởng dùng làm mắt ghép được Nguồn mẫu nuôi cấy: mảnh lá tách từ búp non đang sinh trưởng mạnh của cây mẹ trưởng thành, - Gốc ghép là mầm giá mới nảy mầm từ hạt của giống hoang dại; - Toàn bộ cây ghép được nuôi dưỡng trong Nhánh củ điều kiện ống nghiệm vô trùng Mục đích: Cuống lá - Tạo cây con sạch bệnh, đặc biệt bệnh virut; - Nhân giống; - Trẻ hóa lại cây trồng qua một loạt vi ghép; - Trao đổi nguồn gen giữa các nước Tái tạo cây nhị bội (tiếp) Hình thành chồi bất định - Tái tạo cây đơn bội Lóng Rễ Mô sẹo/Callus Nguồn vật liệu nuôi cấy: - Bao phấn, hạt phấn tách rời, cụm hoa (phương pháp này hay được áp dụng cho những loài có hoa nhỏ). - Noãn chưa thụ tinh. - Thụ tinh giả: là quá trình thụ phấn Ứng dụng: nhưng không xảy ra sự thụ tinh. Mặc • Vi nhân giống, đặc biệt ở cây một lá mầm dù vậy, tế bào trứng vẫn được kích • Chuyển gen thích phát triển thành cây đơn bội. - Cứu phôi sau lai xa. 2.2. Hình thành cây con Nuôi cấy hạt: - Chủ yếu cho hạt phong lan - Từ nuôi cấy hạt có kích thước vô cùng nhỏ và - Nuôi cấy phôi không có chất dự trữ - Cứu phôi - Trong tự nhiên, hạt phong - Nuôi cấy bầu noãn và noãn lan thường phụ thuộc vào một loài nấm cộng sinh để nảy mầm; - Tuy nhiên, hạt có thể nảy mầm và phát triển thành cây con trên môi trường phù hợp mà không cần có sự cộng sinh với nấm 6 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Cứu phôi Nuôi cấy phôi - Phôi chưa thành thục được tách khỏi noãn; - Chủ yếu sử dụng trong cứu phôi khi tiến hành lai xa - Phôi thành thục có thể nẩy mầm dễ dàng trên môi trường nuôi cấy; - Ứng dụng: cho nghiên cứu, sử Nuôi cấy noãn, bầu noãn dụng làm gốc ghép trong vi ghép, - Sử dụng trong các lai xa có khó khăn; nhân giống - Noãn không thụ tinh được đưa vào môi trường nuôi cấy và thụ tinh nhân tạo; - Noãn thụ tinh được đưa sang môi trường mới và phát triển thành hạt 2.3. Hình thành mô sẹo Hình thành mô sẹo - Tế bào trần - Mô sẹo có thể hình thành từ - Tế bào trần được phân lập và bất cứ nguồn mẫu nuôi cấy màng tế bào được hòa tan nhờ nào; enzyme; - Mô sẹo có thể được nuôi - 2 tế bào trần có thể dung nạp để cấy trong môi trường lỏng và hình thành 1 tế bào. Nhân dung hợp lắc để tạo dung dịch huyền phù và tạo thành một kiểu gen; Phương pháp sử dụng để tạo thành cây lai - Bioreactors: là hệ thống tự từ 2 giống khác nhau khá xa về mặt động để tạo mô sẹo; di truyền và bất hợp trong tự nhiên; Dùng để sản xuất các loại - Thành tế bào và chồi mới được tái enzyme, thuốc, màu và hương vị tự nhiên sinh từ mô sẹo; 2.4 Phát sinh phôi soma Hạt nhân tạo - Phôi soma hình thành từ tế bào sinh dưỡng; - Hạt nhân tạo gồm phôi soma hoặc chồi được bao bọc bởi một lớp vỏ bảo - Phôi soma cũng trải qua các vệ nhân tạo nhằm tạo điều kiện cho giai đoạn tương tự của hình các phôi tái tạo thành cây một cách hiệu quả . thành phôi so với hạt lưỡng bội; Hạt nhân tạo dùng để: - Dùng để nhân dòng vô tính, khôi phục cây chuyển gen 1. Nhân vô tính, thay thế phương pháp nhân bằng hạt. - Tuy nhiên phôi soma không có 2. Thay thế hạt lai. nội nhũ, vỏ hạt và thường nhỏ hơn hoặc lá mầm bất thường 3. Vận chuyển các vi sinh vật có ích, thuốc trừ sâu và chất điều hòa sinh trưởng 7 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 PHẦN 3. ỨNG DỤNG CỦA NUÔI 1. Nhân nhanh cây con từ nguồn gen ưu việt = nhân vô CẤY MÔ tính/dòng hóa thông qua vi nhân giống  Vi nhân giống/nhân giống sạch bênh Vd. Khoai tây, dâu tây, cẩm chướng, v.v.  Bảo quản nguồn gen 2. Rút ngắn chu kỳ chọn giống: Nuôi cấy phôi.  Biến dị dòng soma & chọn lọc in vitro Vd Táo tây, đào, lê, cam quýt  Cứu phôi (lai xa) 3. Bảo quản lạnh sâu  Nuôi cấy noãn và bầu Thực liệu có thể bảo quản vô hạn ở nhiệt độ rất thấp mà  Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn (tạo đơn bội/đơn bội không can thiệp vào gen kép)  Nuôi cấy callus và tế bào trần (protoplast) -196°C trong ni tơ lỏng hạt phấn, tế bào, DNA, mô, cơ quan, nụ, hạt,v,v.  Dung hợp tế bào trần  Tạo hạt nhân tạo 4. Cây sạch bệnh có thể tạo ra bằng phát sinh phôi  Tạo chất chuyển hóa thứ cấp soma. Có thể tạo biến dị soma bằng đột biến phôi soma 5. Chất chuyển hóa thứ cấp có thể tách chiết qua nuôi cấy 3.1. Vi nhân giống callus Vd. Shiconin, Digitoxin 6. Cây chuyển gen Tái sinh tế bào chuyển gen thành cây hoàn chỉnh 7. Tạo hạt nhân tạo Bất kỳ phần soma nào của cây có thể làm thành hạt bọc bằng vỏ hạt nhân tạo; hạt nhân tạo có khả năng tạo thành cây hoàn chỉnh trong bất kỳ điều kiện nào. 8. Tạo con lai soma/tổ hợp di truyền Các bước nuôi cấy mô/vi nhân giống • Giai đoạn 0 – chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Khử trùng mô thực vật • Giai đoạn I - khởi động nuôi cấy Đặt mô cấy vào môi trường dinh dưỡng • Giai đoạn II – Nhân giống Chuyển mô cấy (callus, phôi vô tính, cụm chồi) sang môi trường nhân chồi; chia cắt chồi liên tục • Giai đoạn III – Ra rễ Chuyển mô cấy (chồi) sang môi trường tạo rễ • Giai đoạn IV – Chuyển ra đất Chuyển cây hoàn chỉnh ra đất, tôi luyện/thích nghi 8 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Chương trình làm sạch bệnh vi rút cho khoai tây Sản xuất giống khoai tây thương phẩm A B C D Quy trình làm sạch vi rút của dòng KT nhiễm và sản xuất củ giống Thân ngọn (A) từ đỉnh sinh trưởng không vi rút nhân in vitro (B) chuyển ra môi hạt nhân trường đất và trồng trong nhà lưới (C, D) để tránh vector truyền bệnh Ưu điểm của vi nhân giống Nhược điểm của vi nhân giống  Hệ số nhân cao, nhanh  Cần thiết bị chuyên dụng  Nhân giống trong điều kiện có kiểm soát trong PTN  Đồi hỏi chuyên môn kỹ thuật nhiều hơn  Nhân giống liên tục quanh năm  Quy trình không tối ưu cho tất cả các loài  Tiềm năng tạo ra vật liệu sạch bệnh  Cây tạo thành có thể không phù hợp tiêu chuẩn công  Giảm thiểu không gian cây giống gốc nghiệp  Đầu tư ban đầu cao Ứng dụng vi nhân giống Cách loại bỏ virut  Tăng nhanh vật liệu trồng giống cây trồng mới (nhân Xử lý nhiệt nhanh) Cây sinh trưởng nhanh hơn virut ở nhiệt độ cao.  Loại bỏ bệnh Sử dụng Đỉnh sinh trưởng  Dòng hóa các loại cây không dễ nhân bằng phương pháp truyền thống (ít cành/hạt; chà là, ferns) Virut được vận chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua cầu liên bào và mô mạch. Đỉnh sinh trưởng thường không có virut. Không phải tất cả tế bào trong cây đều bị nhiễm. Chồi bất định tạo thành từ các tế bào đơn có thể cho chồi không có virut. 9 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Loại bỏ virut 3.2. Bảo tồn nguồn gen Cây từ ruộng  Nội vi : Bảo tồn trong môi trường sống tự nhiên – rừng, vườn, trang trại Trồng trong nhà lưới  Ngoại vi : Sinh trưởng Xử lý nhiệt – Bảo tồn Tập đoàn trên đồng ruộng, vườn thực vật Hình thành chồi tự nhiên 35oC /tháng – Tập đoàn hạt bất định – Tập đoàn In vitro: áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô ‘Cây sạch virut • Sinh trưởng bình thường (bảo quản ngắn hạn) • Sinh trưởng chậm (bảo quản trung hạn) Nuôi cấy đỉnh Kiểm tra virut • Bảo quản lạnh sâu (bảo quản dài hạn) sinh trưởng  Ngân hàng DNA Nhân giống Bảo tồn in vitro * Tầm quan trọng của bảo tồn nguồn gen: • Mục tiêu cơ bản của hệ thống bảo quản in vitro • Bảo tồn kiểu gen quý hiếm – Duy trì sự ổn định di truyền • Bảo tồn nguồn vật liệu – Bảo quản vô hạn mà không mất sức sống * Những nhược điểm của bảo tồn truyền thống • Hai loại hệ thống: • Hạt: sức sống, sâu bệnh - Bảo quản lạnh (1-9 ˚C) • Các cây trồng sinh sản vô tính: chi phí cho - Bảo quản lạnh sâu: trong môi trường ni-tơ lỏng (-196 ˚C) không gian và nhân công Ưu điểm của bảo tồn in vitro Bảo quản lạnh - Tiết kiệm không gian bảo quản và nhân công  Bảo quản ở nhiệt độ không đóng băng,1-9 °C tùy theo - Cây sạch sâu bệnh và virut loài. - Môi trường bảo quản có thể được sử dụng làm  Bảo quản nuôi cấy chồi (giai đoạn I hoặc II) môi trường nhân trong bảo tồn cây sinh sản vô tính • Tốt với dâu tây, khoai tây, nho, và nhiều loài cây trồng khác. - Vận chuyển quốc tế thuận lợi • Chuyển sang môi trường mới 6 tháng hoặc 1 năm 1 lần • Không có đất • Cây sạch bệnh 10 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Ưu điểm: Bảo quản lạnh sâu  Đơn giản, Bảo quản mô sống ở nhiệt độ cực thấp (-196°C)  Tỉ lệ sống cao, Bảo quản nguồn gen TV  Có ích đối với vi nhân giống (đặc biệt trong thời kì có • Các loài sinh sản vô tính (rễ và củ, cay cảnh, cây ăn quả) nhu cầu thấp) • Các loài có hạt khó bảo quảns (dừa, cà phê, chôm chôm) Bảo tồn mô có đặc điểm đặc biệt Nhược điểm • Các dòng tế bào sản sinh thuốc và cồn • Có thể không thích hợp đối với các loài nhiệt đới vì TV • Các mô chuyển nạp di truyền nhiệt đới mẫn cảm với tổn thương lạnh Bảo tồn thể gây bệnh TV (nấm, tuyến trùng) • Cần có máy làm lạnh, đắt hơn bảo quản lạnh sâu Các bước bảo quản lạnh sâu  Chọn  Cắt mô hay cơ quan  Nuôi cấy vật liệt nguồn  Chọn nuôi cấy khỏe mạnh  Phun chất bảo vệ lạnh sâu  Xử lý trước sinh trưởng  Làm lạnh  Bảo quản  Làm ấm và dã đông  Phục hồi sinh trưởng  Kiểm tra sức sống  Sau dã đông 3.3 Biến dị dòng soma Biến dị di truyền  Biến dị hình thành trong các tế bào soma phân chia • Biến dị sẵn có/có trước trong các tế bào của mẫu cấy nguyên nhiễm trong quá trình nuôi cấy • Gây ra bởi đột biến và những thay đổi khác của DNA- sự  Hiện tượng phổ biến của tất cả hệ thống tái sinh có pha sắp xếp lại của NST callus • Xảy ra với tần suất cao  Biến dị ở các tính trạng được tạo ra bởi chu kỳ nuôi cấy Hai loai biến dị dòng soma: Biến dị không di truyền – biểu sinh • Có thể di truyền, những thay đổi di truyền (thay đổi DNA) • Ổn định, nhưng sự thay đổi không di truyền (thay đổi sự • Biến dị tạo thành trong quá trình nuôi cấy mô biểu hiện của gen - biểu sinh) • Gây ra bởi sự thay đổi kiểu hình tạm thời • Xảy ra với tần suất thấp 11 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Callus Nguyên nhân biến dị dòng xô ma Phát sinh cơ quan Biến dị xô ma Nguyên nhân Nguyên nhân sinh lý sinh hóa Cây tái sinh Tôi luyện và tự thụ Nguyên nhân di truyền Tế bào nuôi cấy tiếp xúc với chất điều tiết sinh trưởng. Các bước tạo và chọn lọc biến dị dòng xô ma Điều kiện nuôi cấy Nguyên nhân sinh lý Nguyên nhân di truyền • Tế bào nuôi cấy tiếp xúc với chất điều tiết sinh trưởng. 1 Thay đổi số NST • Điều kiện nuôi cấy • Bội nguyên: thay đổi cả bộ NST – đơn bội, đa bội • Lệch bội: thay đổi một phần của bộ NST - Nguyên nhân sinh hóa • Mất khả năng quang hợp do thay đổi quá trình đồng 2 Thay đổi cấu trúc NST hóa carbon • Mất đoạn • Đảo đoạn • Sinh tổng hợp tinh bột thông qua chu trình carotenoid • Lặp đoạn • Đồng hóa ni tơ • Chuyển đoạn • Kháng sinh. Nguyên nhân di truyền Nguyên nhân di truyền 3 Đột biến gen 6. Trình tự ADN  Thay đổi trong ADN • Chuyển trạng thái (transition)  Phát hiện thay đổi kích thước phân đoạn bằng • Chuyển chéo (transversion): thay đổi mạnh hơn enzym hạn chế • Chèn bazơ  Thay đổi protein • Mất bazơ  Mất hay thêm băng protein  Thay đổi hàm lượng protein đặc trưng 4. Hoạt hóa phần tử chuyển vị trí 5. Khuyếch đại gen – làm tăng sự biểu hiện của gen  Methyl hóa ADN (epigenetic)  Methyl hóa cytosin làm bất hoạt quá trình phiên mã 12 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Biến dị không di truyền – Biểu sinh Phát hiện và phân lập các biến dị - mất nhu cầu đối với yếu tố sinh trưởng ngoại sinh (chất điều dòng soma tiết sinh trưởng), ví dụ, auxin, cytokinin • callus mất nhu cầu chất điều tiết sinh trưởng trong quá 1. Phân tích các đặc điểm hình thái trình cấy chuyển sang môi trường mới • Tính trạng chất lượng: chiều cao cây, TGST, ngày ra hoa, kích thước lá, ... • Không truyền qua sinh sản hữu tính • Tính trạng số lượng: năng suất hạt, hoa, ... 2. Phát hiện biến dị bằng quan sát tế bào • Nhuộm màu các mô phân sinh như đầu rễ, đầu lá bằng feulgen và acetocarmin để nhận biết số lượng và hình thái NST. 3. Phát hiện biến dị thông qua xác định hàm lượng ADN • Phát hiện nhân nhuộm màu feulgen bằng quang kế tế bào có thể sử dụng để đo hàm lượng ADN Phát hiện và phân lập các biến dị dòng soma Phát hiện và phân lập các biến dị dòng xô ma 4. Phát hiện biến dị bằng điện dị trên gel 7. Phát hiện biến dị chống chịu điều kiện bất lợi của • Thay đổi nồng độ enzym, protein, các sản phẩm hóa học như sắc môi trường tố, alkaloid và a xít amin có thể phát hiện thông qua các mô thức • Chọn lọc các dòng tế bào chịu mặn (thuốc lá) điện di • Chọn lọc các dòng tế bào chịu úng và chịu hạn (cà chua, lúa 5. Phát hiện biến dị kháng bệnh nước) • Có thể sử dụng độc tố làm tác nhân chọn lọc trong quá trình nuôi • Chọn lọc dòng tế bào chịu nhiệt độ bất lợi (lê). cấy (mía) • Chọn lọc khả năng chịu độc khoáng, chủ yếu là độc nhôm (cao lương) 6. Phát hiện biến dị kháng thuốc trừ cỏ • Bổ sung thuốc trừ cỏ vào môi trường nuôi cấy làm tác nhân chọn lọc có thể chọn lọc được cây kháng thuốc trừ cỏ. Ưu điểm của biến dị dòng soma Nhược điểm của biến dị dòng soma • Hỗ trợ trong cải lương giống cây trồng • Tạo ra sự không đồng nhất trong quá trình nhân hàng loạt • Tạo ra các biến dị di truyền bổ sung các kiểu gen ưu tú, như cây ăn quả, cây lâm nghiệp • Tăng, cải tiến sản xuất các chất đồng hóa thứ cấp • Các biến dị chọn lọc không ổn định về di truyền • Chọn cây kháng với nhiều độc tố khác nhau, thuốc trừ • Đòi hỏi nhiều thí nghiệm đồng ruộng cỏ, độ mặn cao, độc khoáng chất • Không thích hợp cho các tính trạng nông học phức tạp như • Thích hợp cho các loài cây vô tính, thân gỗ năng suất, chất lượng, ... • Có thể hình thành các biến dị với tính đa hiệu. 13 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Quy trình chọn dòng soma Yêu cầu đối với chọn dòng soma • Sử dụng nuôi cấy làm vật liệu khởi đầu • Quy trình chọn lọc hiệu quả • Hướng vào các tế bào đơn trong nuôi cấy đa bào • Phần lớn đột biến có hại • thường nuôi cấy dung dịch huyền phù, nhưng có thể sử dụng nuôi • Ruồi hại quả, tỉ lệ là ~800:1 có hại : có lợi cấy callus (càng tiếp xúc nhiều với tác nhân chọn lọc càng tốt) • Phương án lựa chọn: sử dụng tác nhân đột biến lý, hóa học • Phần lớn đột biện là lặn • Phải sang lọc thế hệ M2 hoặc các thế hệ sau • Áp dụng áp lực chọn lọc cho nuôi cấy • Cần quần thể lớn để xác định đột biến có lợi: • Mục tiêu (tỉ lệ chết cao) • Ước lượng: ~10,000 cây để có một đột biến có lợi • Tạo ra liều lượng sàng lọc (liều lượng gây chết phụ thuộc vào số tế bào sống sót mong đợi • Mục tiêu rõ ràng • Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các tế bào sống sót - Phát sinh cơ quan hay phát sinh phôi 3.4 Nuôi cấy phôi/cứu phôi Embryo Culture of Citrus • Cứu phôi con lai xa (khác loài/chi) • Con lai xa thường chết phôi sớm • Nguyên nhân: mất cân bằng phôi-nội nhũ Bông, cây thập tự, Lily, Lanh • Tạo ra đơn bội • Có ích để thu nhận đơn bội ở đại mạch, lúa mì, và các cây khác • Hệ thống đại mạch sử dụng làm bố cho phấn Nuôi cấy phôi dừa Phương pháp Bulbosum Hordeum Hordeum bulbosum vulgare Đại mạch X Hoang dai họ hàng 2n = 2X = 14 ↓ 2n = 2X = 14 Cứu phôi Đại mạch đơn bội 2n = X = 7 NST của H. bulbosum bị đào thải • Phương pháp này hiệu quả hơn phương pháp nuôi cấy tiểu bào tử trong tạo ra đại mạch đơn bội. • Ngày nay, với các môi trường nuôi cấy cải tiến (sucrose thay thế bằng maltose), nuôi cấy tiểu bào tử hiệu quả hơn nhiều (~2000 cây trên 100 bao phấn) 14 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Kỹ thuật Bulbosum “lai xa” giữa lúa mì và mì đen đòi hỏi phải cứu phôi và xử lý Hordeum vulgare là mẹ hóa chất để nhân đôi số nhiễm sắc thể. Hợp tử phát triển thành phôi với sự đào thải các nhiễm sắc thể của Hordeum bulbosum Có thể, chỉ còn lại nhiễm sắc thể của H. vulgare Phôi được “cứu“ để tránh chết non Tách phôi non:  Thụ phấn bằng tay hoa mới nở  Khử trùng bề mặt – EtOH trên cấu trúc mở  Mổ cắt dưới kính hiển vi là cần thiết  Đặt trên môi trường đặc – thường sử dụng môi Triticale trường nghiêng để tránh ngưng tụ Tạo cây đơn bội Nuôi cấy hạt phấn Cứu phôi của con lai/tổ hợp lai xa • Tạo ra thể đơn bội Nuôi cấy bao phấn/Nuôi cấy tiểu bào tử • Nuôi cấy bao phấn hay hạt phấn (tiểu bào tử) • Tạo ra cây thành thục từ một tiểu bào tử Nuôi cấy noãn • Nuôi cấy noãn không thụ tinh (đại bào tử) Khởi động từ nhị và nhụy Đa bội hóa Mô cấy nhị Hình thành callus từ Hình thành Callus Mô kết nối từ đầu chỉ nhị Callus phát sinh phôi Phôi phát triển Phôi nảy mầm 15 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Kỹ thuật lai soma 3.5. Lai soma (dung hợp tế bào trần) Phát triển cây lai thông qua dung hợp tế bào trần soma của 1. Phân lập TBT hai loài/giống khác nhau 2. Dung hợp TBT của hai loài/giống mong muốn 3. Xác định & chọn lọc tế bào lai 4. Nuôi cất TB lai 5. Tái sinh cây lai soma Phân lập tế bào trần Phương pháp cơ giới (Tách tế bào trần từ mô thực vật) TB con nguyên sinh Mô TV Quan sát TB dưới kính hiển vi 2. Phương pháp enzym 1. Phương pháp cơ giới Cắt thành TB bằng dao Giải phóng nguyên sinh Thu tế bào trần Phương pháp enzym Phương pháp cơ giới Khử trùng lá, loại bỏ biểu bì Được sử dụng đối với tế bào có không bào như vảy củ hành, củ cải Năng suất tế bào trần thấp Tốn công Tế bào con nguyên sinh Tế bào con nguyên sinh Khả năng sống của tế bào trần thấp Pectinase +cellulase Pectinase Giải phóng Giải phóng chất Giải phóng chất nguyên sinh nguyên sinh tế bào phân lập cellulase Tế bào trần phân lập 16 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Dung hợp tế bào trần Phương pháp Enzym (Dung hợp TBT của hai hệ gen khác nhau) Được sử dụng đối với nhiều loại mô và cơ quan gồm lá, cuống lá, quả, rễ, bao mầm, thân mầm, thân, đỉnh chồi, v.v. 1. Dung hợp 2. Dung hợp  Mô thịt lá – nguồn thích hợp nhất tự phát cảm ứng  năng suất tế bào trần cao  dễ thực hiện  sức sống tế bào trần cao hơn Dung hợp Dung hợp Trong loài Giữa các loài Dung hợp điện hóa học cơ học Dung hợp tự phát - Tế bào trần dung hợp tự phát trong quá trình phân lập do tiếp xúc về lý học: • Trong loài tạo ra thể đồng nhân • Giữa các chi không có ý nghĩa Dung hợp cảm ứng Những ứng dụng của dung hợp tế bào trần - Dung hợp hóa học: Dung hợp cảm ứng bởi hóa chất. Các Kết hợp hai bộ gen đầy đủ loại tác nhân dung hợp: Polyethylene Glycol (PEG) • Một con đường để tạo đa bội thể khác nguồn NaNo3  Thụ tinh in vitro Ca 2+  Chuyển một phần hệ gen Polyvinyl alcohol • Trao đổi một hay một số tính trạng giữa các loài - Dung hơp cơ học: Dung hợp của tế bào trần dưới kính hiển vi bằng vi thao tác và tiểu pippete (perfusion • Có thể cần hoặc không cần chiếu xạ ion hóa micropipette) Kỹ thuật di truyền - Dung hợp điện: Cảm ứng dung hợp bằng kích thích điện. • Vi tiêm, xung điện, Agrobacterium Dung hợp tế bào trần được cảm ứng nhờ áp dụng từ Chuyển các cơ quan tử trường điện cao (100kv m-1) trong micro giây • Duy nhất đối với dung hợp TBT • Chuyển ti thể và/hoặc sắc lạp thể giữa các loài 17 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Kết quả có thể của dung hợp hai tế bào trần khác Xác định dung hợp mong muốn nhau về di truyền • Chọn lọc kiểu bổ sung • Có thể thực hiện nếu mỗi bố mẹ có chỉ thị có thể chọn lọc khác nhau (vd. Kháng kháng sinh hay thuốc trừ cỏ), sản phẩm dung hợp có cả = Sắc lạp thể hai chỉ thị = Ti thể • Máy phân loại/lọc hoạt hóa bằng huỳnh quang Dung hợp • Trước tiên đánh dấu tế bào bằng chị thị huỳnh quang; sản phẩm dung = nhân hợp có hai chỉ thị Thể dị nhân • Phân lập cơ giới • Tốn công nhưng thực hiện được nếu bắt đầu bằng các lọai tế bào khác nhau • Nuôi cấy hỗn hợp • Về cơ bản, không chọn lọc; tái sinh tất cả và sau đó sàng lọc các tính cybrid hybrid cybrid trạng mong muốn hybrid DUNG DỊCH HUYỀN PHÙ TBT ĐIỂN HÌNH + TBT LÁ, DUNG Ưu điểm của lai soma HỢP BẰNG PEG • Tạo ra con lai khác loài và khác chi mới • Pomato (con lai cà chua và khoai tây) • Tạo ra thể lưỡng bội và đa bội hữu dục từ thể đơn bội, tam bội và lệch bội bất dục • Chuyển gen kháng bệnh, kháng các điều kiện bất lợi, kháng thuốc trừ cỏ và nhiều tính trạng chất lượng khác • Tạo ra các dòng dị hợp tử trong một loài không thể nhân giống bằng phương tiện vô tính • Nghiên cứu số phận của các gen tế bào chất • Tạo ra con lai độc nhất của nhân và tế bào chất CÂY LAI SOMA MỚI 18 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 3.6. Thụ tinh in vitro Một quy trình sử dụng trứng và tinh trùng và đặt chúng cùng nhau trong đĩa để thụ tinh  Sử dụng các tế bào trứng và tinh trùng đơn và dung hợp chúng bằng điện  Sản phẩm dung hợp được nuôi cấy riêng trong 'Millicell' lồng vào một lớp tế bào nuôi dưỡng  Phôi tạo thành được nuôi cấy để tạo ra cây mới hữu dụcs Hết chương II 19 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.