zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Nông - Lâm - Ngư

» Nông nghiệp

Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 3.2 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng

Chia sẻ: Bạch Khinh Dạ Lưu | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:14

Báo xấu

22
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 3.2 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng cung cấp đến học viên các kiến thức về mồi PCR/PCR primer; nguyên tắc chung trong thiết kế mồi; một số phần mềm trong thiết kế mồi;... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 3.2 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng

Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam MỒI PCR/ PCR PRIMER Vũ Thị Thúy Hằng Nội dung 1. Khái niệm 2. Nguyên tắc chung trong thiết kế mồi 3. Một số phần mềm trong thiết kế mồi https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 1
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam PCR: công nghệ làm thay đổi thế giới The Polymerase Chain Reaction (PCR) làm cuộc cách mạng trong khoa học sự sống vì cho phép nhân bản một số lượng lớn DNA một cách thuận tiện, hiệu quả, và có độ cậy Được phát minh năm 1983 bởi Kary Mullis, dành giải Nobel năm 1993 Kỹ thuật PCR được sử dụng rộng rãi khi phát hiện ra Taq polymerase, một DNA polymerase trong vi khuẩn Thermus aquaticus, bền với nhiệt. Nguyên liệu chính dùng trong PCR: - DNA nucleotides: thành phần hình thành nên đoạn DNA mới - DNA khuôn: trình tự/đoạn DNA muốn nhân bản - Primers/Mồi: đoạn DNA mạch đơn gồm 16--50 nucleotide bắt cặp bổ sung với một vùng ngắn ở 2 đầu của đoạn DNA khuôn - DNA polymerase: enzyme bền với nhiệt độ dùng để tổng hợp đoạn DNA mới Mồi – quyết định thành công của phản ứng PCR Đặc hiệu/ Chuyên biệt? Gắn với DNA khuôn https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 2
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 1. Khái niệm  Mồi là đoạn nucletotit ngắn, bắt cặp bổ sung với đầu 5’ hay 3’ của DNA mạch khuôn  Thiết kế mồi là tạo ra một đoạn trình tự nucleotit ngắn sử dụng trong nhân bản một vùng đặc hiệu của DNA. Mồi được thiết kế dựa vào 2 vùng trình tự đã biết nằm ở 2 đầu đoạn gen cần nhân bản  Mồi thiết kế được dùng để : - Tìm gen mới - Xây dựng công cụ để nhận biết, phân biệt - Tối ưu sản phẩm PCR https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 3
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 2. Nguyên tắc chung khi thiết kế mồi Trước khi thiết kế mồi – Đừng phát minh lại bánh xe! https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 4
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Trước khi thiết kế mồi – Tìm kiếm và sử dụng đúng nguồn thông tin!  Mồi thiết kế dùng để làm gì?  Nhân bản DNA nói chung?  Phát hiện sự khác nhau ở cấp độ từng nucleotide/SNPs?  Nghiên cứu về Methylation (nhóm methyl gắn vào và làm DNA thay đổi chức năng)  Trong PCR để định lượng được DNA nhân bản (Real-time PCR)  Làm mồi dò cho microarray?  Cho nhiều PCR trong cùng một phản ứng (sử dụng nhiều mồi)  Bắt đầu từ đâu?  Trình tự DNA mạch đơn/ Trình tự protein?  Nhiều file trình tự DNA/protein?  Ngân hàng gen (GenBank ID/Gene ID/Gene Symbol/rsSNP ID? Sau đó, xem xét một số lựa chọn!  Hầu hết các mồi có thể được thiết kế từ một số phần mềm khác nhau  Các phần mềm khác nhau có thể cho kết quả khác nhau, chủ yếu về:  Cách tiếp cận  Tiêu chí thiết kế và mặc định (Designing criteria and default settings)  Tính toàn diện  Tính năng sử dụng  Tốc độ  Xem xét đến lựa chọn thứ 2 khi:  Bạn mới lần đầu thiết kế  Bạn không có nhiều sự tự tin trong lựa chọn kết quả https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 5
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Những nguyên tắc chung trong thiết kế mồi Khi thiết kế mồi phải xem xét đến các yếu tố:  Chiều dài của mồi và của đoạn nhân bản  Nhiệt độ chảy  Nhiệt độ gắn mồi  Tính đặc hiệu/chuyên biệt và tránh tương đồng chéo  Hàm lượng GC; trình tự chạy và trình tự lặp  Tránh tương tác giữa mồi – mồi hình thành cấu trúc bậc 2  Kẹp GC (GC clamp) Chiều dài của mồi và đoạn nhân bản  Chiều dài mồi quyết định tính đặc hiệu và ảnh hưởng lớn đến nhiệt độ gắn mồi:  Quá ngắn: tính đặc hiệu kém, dẫn đến nhân bản cả các đoạn không đặc hiệu  Quá dài: giảm hiệu quả gắn với DNA khuôn ở nhiệt độ gắn mồi bình thường do tăng xác suất hình thành cấu trúc bậc hai.  Chiều dài tối ưu  18-24 bp cho PCR thông thường  30-35 bp cho nhiều PCR trong một phản ứng  Chiều dài đoạn DNA nhân bản tối ưu  300-1000 bp cho PCR thông thường, tránh > 3 kb  50-150 bp PCR để định lượng, tránh > 400 bp https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 6
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Chiều dài mồi Xác suất tìm thấy 1 nucleotit A, G, C, T trong một trình tự DNA là: 1/4 (4-1) Xác suất tìm thấy trình tự có 2 nucleotit liền nhau (vd AG) trong trình tự DNA là: 1/16 (4-2) Xác suất tìm thấy trình tự 4 nucleotit liền nhau trong trình tự DNA là: 1/256 (4-4) Cứ như vậy, một trình tự 16 nucleotit chỉ xuất hiện 1 lần trong tối thiểu 4-16 nucleotit, ~ 4 tỷ nucleotit, ~ genome của người hoặc ngô Nhiệt độ chảy (Tm)  Tm là nhiệt độ tại đó 50% DNA kép tháo xoắn thành mạch đơn  Ảnh hưởng bởi độ dài mồi, thành phần nucleotide và nồng độ mồi.  Ảnh hưởng bởi nồng độ muối (MgCl2) trong phản ứng PCR  Tm = 2(A+T)+4(G+C).  Nhiệt độ chảy  52°C-- 60°C  Tm > 65°C thường tránh do khả năng gắn mồi với cấu trúc bậc 2.  Tm (75°C-- 80°C) được sử dụng để nhân bản những đoạn có hàm lượng GC cao  Sự khác biệt về Tm giữa mồi xuôi và ngược < 5oC https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 7
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Nhiệt độ gắn mồi (Ta)  Ta là nhiệt độ tại đó mồi được gắn vào mạch DNA khuôn  Ta vs. Tm  Ta ảnh hưởng bởi Tm của mồi và đoạn nhân bản: tối ưu: Ta=0.3 x Tm(mồi)+0.7 x Tm(sản phẩm PCR)-25  Nguyên lý chung: Ta thấp hơn 5°C so với Tm  Nhiệt đô Ta cao hơn tăng tính đặc hiệu của phản ứng nhưng có thể cho lượng DNA nhân bản ít hơn Tính đặc hiệu và tránh tương đồng chéo  Tính đặc hiệu  Chỉ có duy nhất một vị trí bắt cặp của mồi trên DNA khuôn  Quyết định bởi chiều dài mồi và trình tự nucleotit  Phụ thuộc vảo bản chất của đoạn DNA làm khuôn.  Tương đồng chéo  Mồi thiết kế không nhân gen khác trong phản ứng PCR.  Mồi chứa nhiều trình tự lặp lại thường nhân bản cả đoạn không đặc hiệu.  Để đảm bảo tính đặc hiệu và tránh xảy ra tương đồng chéo  BLAST trình tự của mồi PCR thiết kế với trình tự trong NCBI xem nó có thể nhân đoạn tương đồng nào khác không? https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 8
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Hàm lượng GC; trình tự chạy và trình tự lặp  Hàm lượng G/C  Tối ưu: 45-55%  Thông thường G/C trong khoảng: 40-60%  Trình tự chạy  Mồi có trình tự chạy của một bazơ dài dẫn đến gắn mồi sai.  VD AGCGGGGGATGGGG trình tự chạy của 'G' là 5 and 4. Tối đa là 4 nucleotit.  Trình tự lặp  Một trình tự lặp gồm 2-nucletotit liền nhau được lặp đi lặp lại nhiều lần. VD: ATATATAT.  Số trình tự lặp tối đa trong đoàn mồi thiết kế là 4 Tránh hình thành cấu trúc bậc 2 của mồi Cấu trúc bậc 2 của mồi có thể hình thành do tương tác của bản thân mồi và giữa cặp mồi với nhau, ảnh hưởng đến bắt cặp của mồi với DNA khuôn và ảnh hưởng tới phản ứng PCR. Có thể dưới các dạng:  Kẹp tóc/Hairpins  Hình thành do tương tác của bản thân mồi: sự bắt cặp của các nucletotit trong mồi  Tự bắt cặp/ Self-Dimer  Do tương tác giữa mồi: sự bắt cặp của các nucletotit giữa các mồi  Bắt cặp chéo  Do sự tương tác giữa mồi xuôi và mồi ngược: sự bắt cặp của các nucletotit giữa mồi xuôi và mồi ngược; https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 9
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Kẹp tóc Tự bắt cặp Bắt cặp chéo Kẹp GC (GC clamp)  GC clamp  Sự có mặt của G hoặc C trong 5 nucletotit cuối ở đầu 3’ của mồi, giúp cho sự bắt cặp đặc hiệu giữa mồi và DNA khuôn (do liên kết mạnh của G/C - 3 liên kết hydro)  Tránh có nhiều hơn >3 G hoặc C ở đầu 3’ https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 10
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Kết luận: Một mồi tốt là mồi:  Độ dài: 18-24 bases  Tỷ lệ G/C: 40-60%  Cân đối giữa G/C và A/T (1:1)  Tm cho phép gắn mồi ở nhiệt đột 55-65°C  Không có sự bắt cặp của mồi tạo thành cấu trúc bậc 2  Có G hoặc C ở trong 5 nucletotit cuối đầu 3’ Cặp mồi xuôi và ngược cần:  Nhiệt độ chảy tương đương nhau, không khác nhau quá 5°C  Không có sự bắt cặp chéo giữa mồi xuôi và mồi ngược 3. Một số phần mềm thiết kế mồi Việc tính toán thủ công để kiểm tra các yêu cầu trên cho mỗi đoạn mồi dự định thiết kế là rất tồn thời gian và công sức. Việc làm này trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn nhờ sử dụng các phần mềm thiết kế mồi như:  Oligo  Primer  PrimerQuest  Primer3Plus  PrimerZ  PerlPrimer https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 11
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Các bước trong thiết kế mồi 1. Có trình tự của khuôn DNA Bằng một trong các cách: - Giải trình tự DNA/RNA của các sinh vật, từ đó thiết kế mồi theo trình tự đã giải - Lấy trình tự nucletotit của các sinh vật trên dữ liệu NCBI rồi từ đó thiết kế mồi dựa vào phần mềm 2. Nhập thông tin về trình tự của khuôn DNA 3. Yêu cầu các thông số thiết kế mồi trong phần mềm 4. Phần mềm sẽ tính toán và cung cấp trình tự của mồi 5. Kiểm tra xem mồi có thỏa mãn các yêu cầu của mồi tốt, nếu không thì lặp lại thiết kế Không Thỏa mãn yêu Có Tìm trình tự Thiết kế mồi Kiểm tra cầu không? Phản ứng PCR Giải trình tự/ Dựa trên các tiêu chí về …điện di và kiểm tra Các phần mềm NCBI/ một mồi tốt: thiết kế tính đặc hiệu, phản Cơ sở dữ liệu - Tm ứng... - độ dài - độ đặc hiệu - cấu trúc bậc 2 -.... https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 12
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam General Purpose PCR Primer Design Tool– Primer3 http://simgene.com/Primer3 General Purpose PCR Primer Design Tool– Primer3Plus http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 13
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam General Purpose PCR Primer Design Tool– PrimerZ Web Site: http://genepipe.ncgm.sinica.edu.tw/primerz/beginDesign.do General Purpose PCR Primer Design Tool – PerlPrimer Web Site: http://perlprimer.sourceforge.net/index.html PerlPrimer screenshots: http://perlprimer.sourceforge.net/screenshots.html More Info: http://www.hsls.pitt.edu/guides/genetics/obrc/dna/pcr_oligos/URL1167845497/info https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 14

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.