Bài giảng Di truyền học vi sinh vật

Chia sẻ: Thanh Thảo | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:37

Thêm vào BST

Báo xấu

54
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Di truyền là đặc tính chung của mọi sinh vật giữ lại những và truyền cho con cháu những đặc điểm về cấu tạo và phát triển của tổ tiên, hay nói cách khác, là hiện tượng các cá thể trong một gia đình có những thuộc tính cấu tạo và phát triển giống tổ tiên, với cha mẹ hoặc giữa con cái với nhau

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Di truyền học vi sinh vật

193 Chương 10 Di truyền học vi sinh vật Di truyền là đặc tính chung của mọi sinh vật giữ lại những và truyền cho con cháu những đặc điểm về cấu tạo và phát triển của tổ tiên, hay nói cách khác, là hiện tượng các cá thể trong một gia đình có những thuộc tính cấu tạo và phát triển giống tổ tiên, với cha mẹ hoặc giữa con cái với nhau. Biến dị là đặc tính chung của mọi sinh vật có thể mang những sự khác biệt về nhiều chi tiết tính trạng so với bố mẹ của chúng và với các cá thể khác cùng loài. Đối tượng nghiên cứu của di truyền học không chỉ là hiện tượng di truyền mà cả hiện tượng biến dị. Tính biến dị có vẻ như độc lập với tính di truyền nhưng thực ra sự khác biệt giữa các cá thể trong một loài trong nhiều trường hợp liên quan đến sự biến đổi hoặc trong trường hợp khác đến sự phản ứng của vật chất di truyền của sinh vật. Ở vi sinh vật biến dị thể hiện ở mức độ lớn hơn ở vi sinh vật bậc cao nhờ số cá thể trong một quần thể lớn, đơn allele, sinh sản đồng loạt, giai đoạn sinh dưỡng ngắn, tần số đột biến và tái tổ hợp cao và có khả năng trao đổi di truyền ngoài loài. Dù cơ chế xuất hiện khác nhau nhưng ở phần lớn các trường hợp biến dị đều tạo ra những dòng hay tập đoàn có sự thích ứng tốt nhất với điều kiện ngoại cảnh vốn luôn biến động. I. Cơ sở vật chất di truyền ở vi sinh vật 1. Vật chất di truyền ở vi khuẩn Acid nucleic là cơ sở vật chất di truyền của tất cả các dạng sinh vật. Ở tất cả các sinh vật nhân sơ (prokaryote, còn gọi là sinh vật nhân sơ sơ, bao gồm các vi khuẩn) hay nhân chuẩn (eukaryote, còn gọi là sinh vật nhân chuẩn, bao gồm nấm, tức chân khuẩn, nguyên sinh động vật, tảo, thực vật và động vật bậc cao), trừ virus và các yếu tố sinh học đơn giản hơn như viroid và prion, tính trạng được mã hóa và tồn trữ dưới dạng mã hóa là trình tự thẳng của các nucleotide trong thành phần acid deoxyribonucleic (DNA). Vật chất di truyền này được thể hiện thành tính trạng của cá thể thông qua quá trình tổng hợp từ khuôn DNA thành phân tử RNA thông tin (quá trình phiên mã) và sau đó RNA thông tin này lại làm khuôn để tổng hợp protein (cấu trúc, enzyme, thụ thể, kích thích, kìm hãm,...) trong quá trình gọi là dịch mã (transcription) dẫn đến biểu hiện tính trạng. Vật chất di truyền được truyền từ thế hệ tế bào này sang thế hệ tế bào khác (và từ thế hệ này sang thế hệ khác) nhờ quá trình tự sao
194 (replication) của phân tử DNA. Quy tắc này được gọi là quy tắc trung tâm biểu hiện di truyền. Ở vi khuẩn DNA có thể gặp ở hai dạng: DNA nhiễm sắc thể và DNA plasmid. Nhân (thể nhân) vi khuẩn là một nhiễm sắc thể vi khuẩn cấu tạo từ một phân tử DNA duy nhất xoắn kép (gồm hai mạch xoắn), khép kín (không có đầu tự do), phân bố trong tế bào chất. Mỗi tế bào vi khuẩn chỉ có một nhân (thể nhân) duy nhất, mặc dù trước khi phân bào số lượng nhân (nhiễm sắc thể) thường thấy là 2, 4 hoặc nhiều hơn do quá trình phân bào diễn ra chậm hơn quá trình phân nhân. Vì vậy, thông thường nhiễm sắc thể được mô hình hóa trong tế bào vi khuẩn dưới dạng một vòng tròn. Hình 10.1: Mô hình cấu trúc một đoạn phân tử DNA: một dẫn xuất purine liên kết qua cầu nối hyđrô với một dẫn xuất pyrimidine nên khoảng cách giữa hai sườn đường ribose - Acid phosphoric của hai chuỗi là không đổi, guanine luôn kết hợp với cytosine, adenine kết hợp với thymine của chuỗi song đối nên trình tự hai chuỗi không bao giờ giống nhau nhưng trình tự một chuỗi quy định trình tự của chuỗi kia, hơn nữa các sườn có nhiều nhóm ái thủy nên DNA tan tốt trong nước.
195 Hai mạch xoắn của phân tử DNA thực chất là hai chuỗi polymer và có mối quan hệ chặt chẽ với nhau về thành phần hóa học cũng như trình tự sắp xếp của các monomer được gọi là một nucleotide. Mỗi chuỗi polymer được cấu tạo từ bốn loại monomer có cấu trúc tổng quát gồm ba thành phần: bazơ nitơ dị vòng (dẫn xuất purine hoặc pyrimidine), đường deoxyribose (C5) và Acid phosphoric. Ở DNA, có bốn loại nucleotide: adenine (A), thymine (T), guanine (G) và cytosine (C) (hay xitôzin). Các nucleotide khác nhau bởi gốc bazơ khác nhau. Chuỗi polymer của mỗi mạch (sợi) DNA được hình thành nhờ liên kết phosphoester giữa Acid phosphoric và đường deoxyribose tạo nên bộ "sườn" của phân tử ((-P-C5- )n). Còn các gốc bazơ nitơ gắn vào nguyên tử C 1' của phân tử đường deoxyribose. Phân tử Acid phosphoric trong một nucleotide gắn vào vị trí C 5' của phân tử đường deoxyribose, trong khi đó nguyên tử C 3' gắn với Acid phosphoric của nucleotide kế tiếp. Do trình tự hoạt động của các enzyme tổng hợp DNA từ đầu C 5' đến đầu C 3' của mỗi mạch DNA nên người ta quy ước mô tả mạch theo hướng C 5'→C 3'. Ví dụ, nếu không có chú giải khác thì mạch ATT CGC GCA TCA GCT cũng có nghĩa là 5'- ATT CGC GCA TCA GCT-3' hay 5'-ATT CGC GCA TCA GCT. Hai chuỗi của một phân tử DNA gắn kết với nhau nhờ các mối liên kết hyđrô giữa các gốc bazơ, một gốc purine được gắn kết với một gốc pyrimidine theo nguyên tắc "tương bù": adenine gắn với thymine bằng hai mối liên kết hyđrô, còn guanine gắn với cytosine bằng ba mối liên kết hyđrô. Hai chuỗi như vậy không đối xứng mà chạy ngược hướng (đối nghịch song song, hay song đối) từ 5'→3' hoặc ngược lại. Do một gốc purine của một chuỗi liên kết với một gốc pyrimidine của chuỗi kia nên khoảng cách giữa hai sườn (-P-C5-)n của phân tử DNA ở mọi điểm không đổi. Và nhờ vậy mà sườn này hướng ra phía ngoài và xoắn quanh trục tưởng tượng xuyên qua các lớp gốc bazơ nitơ vòng, nên với tính ái thủy của Acid phosphoric và đường deoxyribose, DNA là chất tan tốt trong nước và khá bền vững trong dung môi này. Do số lượng mối liên kết hyđrô giữa guanine (G) và cytosine (C) cao hơn nên DNA có nhiều G+C thường có mức nhiệt biến tính hay "nhiệt nóng chảy" (melting point) cao hơn hay bền vững hơn. Hơn nữa, bên cạnh cấu trúc xoắn phải (B-DNA) nêu trên, ở những vùng hàm lượng G+C cao DNA còn có cấu trúc xoắn trái (Z-DNA) là nơi DNA có sự gấp khúc mạnh và xuất hiện đoạn DNA xoắn chuỗi ba. Có thể những Z-DNA đóng vai trò quan trọng trong tái tổ hợp gen cũng như điều hòa hoạt động của gen. Một đoạn DNA mã hóa một RNA (như RNA ribosome, RNA vận chuyển) hay mã hóa một protein (qua RNA thông tin) được gọi là một gen. Gen mã hóa phân tử protein được gọi là gen cấu trúc. Ở vi khuẩn toàn bộ trình tự nucleotide gen cấu trúc được phiên mã thành RNA thông tin và sau đó dịch toàn bộ thành trình tự Acid amin trong phân tử protein.
196 Mặc dù được cấu tạo bởi hai chuỗi nhưng ở vi khuẩn (cũng như ở sinh vật nhân chuẩn) gen chỉ có một mạch "hiệu lực", tức chỉ một mạch làm khuôn tổng hợp nên RNA thông tin. Hiệp hội sinh hóa quốc tế quy ước chuỗi làm khuôn để tổng hợp nên RNA thông tin (hay tổng hợp RNA hoạt động, như RNA ribosome,...) là chuỗi âm. Như vậy, chuỗi dương của một gen là chuỗi có trình tự nucleotide tương đương với trình tự nucleotide của RNA thông tin. Ngoài ra, do một polypeptide được khởi đầu tổng hợp với Acid amin methionine (mã AUG trên RNA thông tin), kết thúc bởi một trong những "mã dừng" (UAA, UAG và UGA) và chỉ có thể có thuộc tính protein nếu đủ lớn (dài hơn 50 Acid amin), đồng thời, thông tin di truyền được giải đọc từng "khung" bộ ba nucleotide (tức ba nucleotide liền kề nhau mã hóa cho một Acid amin trong sản phẩm protein) nên chỉ có những đoạn DNA bắt đầu từ bộ ba ATG (theo cả ba cách đọc của mỗi chuỗi DNA) đến một mã dừng (TAA, TAG, TGA) đủ dài (hơn 150 nucleotide) mới có thể là (nhưng không nhất thiết phải là) một gen cấu trúc. Đoạn DNA này được gọi là một "khung khả phiên" (hay một "khung đọc mở" - open reading frame). Ngoài ra, không phải tất cả các đoạn DNA đều mang gen cấu trúc, chức năng của nhiều đoạn còn chưa biết, đồng thời còn có các đoạn DNA đặc biệt tham gia vào điều hòa hoạt động của các gen cấu trúc. Nhờ vậy, các tính trạng quy định trong genome chỉ biểu hiện trong điều kiện môi trường nhất định, đồng thời quá trình tổng hợp các cơ chất nguyên liệu cho quá trình tổng hợp các thành phần tế bào cũng diễn ra và đình chỉ một cách hiệu quả và tiết kiệm. Ở sinh vật nhân sơ các gen cấu trúc (các cistron) được gắn liền nhau thành tập hợp và cùng chịu sự kiểm soát của các gen điều hòa gồm gen (hay vùng) khởi động (promotor - P), gen (hay vùng) điều hành (operator - O, còn gọi là gen chỉ huy) và gen điều hòa (regulator - R). Gen điều hòa (R) nằm ở vị trí nào đó trong nhiễm sắc thể xa với các gen cấu trúc và điều khiển việc tổng hợp một protein đặc biệt có tác động (phong tỏa hoặc giải tỏa) trực tiếp hoặc gián tiếp lên các vùng P hoặc O. Cả tập hợp bao gồm các vùng khởi động, vùng điều hành và các gen cấu trúc tạo thành một đơn vị hoạt động gọi là operon. RNA gồm ba loại khác nhau: RNA ribosome là thành phần chủ yếu cấu tạo nên ribosome, có chức năng hoạt động như một enzyme tức xúc tác quá trình sinh tổng hợp protein. (Những RNA xúc tác phản ứng sinh học thường được gọi là ribozyme). RNA thông tin được sao chép từ chuỗi âm của gen có vai trò sao mã di truyền từ nhiễm sắc thể cho RNA ribosome giải mã thành phân tử protein có mạch polypeptide có thành phần và trình tự Acid amin xác định. Tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein còn có nhóm các RNA vận chuyển. Đây là những phân tử RNA tương đối ngắn có tác dụng hoạt hóa Acid amin nguyên liệu và vận
197 chuyển Acid amin này đến RNA thông tin cũng đã được hoạt hóa nhờ gắn kết với ribosome. Trình tự RNA thông tin quyết định trình tự Acid amin trong thành phần polypeptide, nhưng quá trình nhận biết trình tự Acid amin mã hóa trong RNA thông tin là nhờ RNA vận chuyển. Mỗi Acid amin được mã hóa bởi một bộ ba nucleotide trên RNA thông tin, và bộ ba này tương bù với trình tự bộ ba nucleotide nhận biết của RNA vận chuyển. Nhờ mỗi Acid amin có loại RNA vận chuyển riêng nên trình tự mã bộ ba được dịch một cách chính xác. Bảng 10.1 : Mã di truyền trên nhiễm sắc thể (biểu hiện trên mRNA, chiều 5' đến 3') Chữ thứ hai của mã Đầu U C A G 5' UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys U UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys C U UUA Leu UCA Ser UAA Stop UGA Stop A Chữ thứ nhất của mã (đầu 5') Chữ thứ ba của mã (đầu 3') UUG Leu UCG Ser UAG Stop UGG Trp G CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg U CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg C C CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg A CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg G AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser U AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser C A AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg A AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg G GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly U GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly C G GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly A GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly G Khác với DNA, các RNA đều cấu tạo chỉ từ một chuỗi nucleotide. Ngoài ra, trong thành phần của các RNA còn có những điểm khác biệt khác: uracine thay thế thymine, đường deoxyribose được thay thế bởi ribose trong sườn của mạch polymer cũng như sự có mặt một số bazơ dẫn xuất khác của purine và pyrimidine. Chính vì có thêm một gốc -OH ở vị trí C 2' (của đường ribose) mà cầu nối phosphoester giữa nguyên tử C 3' và Acid phosphoric của nucleotide tiếp theo thường yếu hơn so với cầu nối C 3' với Acid phosphoric trong DNA. RNA, vì vậy, cũng kém bền vững hơn DNA. Tuy cấu tạo từ chỉ một chuỗi nucleotide nhưng cấu trúc không gian của các loại RNA lại ổn định nên chức năng của chúng cũng ổn định. Tính ổn định của cấu trúc có được nhờ các mối liên kết hyđrô xuất hiện giữa hai đoạn trình tự tương bù ngược hướng của cùng chuỗi nucleotide. Hai đoạn có trình tự tương bù ngược hướng tạo thành một đoạn xoắn kép,
198 trong khi đoạn nucleotide nằm giữa chúng hình thành một "thòng lọng" mạch đơn. Vì vậy, chẳng hạn, các phân tử RNA vận chuyển có dạng "lá ba chẽ" với chức năng đặc hiệu. Bên cạnh DNA nhiễm sắc thể ở vi khuẩn còn có thể gặp cơ sở vật chất di truyền ngoài nhiễm sắc thể gọi là plasmid. Về bản chất hóa học, plasmid cũng là một phân tử DNA xoắn kép, khép kín, nhưng có phân tử lượng thấp hơn nhiều (khoảng 106 - 108 Dalton, hay khoảng 1/100 đến 1/200 lần nhiễm sắc thể vi khuẩn). Một vi khuẩn có thể không mang, hoặc mang một hoặc một số plasmid. Plasmid có thể phân bố trong tế bào chất ở trạng thái tự do và có thể sao chép một cách độc lập với nhiễm sắc thể hoặc nằm trong nhiễm sắc thể (tái tổ hợp), khi đó plasmid được gọi là episome. Ở trạng thái tái tổ hợp trong nhiễm sắc thể (hay episome) plasmid thường được sao chép đồng thời với nhiễm sắc thể và được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác của vi khuẩn. Tuy vậy, trong nhiều trường hợp (như chủng Hfr) plasmid tái tổ hợp lại có thể điều khiển sao chép độc lập, làm cho bản thân plasmid hoặc một đoạn plasmid kèm theo một đoạn DNA nhiễm sắc thể được tổng hợp đồng loạt với tần suất cao. Có loại plasmid có số phiên bản cao (high-copy plasmid), trong khi đó có loại plasmid có số phiên bản thấp (low-copy plasmid). Hình 10.2: Bản đồ enzyme hạn chế của plasmid pBR322, là một plasmid được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Plasmid cải biến nhân tạo này mang hai gen kháng thuốc (tetR đề kháng tetracycline và ampR đề kháng ampicillin) và một loạt vị trí cắt của enzyme hạn chế trong đó mỗi enzyme này chỉ có một vị trí phân cắt, nhờ vậy plasmid vector này áp dụng được với nhiều DNA khác nhau.
199 Thêm hoặc mất một plasmid thường dẫn đến mất hoặc bớt một hoặc một số tính trạng, mặc dù nhiều plasmid không thể hiện tính trạng (plasmid "câm"). Tính trạng mà các plasmid điều khiển đa dạng nhưng nhìn chung plasmid không phải là yếu tố thiết yếu đối với sự sống còn của vi khuẩn. Dựa vào sự tương hợp của các sản phẩm của plasmid mà người ta chia các plasmid thành một số nhóm: plasmid giới tính, plasmid đề kháng, plasmid điều khiển sinh tổng hợp (nhóm chất nào đó),... và thường liên quan đến tính gây bệnh của các vi khuẩn. Ví dụ, đã xác định được rằng một số loài (hoặc còn được coi là dạng huyết thanh học) vi khuẩn Salmonella có được độc tính nhờ mang plasmid. Bảng10.2 : Plasmid độc tính đặc hiệu một số loài (dạng huyết thanh) Salmonella Độ lớn (kb) Biểu hiện tính gây bệnh chủ yếu Salmonella 90 Độc tính gây chết, giảm thiểu tính thẩm thấu S. typhimurium của các chất kỵ thủy Độc tính gây chết, tính đề kháng huyết thanh, 75 S. dublin năng lực tăng trưởng trong tế bào hệ lưới nội bì 75 Giống như plasmid ở S. dublin ( hay serovar S. naestved Dublin) 54 Độc tính gây chết S. enteritidis 50 Độc tính gây chết, gây chứng máu nhiễm S. choleraesuis khuẩn ở chuột S. gallinarum- 85 Độc tính gây chết pullorum Plasmid giới tính còn gọi là yếu tố sinh dục hay yếu tố F (fertility factor), là plasmid điều khiển sự hình thành các pili giới tính (nhung mao giới tính), sự tiếp hợp và sự vận chuyển thông tin di truyền (gen plasmid hay gen nhiễm sắc thể) một chiều từ tế bào cho sang tế bào nhận. Trong trường hợp này tế bào mang plasmid F là tế bào cho thường được gọi là tế bào đực hay tế bào F+, còn tế bào nhận được gọi là tế bào cái hay tế bào F-. Yếu tố F có thể nằm ở trạng thái tự do trong tế bào chất hay ở trạng thái liên kết với nhiễm sắc thể hay trạng thái episome. Trong trường hợp sau quá trình vận chuyển thông tin di truyền thường diễn ra với tốc độ và tần suất cao nên những chủng vi khuẩn này thường được gọi là chủng Hfr (bắt nguồn từ tiếng Anh: high frequency of recombination). Yếu tố đề kháng, hay yếu tố kháng thuốc, hay plasmid R (resistance factor), là plasmid điều khiển sự đề kháng của vi khuẩn đối với các chất kháng sinh và thuốc chống vi khuẩn khác. Cơ chế đề kháng này là sự điều khiển việc tổng hợp các enzyme (như penicillinase,...) phân
200 hủy thuốc kháng sinh thành các sản phẩm vô hoạt hoặc ức chế sự xâm nhập của thuốc kháng sinh vào tế bào (như chặn các lỗ khổng trên màng tế bào chất đối với tetracycline hoặc thuốc kháng sinh họ macrolide,...). Yếu tố R lan truyền được (transmissible R factor) là yếu tố F kháng thuốc, gồm hai miền gen. Một miền gen điều khiển sự đề kháng. Số lượng yếu tố bị đề kháng có thể là 1 đến 10 hoặc nhiều hơn nữa, trường hợp sau thường gọi là plasmid đề kháng đồng loạt. Miền gen thứ hai (miền RTF) là gen điều khiển sự vận chuyển các plasmid vào tế bào khác. Thông thường sự vận chuyển các plasmid này có tốc độ cao, nhưng yếu tố vận chuyển cũng có thể tự ức chế hoặc bị ức chế bởi yếu tố khác. Yếu tố R không lan truyền được (non-transmissible R factor) chỉ mang miền gen điều khiển tính đề kháng. Các plasmid này không tự vận chuyển sang tế bào khác mà chỉ làm cho tế bào mang chúng có tính đề kháng thuốc kháng sinh. Chúng có thể tồn tại và phổ biến trong quần thể vi khuẩn nhờ quá trình sinh sản của vi khuẩn hoặc nhờ các quá trình vận chuyển vật chất di truyền qua dịch thể tức quá trình biến nạp (transformation) hoặc sự vận chuyển của virus của vi khuẩn (phage, hay thực khuẩn thể) tức nhờ quá trình tải nạp (transduction). 2. Vật chất di truyền ở virus Khác với các sinh vật khác, virus chỉ mang một trong hai loại Acid nucleic (hoặc DNA hoặc RNA), có loại virus mang genome dưới dạng DNA (tương tự genome của vi khuẩn, động vật và thực vật) nhưng có loại lại mang genome dưới dạng RNA. Hầu hết các virus thực vật có genome RNA, còn hầu hết virus của vi khuẩn có genome DNA, trong khi các virus động vật có genome hoặc loại này hay loại khác. Cũng như bản chất hóa học, cấu trúc genome của virus rất đa dạng, có loại virus mang DNA một sợi (chuỗi) âm hoặc dương, có loại DNA hai sợi, có loại mang RNA một sợi âm hoặc dương hoặc lưỡng nghĩa (ambisense RNA: có đoạn âm có đoạn dương, hay đồng thời với khung khả phiên một gen cấu trúc còn mang khuôn của một khung khả phiên một gen khác ngược hướng). Genome nhiều virus là một sợi acid nucleic duy nhất nhưng cũng có loại virus genome bao gồm một số đoạn. Thông tin di truyền trên genome của virus cũng có sự khác biệt khác so với genome vi khuẩn. Đó là hiện tượng gen chồng lặp (overlapping genes): có thể có hai RNA thông tin khác nhau được sao chép từ một đoạn genome. Dưới đây trình bày ngắn gọn về cấu trúc genome một số virus. Genome các virus thuộc chi Parvovirus là virus chứa DNA một sợi âm nhưng cũng thấy khoảng 1 - 50% số virion chứa DNA một sợi dương. Ở các chi Dependovirus và Densovirus thì số lượng virion chứa
201 DNA chuỗi âm và virion chứa DNA chuỗi dương tương bù về căn bản tương đương nhau. Genome của các Adenovirus (họ Adenoviridae) là một phân tử DNA 2 sợi chuỗi thẳng. Genome các virus họ Papillomaviridae là một phân tử DNA hai sợi chuỗi vòng khép kín, phân tử lượng khoảng 5 kbp . Genome của các baculovirus (họ Baculoviridae) rất lớn, tương đương genome của các tế bào côn trùng, là một phân tử DNA duy nhất hai sợi, trong đó có chứa một gen cho tiểu đơn vị lớn của enzyme ribonucleotide reductase (RR1). Genome của các hepadnavirus (họ Hepadnaviridae) là một phân tử DNA mạch vòng, có vùng gồm 2 sợi, có vùng chỉ một sợi. Sợi DNA âm là sợi đầy đủ, có chiều dài toàn bộ là 3,0 - 3,2 kb có khấc (nick) đặc hiệu ở một số chỗ. Còn sợi DNA dương thì có độ dài không hoàn toàn và không ổn định, thường từ 1,7 đến 2,8 kb. Genome của các orthomyxovirus (họ Orthomyxoviridae) là RNA một sợi gồm 8 phân đoạn (riêng virus cúm C có 7 phân đoạn). Các bunyavirus (họ Bunyaviridae) có genome gồm 3 phân tử RNA một sợi âm có kích thước khác nhau (gọi là các RNA L, M và S). Riêng RNA S của chi Phlebovirus có một đoạn có cơ năng của sợi dương, nên thường gọi "RNA lưỡng nghĩa (ambisense RNA"). Genome các arenavirus (họ Arenaviridae) có 2 phân tử RNA một sợi. Ngoài ra, bên trong virion còn có các RNA 28 S, 18 S, 4 - 6 S có nguồn gốc từ tế bào ký chủ. Các RNA 4 - 6 S chứa RNA thông tin dưới genome (subgenomic mRNA) mã hóa protein Z có thể là nhân tố điều tiết sao chép. RNA genome cũng lưỡng nghĩa (ambisense). Genome picornavirus (họ Picornaviridae) cấu tạo từ 1 phân tử RNA một sợi dương chuỗi thẳng, phân tử lượng 2,4 - 2,7 x 106 (khoảng 7,5 - 8,5 kb), có chuỗi poly-A ở đầu 3', còn đầu 5' kết hợp cộng hóa trị với phân tử protein VPg có phân tử lượng khoảng 2.400 Da. Genome của các birnavirus (họ Birnaviridae) là phân tử RNA hai sợi, gồm hai đoạn (đoạn A có kích thước 3,1 kbp và đoạn B 2,9 kbp). 3. Vật chất di truyền ở vi sinh vật nhân chuẩn Ở vi sinh vật nhân chuẩn (eukaryote) vật chất di truyền cũng có bản chất hóa học là acid nucleic DNA, RNA. Chức năng hai loại acid này tương tự ở tế bào nhân sơ. DNA mang mật mã thông tin di truyền trong khi RNA tham gia chuyển hóa mật mã này thành protein mà thể
202 hiện tính trạng. Quá trình tự sao chép DNA cũng là cơ sở di truyền từ thế hệ tế bào này sang thế hệ tế bào khác hay thế hệ này sang thế hệ khác. Điểm khác biệt lớn giữa sinh vật nhân chuẩn và sinh vật nhân sơ là nhân chuẩn có màng nhân và genome thường gồm hai bộ (lưỡng bội) hoặc đôi khi nhiều hơn nhiễm sắc thể (ở thực vật: tam bội, tứ bội, đa bội) cũng cấu tạo từ DNA xoắn kép nhưng không khép kín (có đầu tự do). Tuy nhiên ở nhiều nấm và thực vật còn tồn tại chu trình đơn bội, khi đó trong tế bào nhân chỉ chứa một bộ nhiễm sắc thể. Thể đơn bội này ở nhiều nấm tồn tại song song với thể lưỡng bội và dạng tế bào song nhân có hai nhân đơn bội riêng rẽ. Ở các nấm chuyển hình hoàn toàn (holomorphous fungi) thể lưỡng bội thường là điểm khởi đầu của sự hình thành cơ quan sinh bào tử hữu tính từ đó sản sinh các bào tử đơn bội. Còn ở các nấm chuyển hình không hoàn toàn (imperfect fungi) không có giai đoạn lưỡng bội. Điểm khác biệt nữa là, DNA nhiễm sắc thể nhân chuẩn còn quấn quanh các phân tử protein histone. Tổ chức gen sinh vật nhân chuẩn còn có sự khác biệt khác so với sinh vật nhân sơ. Gen cấu trúc bao gồm nhiều đoạn và chỉ một số đoạn mã hóa cấu trúc protein. Trong quá trình phiên mã, gen trên nhiễm sắc thể được sao chép thành RNA thông tin sơ cấp trong nhân tế bào nhưng để trở thành RNA thông tin thành thục đặc hiệu thì RNA phải trải qua quá trình biến đổi. Một số đoạn của RNA thông tin sơ cấp bị cắt bỏ khỏi đoạn RNA thông tin (trong quá trình gọi là splicing - "cắt xén", hay "tách ghép"), đồng thời đầu 5' được methyl hóa, còn đầu 3' được bổ sung đoạn dài adenine (poly-A). Methyl hóa đầu 5' làm cho RNA thông tin có thể nhận biết đối với ribosome, còn quá trình poly-A hóa RNA thông tin góp phần đẩy RNA này ra khỏi lỗ khổng màng nhân mà đi vào tế bào chất. Phần gen tương ứng phần còn lại của RNA thông tin thành thục là phần được biểu hiện thành tính trạng nên được gọi là exon, phần bị cắt bỏ gọi là intron. Đoạn DNA mã hóa RNA thông tin sơ cấp được gọi là một đơn vị gen. Cấu trúc gen không liên tục này đóng vai trò quan trọng đối với sự biệt hóa tổ chức trong quá trình sinh trưởng của cá thể. Ngoại lệ có thể gặp là gen histone và interferon không có intron. (Ngoài ra, genome nhiễm sắc thể ở động vật bậc cao còn có trình tự lặp giàu G+C ở đầu nhiễm sắc thể, gọi là telomer, thường bị ngắn dần sau mỗi lần phân bào do đoạn RNA mồi không được tổng hợp bù đắp bằng DNA, có thể liên quan đến quá trình lão hóa của cơ thể). Bên cạnh genome nhiễm sắc thể (ở trong nhân), ở các eukaryote còn có hệ thống tín hiệu di truyền khác là DNA trong các ty thể và lạp thể. Bộ gen này điều khiển sự tổng hợp một số protein của các cơ quan này và có bản chất tương tự bộ gen ở sinh vật nhân sơ (DNA cũng có cấu tạo mạch xoắn kép, khép kín) nhưng được cắt bớt đi nhiều. Ở sinh vật
203 sinh sản hữu tính (hợp tử hình thành từ giao tử đực và giao tử cái) bộ gen này ở mọi cá thể đều có nguồn gốc từ mẹ do trong quá trình thụ tinh giao tử đực không truyền được các ty thể (và lạp thể ở thực vật) vào giao tử cái. Genome của các tiểu cơ quan (ty thể và lạp thể) được phiên mã thành RNA thông tin tương ứng với quá trình diễn ra tương tự ở tế bào nhân sơ. Gen nhảy (transposon) là đoạn DNA đặc biệt gặp cả ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn, không có vị trí ổn định trong nhiễm sắc thể. Đoạn này có thể tách rời khỏi vị trí vốn có của nó và di chuyển đến một vị trí khác của cùng nhiễm sắc thể hoặc sang nhiễm sắc thể khác. Tuy không phải là gen cấu trúc nhưng transposon ảnh hưởng rất lớn đến quá trình biểu hiện tính trạng. Nó có thể khống chế hoặc giải phóng một gen cấu trúc nào đó dẫn đến việc mất tính trạng hoặc xuất hiện tính trạng quy định bởi gen đó. Quá trình khống chế có thể diễn ra khi một gen nhảy chèn vào khoảng giữa gen khởi động (promoter) và gen cấu trúc cũng như chèn vào giữa gen cấu trúc làm cho quá trình phiên mã không thể khởi động hoặc bị gián đoạn. II. Di truyền và biểu hiện tính trạng 1. Tự sao hay tái tạo DNA (replication) Quá trình tổng hợp DNA trong nhân tế bào gắn chặt chẽ với quá trình bão toàn và truyền đạt thông tin di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Nguyên lý bổ sung các bazơ trong chuỗi xoắn kép DNA đáp ứng quá trình nhân đôi và tái bản chính xác trình tự các bazơ trong phân tử gốc hay DNA khuôn. Trong quá trình tái tạo DNA, phân tử này được tách đôi thành hai mạch đơn. Mỗi mạch đơn của DNA gốc được dùng để làm khuôn tổng hợp một mạch mới có các nucleotide liên kết hyđrô tương bù với các nucleotide của chuỗi gốc. Phân tử DNA, như vậy, có một chuỗi là chuỗi gốc còn chuỗi thứ hai hoàn toàn được tổng hợp mới. Do đó, cơ chế tự sao DNA là cơ chế bán bão toàn. Đây là quá trình phức tạp có sự tham gia của nhiều enzyme và protein khác nhau. Đặc biệt ở DNA sinh vật nhân sơ, do DNA xoắn kép, khép kín nên hai sợi phải xoắn bện và lồng vào nhau không thể tách rời nên quá trình tự sao DNA lại càng phức tạp và có sự tham gia của nhiều yếu tố. Vị trí bắt đầu quá trình tái bản DNA được gọi là điểm khởi đầu tái bản, vùng có mạch gốc được tách đôi gọi là chạc tái bản. Sự phát sinh một chạc tái bản từ điểm khởi đầu được gọi là sự khởi đầu tái bản. Khi khởi đầu tái bản enzyme topoizomerase (tức gyrase) có chức năng cắt đứt một sợi của chuỗi DNA và khôi phục sợi này lại nhanh chóng làm cho DNA xoắn kép có thể tách đôi được mà vẫn giữ nguyên cấu trúc. Quá trình tháo duỗi xoắn của chuỗi đôi thành chuỗi đơn có sự tham gia của enzyme helicase. Đoạn mạch đơn duy trì được độ
204 căng của nó là nhờ các enzyme đặc biệt gọi là các protein liên kết DNA mạch đơn (ssDNA binding protein). Trong tế bào các nucleotide nguyên liệu được tổng hợp sẵn dưới dạng các phân tử cao năng nucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP và dCTP). Các nucleotide này không thể tự liên kết vào chuỗi DNA một sợi dù thỏa mãn tính tương bù mà phải còn cần có một oligonucleotide (tức một đoạn Acid nucleic mạch đơn) gọi là mồi (primer) gắn kết một cách tương bù với đoạn DNA một sợi đã được duỗi sẵn. Đoạn oligonucleotide mồi này thường là một đoạn RNA ngắn được enzyme primase xúc tác tổng hợp trực tiếp trên khuôn DNA và sau đó cung cấp đầu 3'-OH cho một nucleotide nguyên liệu lắp ráp vào. Nhờ đó, mạch của chạc tái bản luôn duy trì được đầu 3'-OH để từ đó một nucleotide mới khác lắp ráp vào. Quá trình lắp ráp tiếp diễn dưới sự xúc tác của enzyme DNA-polymerase III. Mồi RNA sau đó được phân hủy khỏi DNA khuôn và chỗ trống này được lấp đầy nhờ enzyme DNA- polymerase I. Quá trình tổng hợp DNA từ chạc tái bản, như vậy, tiếp diễn nhờ nối dài đầu 3'-OH của mỗi mạch mới theo hướng 3'→5'của sợi khuôn. Chính vì vậy, quá trình tổng hợp DNA trên một sợi khuôn là liên tục, còn trên sợi kia (sợi đối nghịch song song với sợi trước) quá trình tổng hợp lại diễn ra gián đoạn, trong khi chạc tái bản chuyển động liên tục về một hướng. Mạch có sự lắp ráp liên tục gọi là mạch tiến còn trên mạch kia sự tổng hợp lại diễn ra theo hướng ngược với chiều chuyển động của chạc tái bản gọi là mạch lùi hay mạch gián đoạn. Một khi đoạn khuôn mới được mở ra thì trên mạch lùi này lại diễn ra sự tổng hợp một mồi mới nhờ enzyme primase, rồi từ mồi này quá trình lắp ráp các nucleotide tương bù với trình tự của mạch khuôn lại diễn ra. Sau đó nhờ tác dụng endonuclease của enzyme DNA-polymerase I mà mồi bị loại bỏ, và cũng dưới sự xúc tác của enzyme này chỗ trống được lấp bởi sự lắp ráp các deoxyribonucleotide. Những đoạn mạch này được gọi là đoạn Okazaki (gọi theo tên người phát hiện). Mối liên kết giữa các đoạn Okazaki được kết nối sau đó nhờ enzyme ligase. Các protein trong tập hợp các protein tham gia quá trình tái bản DNA gọi là replisome. Nhờ hệ thống này mà quá trình tái bản DNA diễn ra với tốc độ cao (ở E. coli khoảng 30000 - 50000 đôi nucleotide trong một giây). Ở sinh vật nhân chuẩn quá trình tự sao DNA diễn ra theo quá trình tương tự nhưng cơ chế có thể phức tạp hơn và còn nhiều điểm chưa rõ. DNA nhiễm sắc thể tế bào nhân chuẩn rất dài và sự khởi đầu tái bản có thể đồng thời từ nhiều điểm khởi đầu tái bản và thường diễn ra theo cả hai chiều. Đoạn DNA giữa hai điểm khởi đầu tái bản được gọi là đơn vị tái bản. Trung bình độ dài một đơn vị tái bản đến 40000 bp. Khi bắt đầu tái bản từ điểm khởi đầu tái bản, enzyme topoisomerase cắt DNA ở một sợi và nhanh chóng khôi phục khía đứt để chuỗi siêu xoắn kép được tháo xoắn và duỗi thẳng. Enzyme DNA-helicase tham gia vào tháo duỗi xoắn
205 của chuỗi kép để tạo mạch đơn. Bên cạnh các DNA-polymerase, topoisomerase, helicase và primase, trong tổ hợp replisome của tế bào nhân chuẩn còn có các protein khác gọi là các yếu tố tái bản A, B, và C,... (RFA, RFB, RFC,...) cũng như kháng nguyên hoạt hóa nhân tế bào (PCNA). Cũng đã phát hiện được bốn loại DNA-polymerase khác nhau, ký hiệu theo độ lớn của phân tử lượng là α, β, γ, và δ. DNA-polymerase α, β và δ phát hiện thấy trong nhân tế bào còn DNA-polymerase γ thì chỉ phát hiện trong các ty thể và lạp thể. Quá trình tái bản DNA nhân chuẩn trên chạc tái bản diễn ra tương tự ở tế bào vi khuẩn. DNA-polymerase δ hoạt động tương đương DNA-polymerase III ở vi khuẩn: xúc tác kéo dài quá trình lắp ráp. Sự khởi đầu mỗi đoạn tái bản cũng do enzyme primase đảm nhận, nó tổng hợp một đoạn RNA trên khuôn DNA chuỗi đơn và nhờ đó cung cấp đoạn chuỗi đôi cho DNA-polymerase nhận biết và đầu 3'-OH cần thiết cho quá trình lắp ráp. Enzyme này xúc tác quá trình lắp ráp trên cả mạch tiến (mạch liên tục) lẫn mạch lùi (mạch gián đoạn). Tương tự DNA-polymerase I ở vi khuẩn, ở mạch lùi quá trình khử bỏ các RNA mồi và lấp chỗ trống của mồi bởi deoxyribonucleotide do DNA- polymerase α đảm nhận. (Vai trò của hai DNA-polymerase khác còn chưa rõ). Cuối cùng vết khấc giữa các đoạn Okazaki cũng được kết nối nhờ sự xúc tác của enzyme ligase. Tốc độ tái bản DNA phụ thuộc vào tốc độ làm việc của các hệ thống tái bản trên mạch lùi vì quá trình tái bản trên mạch này thường chậm trễ so với mạch tiến. Bên cạnh cơ chế tái bản phụ thuộc primase tạo mồi (ở sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn) nêu trên còn có cơ chế tái bản DNA khác gọi là cơ chế tái bản theo vòng lăn thường thấy ở plasmid và có thể diễn ra ở nhiễm sắc thể vi khuẩn cũng như nhiễm sắc thể sinh vật nhân chuẩn. Ở plasmid hoặc vi khuẩn, chẳng hạn, từ một điểm cắt bởi enzyme endonuclease trên một sợi hình thành đầu 3'-OH và đầu 5'-P. Đầu 5'-P tách dần ra khỏi vòng và được tổng hợp gián đoạn (có sự tham gia của primase), còn đầu 3'-OH được DNA-polymerase nhận biết và xúc tác quá trình lắp ráp không cần mồi RNA. Ở sinh vật nhân chuẩn tái bản kiểu vòng lăn diễn ra trong trường hợp khuyếch đại gen. Khi đó một mạch đơn của đoạn gen này bị cắt tại một điểm, tách ra rồi vòng lại, đầu 3'-OH hoạt động như một mồi cho DNA-polymerase tổng hợp liên tục nhiều vòng đoạn nhiễm sắc thể này. Kết quả là sau lần tái bản DNA tiếp theo số phiên bản của gen tăng cao trong thành phần của nhiễm sắc thể. Ở các virus RNA, quá trình tự sao genome có cơ chế đa dạng tùy thuộc loại virus DNA một sợi hay hai sợi, virus RNA một sợi hay hai sợi, hay virus có quá trình phiên ngược (hepadnavirus và retrovirus). Còn các virus DNA hai sợi, nhìn chung, có quá trình sao chép tương tự ở prokaryote và eukaryote. Ở virus DNA có genome chuỗi thẳng có cấu
206 trúc kẹp tóc (hair pin) ở đầu quá trình tái bản DNA có thể theo cơ chế tái bản theo vòng lăn. Các virus RNA hai sợi cũng có quá trình tương tự ở DNA hai sợi nhưng diễn ra trong tế bào chất tế bào ký chủ với sự xúc tác của enzyme RNA-polymerase phụ thuộc RNA và sự sao chép RNA không cần đến đoạn mồi oligonucleotide. Ở các virus một sợi (DNA hoặc RNA), quá trình tái bản genome đều thông qua dạng tái tạo (replicative form) là dạng Acid nucleic (NA) hai sợi gồm một sợi NA virus và một sợi NA tương bù được tổng hợp trong tế bào ký chủ (nhưng không có trong thành phần virion). Sợi tương bù tiếp tục làm khuôn để tổng hợp đồng loạt các sợi NA virus. Trường hợp cá biệt xảy ra với các virus thuộc họ Hepadnaviridae và họ Retroviridae. Genome hepadnavirus gồm DNA hai sợi mạch vòng, sợi âm có cấu trúc khá đầy đủ nhưng có một điểm khuyết thiếu (khấc) đặc hiệu chi, còn sợi dương có độ dài không hoàn toàn và không ổn định. Nhờ DNA-polymerase sẵn có trong virion, sợi dương không hoàn toàn được tổng hợp thành sợi dương hoàn toàn (để tổng hợp RNA thông tin). Còn sợi âm làm khuôn tổng hợp sợi RNA dương. Sau đó, nhờ sự xúc tác của enzyme RT (enzyme phiên ngược - reverse transcriptase), hàng loạt sợi DNA âm của virus được tổng hợp từ khuôn là sợi RNA dương. Những sợi DNA âm này lại làm khuôn để tổng hợp DNA dương nhưng quá trình này chưa kịp hoàn thiện thì DNA hai sợi này bị nhồi vào vỏ capsid cũng đồng thời hình thành. Ở các retrovirus, genome là phân tử RNA gồm hai đoạn có đầu 5' giống nhau. Dưới tác dụng của enzyme RT và mồi là RNA vận chuyển chuỗi DNA âm tương bù được tổng hợp. Sau khi chuỗi RNA bị phân giải sợi DNA âm được dùng làm khuôn để tổng hợp sợi DNA dương tương bù. Cấu trúc DNA hai sợi này có các đoạn dài trình tự lặp ở đầu cực (LTR - long terminal repeat). Nhờ LTR này mà sau khi di nhập vào nhân DNA retrovirus tái tổ hợp vào DNA nhiễm sắc thể tế bào ký chủ (trở thành tiền virus - provirus). Provirus nhờ tín hiệu sao chép trong LTR dưới tác dụng của RNA-polymerase của ký chủ mà tổng hợp RNA genome virus (đồng thời với việc tổng hợp các RNA thông tin có kích thước khác nhau). 2. Phiên mã (Transcription) Phiên mã là quá trình sao chép trình tự nucleotide trên DNA gen cấu trúc thành trình tự nucleotide trên RNA thông tin (mRNA). Thông tin di truyền trên DNA như vậy được truyền đạt sang hệ thống tổng hợp các yếu tố hình thành tính trạng. Quá trình này thường diễn ra trên chạc tái bản DNA nên khi hoàn thành quá trình tự sao DNA thì tế bào cũng đã chuẩn bị sẵn lượng lớn RNA thông tin cần thiết. Đồng thời, trên một khuôn DNA có nhiều RNA thông tin được tổng hợp. Về nguyên lý tổng
207 hợp RNA thông tin cũng theo nguyên tắc tương bù nucleotide. Một adenyl ribonucleoside triphosphate sẽ tìm đến lắp ráp tương bù với thymine trên khuôn DNA. Các ribonucleoside triphosphate khác cũng hoạt động tương tự: A bù T, C bù G, G bù C nhưng uracyl ribonucleoside triphosphate thay thế thymyl ribonucleoside triphosphate gắn kết tương bù với adenine trên khuôn DNA. Quá trình phiên mã được xúc tác bởi enzyme RNA-polymerase và không cần có sự tham gia của mồi. Quá trình phiên mã diễn ra trong bốn giai đoạn: sự nhận biết đoạn khởi đầu, mở đầu sự hình thành chuỗi, kéo dài chuỗi và kết thúc. RNA- polymerase ở vi khuẩn gồm bốn tiểu phần: hai tiểu phần giống nhau α và hai tiểu phần khác β và β1. Enzyme nhận biết được điểm khởi đầu khi có yếu tố σ. Đoạn khởi đầu có trật tự nucleotide giàu A và T nên thường gọi là trình tự ATAT (hay miền ATAT) là một vùng của miền khởi động (promoter) trong cấu trúc operon (gồm các đoạn gen cấu trúc với các gen điều hòa (R) và gen điều hành (O) phân bố trước chúng). Gắn vào điểm khởi đầu phiên mã, RNA-polymerase định hướng tới đúng chỗ bắt đầu tổng hợp RNA. Ở điểm bắt đầu quá trình lắp ráp một ribonucleoside triphosphate tương bù được lắp vào. Sau đó RNA-polymerase tiếp tục trượt dọc theo khuôn (chuỗi đơn) DNA, nhờ đó các ribonucleoside triphosphate tương bù tiếp theo cũng được lắp vào chuỗi RNA. Hướng kéo dài của mạch luôn là 5'→3'. Khi chạy đến vùng kết thúc, RNA- polymerase được tác động với yếu tố ρ, và xảy ra quá trình kết thúc phiên mã: cả RNA-polymerase lẫn chuỗi RNA được tách khỏi chuỗi DNA khuôn. Trong nhiều trường hợp vùng kết thúc phiên mã có cấu trúc đặc biệt và thường là vùng có cấu trúc lặp ngược hướng (palindrome) tạo nên cấu trúc thòng lọng hay cấu trúc uốn palindrome. Ở vi khuẩn có một loại RNA-polymerase. Enzyme này xúc tác tổng hợp cả ba loại RNA: RNA thông tin, RNA ribosome và RNA vận chuyển. Thông tin di truyền thường kết chuỗi thành một đơn vị phiên mã (operon): một số gen cấu trúc (cistron) được phân bố liên tiếp sau một đoạn gen khởi đầu phiên mã (tổ hợp R và O) và phiên mã cùng nhau thành một RNA thông tin đa cistron gồm một số RNA thông tin phân cách nhau bởi một đoạn trật tự nêm không mã hóa Acid amin gồm khoảng vài chục nucleotide. Ở sinh vật nhân chuẩn có ba loại RNA- polymerase I, II và III, theo trình tự tổng hợp RNA ribosome (I), RNA thông tin (II), các RNA vận chuyển và các RNA ribosome có phân tử lượng nhỏ (III). Các RNA thông tin ở sinh vật nhân sơ được sử dụng trực tiếp ngay trong quá trình phiên mã để tổng hợp protein trên bề mặt cấu trúc màng (màng tế bào chất, rất có thể là vùng mesosome), nhưng ở sinh vật nhân chuẩn thì RNA thông tin được tổng hợp trong nhân phải trải qua quá trình thành thục hóa (processing) gồm methyl hóa đầu 5' và poly-A
208 hóa đầu 3'-OH và cắt xén hay tách ghép (splicing: vùng intron của gen cấu trúc bị cắt khỏi RNA thông tin chỉ còn lại phần exon) để trở thành RNA thông tin thành thục hay RNA thông tin dịch mã. Sinh vật có cơ chế điều hòa quá trình phiên mã cũng như dịch mã, bảo đảm cho quá trình sử dụng thức ăn cũng như tổng hợp các hợp chất nguyên liệu đồng hóa một cách tiết kiệm. Ở vi khuẩn gen điều hòa I, chẳng hạn, tổng hợp protein điều hòa có mặt trong tế bào với liều lượng thấp có tác động bao vây vùng điều hành (O) gây ức chế sao mã các gen cấu trúc (điều hòa âm tính). Khi có mặt trong môi trường, yếu tố cảm ứng (như lactose đối với Lac operon) làm cho protein điều hòa thay đổi cấu trúc không gian, mất hoạt tính bao vây vùng O. Vùng O được giải tỏa cho phép RNA-polymerase nhận biết và xúc tác quá trình tổng hợp các RNA thông tin. Các gen cấu trúc trong tập hợp operon được phiên mã cùng nhau thành một RNA thông tin đa cistron, sau đó quá trình dịch mã thành các protein trên ribosome tiến hành theo từng đoạn ứng với các gen cấu trúc. Bên cạnh cơ chế điều hòa âm tính nêu trên, trong tế bào còn có cơ chế điều hòa dương tính. Khi đó chất giữ vai trò trọng yếu là adenosyl monophosphate vòng (cyclic AMP - cAMP) tác dụng gián tiếp qua protein đặc biệt có tên là CAP (catabolic gene activator protein) kết hợp với vị trí khởi động làm tăng ái lực của RNA-polymerase dẫn đến tăng cường quá trình phiên mã. Bên cạnh hai cơ chế cảm ứng đã nêu còn có cơ chế điều hòa khác: cơ chế kìm hãm. Cơ chất nguyên liệu được tổng hợp ra một cách dư thừa (ví dụ các Acid amin) tham gia vào tổ hợp kìm hãm vùng operator làm dừng quá trình phiên mã. 3. Dịch mã (translation) Dịch mã là quá trình tổng hợp mạch polypeptide ở ribosome trên cơ sở khuôn RNA thông tin. Trình tự đọc bộ ba nucleotide (hay khung đọc bộ ba - triplet reading frame) quyết định trình tự các Acid amin trong mạch polypeptide. Tham gia vào quá trình dịch mã là một hệ thống phức tạp: RNA thông tin (mRNA), ribosome và các Acid amin đã được hoạt hóa bởi RNA vận chuyển (tRNA) thành dạng aminoacyl-tRNA dưới sự xúc tác của enzyme aminoacyl-tRNA-synthetase, một loạt các protein khác và đặc biệt là còn có sự tham gia của cấu trúc màng. Ở vi khuẩn cấu trúc màng tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein là màng tế bào chất mà có thể là vùng mesosome. Trong khi đó cấu trúc màng có chức năng tương ứng ở sinh vật nhân chuẩn là mạng lưới nội chất (endoplasmic reticulum). Mạng lưới nội chất không có ribosome bám lên gọi là mạng lưới nội chất nhẵn còn mạng lưới nội chất có ribosome bám lên gọi là mạng lưới nội chất có hạt. Ribosome chỉ hoạt động khi bám lên cấu trúc màng. Nhờ vậy (và còn nhờ các chất tạo khuôn gọi là chaperon) các
209 protein được tổng hợp ra có được cấu trúc không gian xác định, phân bố trong cấu trúc màng theo hướng xác định (đầu NH3+ hướng ra ngoài màng tế bào chất và hướng vào phía trong của màng mạng lưới nội chất) và, nhờ đó, có chức năng xác định. Ribosome cấu tạo từ hai tiểu thể có hằng số lắng khác nhau: 30S và 50S ở vi khuẩn và trong ty thể hay lạp thể, còn trong nhiễm sắc thể tế bào nhân chuẩn ribosome lớn hơn và cấu tạo từ tiểu thể 40S và 60S. Các ribosome đều có hai vị trí gắn tRNA: vị trí A gắn aminoacyl-tRNA và vị trí P gắn peptidyl-tRNA. RNA vận chuyển (tRNA) chỉ gồm 70 - 90 nucleotide, chứa nhiều bazơ nitơ cải biến (dihydroutidine, pseudoutidine, thioutidine, inosine, ribothymidine,...), có dạng lá ba chẽ với cuống và ba thùy. Đầu 5' của cuống là vị trí gắn Acid amin, còn thùy giữa là đối mã (anticodon). Quá trình dịch mã bao gtờ cũng bắt đầu từ một methionine. Ở vi khuẩn tRNA vận chuyển methionine đầu chuỗi cũng khác với tRNA vận chuyển methionine vào giữa chuỗi. Sau khi gắn với tRNA methionine đầu chuỗi thường phải formyl hóa (nhờ nhận gốc formyl từ Acid N10- tetrahydrofolic) thành formyl-methionine-tRNA. Vì vậy, RNA vận chuyển methionine vào đầu chuỗi và giữa chuỗi được ký hiệu lần lượt là RNAfmet và RNAmmet. Trước hết nhờ sự kích thích của protein IF-3, mRNA liên kết với ribosome 30S. Tiếp đến tổ hợp fMet-RNAfmet ở dạng phức hợp cao năng (fMet-RNAfmet-IF-2-GTP) được chuyển vào vị trí P trên hạt 30S ứng với codon mở đầu UAG của methionine. Tín hiệu UAG của methionine trên mRNA là của methionine mở đầu chỉ khi nó nằm gần trình tự Shine-Dalgarno (3 - 9 nucleotide chứa trình tự trung tâm GAG) ở trước đó. Nhờ tín hiệu này codon AUG mở đầu được chuyển chính xác vào vị trí mở đầu trên ribosome thay thế vị trí của IF-3 trên hạt 30S của ribosome. Sau đó hạt này liên kết tiếp với hạt 50S thành thể ribosome 70S. Đồng thời, IF-2 (trong tổ hợp hoạt hóa với IF-1) bị đẩy ra ngoài nhờ năng lượng thủy phân GTP. Kết quả là phức hợp mở đầu (70S-mRNA- fMet-RNAfmet) được hình thành. Quá trình kéo dài cần các yếu tố kéo dài: EF-T và EF-G. Yếu tố EF- T gồm hai protein: Tu và Ts. Tu và GTP hoạt hóa tất cả các Acid amin tham gia kéo dài chuỗi polypeptide. Tổ hợp Acid amin hoạt hóa có dạng chung là aan-tRNA-Tu-GTP. Trước hết tổ hợp này gắn vào vị trí A với codon tương ứng, rồi ở đó GTP bị thủy phân bởi Tu và cùng bị đẩy ra ngoài. Tổ hợp Tu-GTP năng lượng cao được phục hồi nhờ yếu tố Ts. Liên kết peptide thứ nhất được tạo thành nhờ hoạt tính peptidyl-transferase của ribozyme 23S trong thành phần hạt ribosome 50S. Nhóm -COOH của fMet và -NH2 của Acid amin tiếp theo (aa2) tham gia phản ứng trùng ngưng giải phóng một phân tử nước, nhận điện tử (năng lượng) từ tổ hợp
210 tRNA-Tu-GTP. Để dịch mã được tiếp tục fMet-aa2-tRNA được dịch chuyển từ vị trí A sang vị trí P của ribosome, còn tRNAfMet bị tách khỏi cả hai liên kết: liên kết với codon mRNA và liên kết với methionine mà trở nên tự do. Sự chuyển chỗ này cần yếu tố EF-G và GTP: EF-G thủy phân GTP cung cấp năng lượng cho sự chuyển chỗ đồng thời đẩy EF-G ra ngoài. Ở sinh vật nhân chuẩn Acid amin mở đầu sự dịch mã cũng là methionine nhưng không cần formyl hóa. Các chuỗi polypeptide được tổng hợp nhờ ribosome phải diễn ra trên cấu trúc màng. Ở vi khuẩn cơ cấu này chủ yếu là màng tế bào chất tạo thành nếp cuộn của mesosome, còn sinh vật nhân chuẩn đó chính là mạng lưới nội chất. Về thực chất hai cơ cấu màng này đều là sản phẩm của quá trình tổng hợp màng vốn diễn ra liên tục trong tế bào và cung cấp phần diện tích màng mới bao bọc thể tích của tế bào đang tăng trưởng. Màng được hình thành chủ yếu nhờ quá trình chuyển hóa lipid trung tính dự trữ thành lipid phân cực (chủ yếu là phospholipid) tạo nên cơ cấu màng đơn vị (hay màng điển hình) hai lớp có các đuôi Acid béo hướng vào nhau nhờ lực kị thủy. Màng đơn vị được bổ sung các phân tử protein đang được tổng hợp trên ribosome bám dính trên màng này mà trở thành cấu trúc màng sinh học đặc trưng: các phân tử protein khác nhau hoặc thẩm nhập suốt độ dày của màng, thẩm nhập chỉ phía trong hoặc phía ngoài của màng, hoặc nằm giữa hai lớp màng đơn vị phụ thuộc vào tính phân cực và lực kị thủy của toàn bộ hay một phần cấu trúc phân tử của chúng. Cơ cấu màng sinh học từ trạng thái mạng lưới nội chất chuyển dần ra ngoài rồi dung hợp với màng tế bào chất làm diện tích màng tế bào chất càng rộng. Mặt khác, các protein tiết xuất cũng được tổng hợp trên cơ cấu màng và nhờ quá trình dung hợp màng tiểu bào (thể Golgi phình rộng) với màng tế bào chất mà được tiết xuất ra ngoài tế bào. Chính nhờ những cơ cấu này mà cơ thể có những tính trạng đặc trưng. Ở vi khuẩn, quá trình hình thành màng bắt đầu từ mesosome và quá trình tổng hợp protein cũng diễn ra đồng thời. Các phân tử protein được tổng hợp trôi dạt dần trong cấu trúc linh động của màng. Ở các tế bào động vật hay thực vật bị cảm nhiễm virus, các quá trình tổng hợp protein virus và hình thành màng của tế bào cũng diễn ra đồng thời theo phương thức tương tự. Vì vậy, nếu phát triển virus luôn lộ xuất các kháng nguyên của mình trên bề mặt tế bào ký chủ trước khi giải phóng ra khỏi tế bào. III. Sửa chữa DNA Tế bào có cơ cấu sao chép thông tin di truyền hoàn thiện nhờ cơ chế sao chép bán bảo toàn và lắp ráp nucleotide tương bù vào khuôn mạch đơn. Tuy vậy, cơ chế này còn được bổ sung thêm cơ cấu sửa chữa DNA.
211 Có thể gặp ba cơ chế sửa chữa DNA là sửa chữa trực tiếp, sửa chữa cắt bazơ và sửa chữa ghép đôi sai. Sửa chữa trực tiếp thường gặp khi trên DNA hình thành dimer thymine, là kết quả của sự chiếu xạ tử ngoại vào lứa cấy tế bào. Trong cơ thể có một loại enzyme gọi là photolyase đảm trách việc sửa sai này. Trong thành phần có FADH2 và 5,10-dimethyl tetrahydrofolate, photolyase được hoạt hóa bởi ánh sáng nhìn thấy. Khi đó nó có thể nhận biết cấu trúc dimer thymine, phân giải dimer rồi tách khỏi DNA. Ví dụ khác về sửa chữa trực tiếp là sửa chữa phục hồi guanine đã bị methyl hóa trên nguyên tử O6. O6-methyl guanine (O6MG) hình thành khi tế bào phát triển trong môi trường có yếu tố ankyl hóa. Khi sao mã, O6MG có khuynh hướng ghép đôi với T hơn là với C, vì vậy gây đột biến GC thành AT. Enzyme DNA-methyl transferase xúc tác loại bỏ nhóm methyl khỏi O6MG làm phục hồi guanine bình thường trong chuỗi DNA. (Do nhóm methyl liên kết chặt với Acid amin cystine của trung tâm hoạt động của enzyme nên enzyme bị vô hoạt sau phản ứng sửa chữa DNA). Sửa chữa trực tiếp còn nhờ các exonuclease là những enzyme cắt DNA từ hai đầu. Sửa chữa cắt bazơ được thực hiện nhờ enzyme DNA-glycosylase. Enzyme này nhận biết những chỗ hư hỏng phổ biến trên DNA như adenine và cytosine khuyết thiếu amin hoặc guanine và adenine methyl hóa. Các enzyme này cắt bỏ nucleotide sai bằng cách cắt bỏ mối liên kết glycosyl giữa bazơ nitơ và nguyên tử C 1' của deoxyribose. Kết quả là tạo nên những điểm khuyết thiếu purine hoặc pyrimidine, ký hiệu là AP (apurinic/apyrimidineic site). Sau khi AP xuất hiện các enzyme AP- endonuclease cắt bỏ deoxyriboso-5'-phosphate sót lại, sau đó DNA- polymerase I tổng hợp DNA bổ sung và ligase hàn chỗ trống trong mạch. Bên cạnh sửa chữa điểm nêu trên còn có quá trình sửa chữa ghép đôi sai. Hệ thống sửa chữa này ở E. coli, chẳng hạn, có ít nhất 9 protein. Sự phân biệt sợi dựa vào tác dụng của enzyme dam-methylase methyl hóa DNA ở các vị trí N6 của tất cả các adenine (*A) gặp trong trình tự 5'- GATC hay enzyme dcm-methylase methyl hóa cytosine (*C) nằm kề adenine hoặc kề thymine trong trình tự CCATGG hay CCTAGG, hay ở động vật bậc cao một số cytosine trong trình tự CG. Sau thời điểm sao chép chỉ sợi khuôn được methyl hóa còn sợi mới còn chưa methyl hóa. Nhờ đó tế bào phân biệt được sợi cũ và sợi mới. Trong sửa chữa DNA, các protein MutS, MutH và MutL đóng vai trò quan trọng. MutS liên kết các cặp bazơ ghép đôi sai, MutH liên kết với trình tự GATC, còn MutL kết hợp với cả hai protein đã kết hợp DNA nói trên thành một phức hợp làm cho phân tử DNA uốn cong trong khoảng độ dài 1000 bp phía đầu 5'
212 của trình tự GATC. Khi đó, nếu một trong hai mạch không được methyl hóa MutH sẽ tác dụng như một endonuclease phân giải sợi không được methyl hóa ở phía 5' của guanine thuộc GATC. Sợi không methyl hóa sẽ được tiếp tục bị cởi xoắn và bị phân giải theo hướng 3'→5' từ vị trí đánh dấu đến vị trí ghép sai rồi được thay thế bằng sợi DNA mới với sự xúc tác của hệ thống replisome gồm helicase II, protein SSB, exonuclease I, polymerase III và ligase. IV. Cơ chế chống sự xâm nhập của gen lạ (hạn chế và cải biến) Tế bào có cơ chế tự sao chép và sửa sai bảo đảm cho vật chất di truyền ổn định. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp tế bào chịu sự xâm nhập của gen lạ, như các phage xâm nhập vào tế bào vi khuẩn. Khi đó tế bào còn có cơ chế khác chống lại sự xâm nhập của DNA từ ngoài vào. Sự hạn chế (restriction) này là nhờ các tế bào ký chủ có hệ thống enzyme nhận biết và cắt các DNA lạ (gọi là các enzyme hạn chế - restriction enzyme) trong khi các DNA tế bào chủ không bị cắt là nhờ sự cải biến (modification). Hạn chế và cải biến phổ biến ở vi sinh vật và được nghiên cứu kỹ ở vi khuẩn. Một mặt chúng có tác dụng đánh dấu DNA tế bào, mặt khác phân hủy DNA lạ. Hệ thống gồm hai hoạt tính enzyme trên cùng một phân tử protein hay trên hai protein riêng rẽ: hoạt tính endonuclease và methyltransferase. Các endonuclease này nhận biết một trình tự đặc hiệu dài ngắn khác nhau tùy loại enzyme và phân cắt DNA này tại vị trí hoặc cách xa điểm nhận biết đó. Do DNA của mình được methyl hóa tại các điểm adenine (tại N-6) và cytosine (tại N-5 và N-4) bởi hoạt tính methyltransferase tác dụng phân cắt của hoạt tính endonuclease bị trở ngại. Các endonuclease đều cắt DNA sợi đôi và có thể chia thành hai loại. Loại I nhận biết trình tự DNA đặc biệt và cắt DNA này ở xa vị trí nhận biết. Endonuclease của phage P1 thuộc loại này. Loại II nhận biết và phân cắt DNA trong trình tự nhận biết là một vùng có trình tự đối xứng quay kép (trình tự đối xứng đảo vị hay trình tự lặp ngược hướng - palindrome). Do phân cắt tại những điểm đặc hiệu tạo ra những mảnh DNA xác định nên enzyme hạn chế loại II được sử dụng trong kỹ thuật tái tổ hợp và tạo dòng gen. Bảng dưới đây giới thiệu một số enzyme hạn chế. Chú ý một số enzyme hạn chế (Eco RI, Hha I) cắt DNA hai sợi tạo ra đầu gồm một số nucleotide một sợi (đầu dính - cohesive), trong khi đó một số enzyme hạn chế khác (Ba II, Hae III) cắt DNA hai sợi tạo ra đầu bằng (đầu tầy).