BÁO CÁO KHOA HỌC: "TINH CHẾ LECTIN TỪ HẠT ĐẬU LĂNG (LENS CULINARIS, L.) BẰNG SẮC KÍ ÁI LỰC SEPHADEX – G75"

Chia sẻ: Linh Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:13

Thêm vào BST

Báo xấu

132
lượt xem 25
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Dịch chiết bằng đệm của hạt đậu lăng (Lens culinaris, L.) lần đầu tiên được Landsteiner và Raubitchek (1907) thông báo là có hoạt động ngưng kết hồng cầu, sau này lectin của hạt đậu lăng châu Âu (LCA) đã được một số nhà khoa học tinh chế và được sử dụng trong nghiên cứu y sinh học và miễn dịch (6).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: BÁO CÁO KHOA HỌC: "TINH CHẾ LECTIN TỪ HẠT ĐẬU LĂNG (LENS CULINARIS, L.) BẰNG SẮC KÍ ÁI LỰC SEPHADEX – G75"

TINH CHẾ LECTIN TỪ HẠT ĐẬU LĂNG (LENS CULINARIS, L.) BẰNG SẮC KÍ ÁI LỰC SEPHADEX – G75 Đỗ Ngọc Liên, Phạm Tuấn Anh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Nguyễn Văn Lợi, Đào Kim Chi Trường Đại học Dược Hà Nội ĐẶT VẤN ĐỀ Dịch chiết bằng đệm của hạt đậu lăng (Lens culinaris, L.) lần đầu tiên được Landsteiner và Raubitchek (1907) thông báo là có hoạt động ngưng kết hồng cầu, sau này lectin của hạt đậu lăng châu Âu (LCA) đã được một số nhà khoa học tinh chế và được sử dụng trong nghiên cứu y sinh học và miễn dịch (6). Mới đây LCA tinh khiết đã được Taketa và cộng sự sử dụng làm nguyên liệu tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch dấu hiệu AFP trong ung thư biểu mô tế bào gan nhằm phân biệt với bệnh viêm gan siêu vi trùng thông
thường (7). Ở Việt Nam đậu lăng cũng đã được trồng nhập nội và sử dụng từ thời Pháp thuộc (1) nhưng chưa có tài liệu nào công bố về khả năng khai thác nguồn tài nguyên lectin quý hiếm này dùng cho nghiên cứu sinh y học và miễn dịch. Xuất phát từ ý tưởng đó chúng tôi bước đầu thực hiện công việc nghiên cứu tinh chế lectin đậu lăng (LCA) và quy trình thử nghiệm chế tạo bộ sinh phẩm lectin dùng trong chẩn đoán y học. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Hạt đậu lăng khô được mua ở siêu thị là sản phẩm tiêu dùng trong thực phẩm ở nước ta cũng như nhiêù nước trên thế giới, đã được định tên khoa học là Lens culinaris, L, (theo Tiến sĩ phân loại học Nguyễn Đăng Khôi), được bóc vỏ cứng và nghiền thành bột mịn. Hồng cầu các nhóm máu được Viện huyết học truyền máu Trung ương và bệnh viện Bạch Mai cung cấp đã xác định là
không có yếu tố vi sinh vật truyền bệnh. Việc xác định hoạt tính ngưng kết hồng cầu (HAA), biểu thị cho hoạt tính lectin được thực hiện thường quy ở phòng thí nghiệm sinh y học thuộc Trung tâm sinh học phân tử và công nghệ tế bào, ĐHQG Hà nội như đã mô tả trước đây(2,6). Các phương pháp xác định hàm lượnh protein theo Lowry (5), kiểm tra đáng giá mức độ tinh sạch của chế phẩm lectin tinh chế được thực hiện theo kỹ thuật điện di gel polyacrylamid ( SDS-PAGE) của Laemmli như đã mô tả trước đây (4). Việc tinh chế lectin đậu lăng đã được hoàn thiện nhờ kỹ thuật sắc ký ái lực trên cột Sephadex G-75 (3). 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 3.1 Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin đậu lăng Sau khi chiết rút LCA từ bột hạt bằng đệm phốtphát chứa NaCl 1M, có CaCl2 và MnCl2 1mM, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính ngưng kết hồng cầu và hàm lượng protein trong dịch chiết. Kết quả được thể hiện ở bảng 1.
Bảng 1 : Hàm lượng Protein và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của dịch chiết đậu lăng Kết quả trình bày ở bảng 1 cho thấy LCA thể hiện hoạt tính cao nhất ở nhóm máu A. Trong các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi chỉ tiến hành thử hoạt độ ngưng kết với hồng cầu nhóm máu A. 3.2. Tinh chế lectin đậu lăng a) Dùng HCl 1M điều chỉnh pH dịch chiết về 4,5 để loại protein không có hoạt tính. Sau khi li tâm, điều chỉnh pH về trung tính bằng NaOH 1M. b) Kết tủa phân đoạn protein đậu lăng bằng (NH4)2SO4 75% bão hoà. Sử dụng dung dịch muối trung tính (NH4)2SO4 ở trên đã kết
tủa toàn bộ protein - lectin trong dịch chiết. Điều này được chứng minh là HAA ở dịch nổi sau kết tủa hầu như không có. Như vậy nồng độ (NH4)2SO4 75% bão hoà đựơc sử dụng là thích hợp nhất để kết tủa thuận nghịch lectin. c)Tinh sạch lectin đậu lăng qua cột sắc kí ái lực Sephadex G-75 : Phần kết tủa lectin bằng (NH4)2SO4 được thu lại và hoà trong đệm phốtphát và thẩm tích 3 lần sau đó sẽ nạp vào cột sắc ký ái lực Sephadex G75 ( kích thước 2x20 cm) đã cân bằng với đệm chứa NaCl 1M, có CaCl2 và MnCl2 1mM. Phản hấp phụ bằng dung dịch đệm photphat chứa NaCl 1M, bổ sung glucose 1M và EDTA 1mM. Thu phân đoạn 3 ml, tốc độ chảy 20 ml/h. Xác định hàm lượng protein ở các phân đoạn. Dồn các phân đoạn có hàm lượng protein cao, thẩm tích và đông khô ở – 45oC trong 8 giờ. Toàn bộ kết quả tinh chế được thể hiện trên bảng 2.
Bảng 2: Tóm tắt kết quả tách chiết và tinh chế lectin đậu Lens culinaris Kết quả ở bảng 2 cho thấy từ 2g (2000 mg) bột hạt đậu lăng (Lens culinaris L.), qua quá trình tách và tinh chế chúng tôi thu được 0.42 mg LCA tinh khiết, hiệu suất thu hồi hoạt độ 5% và độ sạch tăng lên 57.69 lần. Mặc dù LCA đã được tinh chế có độ sạch tăng lên rất cao nhưng khả năng thu hồi lectin còn thấp. Do đó đây là một vấn đề đặt ra cho chúng tôi là cần phải tiếp tục nghiên cứu để tăng hiệu suất của quá trình tinh chế. 3.3.Kiểm tra độ tinh sạch của LCA: Chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật điện di trên gel
polyacrylamide để kiểm tra độ tinh sạch của lectin đậu lăng và xác định trọng lượng phân tử của lectin này. Kết quả thể hiện ở hình 1: Hình 1: Ảnh kết quả điện di các chế phẩm LCA trên gel polyacrylamid Dãy 1: Chế phẩm lectin đậu lăng đã tinh chế qua cột ái - lực Sephadex G75 thể hiện chủ yếu 1 băng có khối lượng phân tử xấp xỉ 25 KDa, một băng nhỏ có khối lượng xấp xỉ 12 KDa Dãy 2: Dịch nổi sau khi kết tủa dịch chiết đậu lăng - bằng (NH4)2SO4 75% bão hoà
Dãy 3: Dịch chiết bằng đệm của bột đậu lăng chưa qua - tinh sạch. Dãy 4: Các protein tiêu chuẩn gồm: BSA(66 kDa), - Ovalbumin (45kDa), Lyzozym (14,3 kDa) Qua ảnh điện di chúng tôi thấy lectin đậu lăng đã tinh chế qua sắc kí ái lực Sephadex G-75 có hai băng, trọng lượng phân tử khoảng 25 kDa và 12 KDa. Trong đó băng 25 KDa chiếm ưu thế (đậm hơn nhiều so với băng 12 KDa). Việc tính toán khối lượng phân tử được thực hiện theo kỹ thuật của Laemmli với việc xây dựng đường đồ thị các protein tiêu chuẩn đã biết trước khối lượng phân tử (3,4). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây của nhiều tác giả cho rằng phân tử LCA có thể bao gồm 2 chuỗi  và 2 chuỗi  có khối lượng tương đương từ 24 kDa và từ 10-12 kDa. Phân tử LCA có thể kết hợp giữa các chuỗi  và  để hình thành các mức độ khối lượng phân tử từ 25 kDa đến 45 kDa (6). Điều quan trọng là lectin đậu lăng sau khi được chúng tôi tinh chế có mức độ tinh sạch cao có thể so sánh
với thương phẩm ngoại nhập với giá mua vào rất đắt (610 USD cho 100 mg chế phẩm của hãng Sigma năm 2001), vẫn đảm bảo hoạt tính sinh học ở điều kiện bảo đảm tiêu chuẩn. Quy trình tinh chế LCA được mô tả tóm tắt theo sơ đồ sau: KẾT LUẬN
1. Lectin từ hạt đậu lăng (Lens culinaris L.) không gây ngưng kết hồng cầu đặc hiệu nhóm máu, tuy nhiên hoạt độ ngưng kết hồng cầu nhóm máu A là cao nhất so với các nhóm máu khác. 2. Sử dụng dung dịch đường glucose 1M/NaCl 1M, EDTA 1mM là thích hợp cho việc phản hấp phụ LCA ra khỏi cột sắc ký ái lực Sephadex G-75. 3. Bằng kỹ thuật sắc ký ái lực trên cột Sephadex G-75 đã tinh chế được LCA có độ tinh khiết cao. Chế phẩm LCA thu được có độ sạch tăng 57,69 lần, hiệu suất thu hồi 0,52%. 4. Kết quả điện di chế phẩm LCA tinh sạch trên gel polyacrylamide chỉ phát hiện được 2 băng protein có khối lượng phân tử khoảng 25 KDa và một băng nhỏ khoảng 12 KDa Đề tài này được hỗ trợ kinh phí của chương trình nghiên cứu khoa học cơ bản Nhà nước do Bộ khoa học và công
nghệ quản lý. TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Đăng Khôi (1979). Nghiên cứu về cây thức ăn 1. cho gia súc ở Việt Nam. Những loài cây bộ Đậu (Fabales). Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 2. Do ngoc Lien, Cesari IM., Bouty I., Bout D., Hoebeke J. (1992). Immunocapture Assay for quantification of human IgA antibodies to parasite antigenic enzymes. Applicatin with the alkaline phosphatase of Schistoma mansoni. J. Immunoassay 13 (4) USA. pp521-539. 3. Johnstone A., Thorpe R (1987) Immunochemistry in practice. Second edition, Blackwell Scientific Publications, pp 4 - 16 4. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structral proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685. 5. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Raudall R.L. 1951. Protein measurement with the Folin phenol
reagent. J. Biol Chem 193, 265-275. 6. Lis. H., and Sharon N (1986). Biological properties of lectins. The lectins: Properties, functions, and applications in biology and medicine. Acad. Press Inc pp 266 - 283. Taketa K., Endo Y., Sekiya C., H. 1993. ATanikawa 7. K., Koji T., Taga H., Satomura S., Kwai T and Hirai - Collaborative Study for the Evalution of lectin –Reactive Fetoprotein Early Ditection of Hepatocellular carcinoma .Cancer reasch 53, 5419-5423. SUMMARY Isolation and purification of the lectin from Lentils bean seeds (Lens culinaris L.) by affinity chromatography Đo Ngoc Lien, Pham Tuan Anh, et al. Faculty of Biology, Hanoi University of science
The lectin (LCA) from Lentils bean seeds (Lens culinaris L.) was isolated by precipitating with 75% saturated (NH4)2SO4, thus purified by Sephadex G-75 affinity chromatography column. The purity and molecular mass of this lectin was assesed and determined by SDS-PAGE ( Polyacrylamide Gel Electrophoresis with presence of SDS). The result of purication of LCA showed that the lectin compounds of two bands of protein about 25 KDa and 12 KDa in SDS-PAGE. Some properties of LCA were determined as: non specific agglutination of human erythrocytes, specific activity of purified lectin about 58 folds higher in comparision with 1M NaCl extraction. Người thẩm dịnh nội dung khoa học: PGS. Nguyễn Văn Mùi