Báo cáo " THU NHẬN VÀ BIỆT HOÁ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TUỶ XƯƠNG CHUỘT (Mus musculus var. Albino) "

Chia sẻ: Nguyen Nhi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

480
lượt xem 66
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tuỷ xương chứa một nguồn tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell -MSC) dồi dào. Các tế bào MSC này được thu nhận và nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12 (Sigma), 10% FBS (Invitrogen). Sau kho ảng 10 ngày nuôi cấy, các tế bào MSC tăng sinh mạnh và chiếm 70-80% diện tích bề mặt đáy bình Roux (25 cm 2, Nunc), tiến hành cấy chuyền với trypsin/EDTA (Sigma) 0,25% nhằm cung cấp chất din h dưỡng và không gian phát triển cho tế bào MSC. ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo " THU NHẬN VÀ BIỆT HOÁ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TUỶ XƯƠNG CHUỘT (Mus musculus var. Albino) "

332 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 THU NH ẬN VÀ BIỆT HOÁ TẾ B ÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TUỶ XƯƠN G CHU ỘT (Mus musculus var. Albino) Trương Định, Trương Hải Nhung, Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc ĐH Khoa học Tự nhi ên TPHCM MỞ ĐẦU Tuỷ xương chứa một nguồn tế b ào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell -MSC) dồi dào. Các t ế bào MSC này được thu nhận v à nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12 (Sigma), 10% FBS (Invitrogen). Sau kho ảng 10 ngày nuôi c ấy, các tế bào MSC tăng sinh mạnh và chiếm 70-80% diện tích bề mặt đáy b ình Roux (25 cm 2, Nunc), ti ến hành cấy chuyền với trypsin/EDTA (Sigma) 0,25% nhằm cung cấp chất din h dưỡng và không gian phát tri ển cho tế b ào MSC. Tế bào MSC là t ế bào gốc đa năng, chúng có khả năng biệt hoá th ành rất nhiều kiểu tế bào chức năng khác nhau. Chúng có thể biệt hoá th ành tế bào xương khi nuôi trong môi trường DMEM/F12, 10% FBS có bổ sung dexamethasone, glycerol phosphate, ascorbate, EGF (nhân t ố tăng trưởng biểu mô); th ành tế bào mỡ khi nuôi trong môi trường DMEM/F12, 10% FBS có bổ sung isobutyl -methylxanthine, dexamethasone, insulin, indomethacin; thành t ế bào giống tế b ào thần kinh khi nuôi trong môi trường DMEM/F12, 10% FBS có b ổ sung dịch chiết n ão chuột. Tế bào gốc nói chung v à tế bào gốc trung mô nói ri êng hiện đang l à mối quan tâm hàng đầu của nhiều nh à khoa h ọc và những thầy thuốc lâm s àng bởi khả năng đặc biệt duy nh ất của chúng đ ó là khả năng biệt hoá th ành nhi ều kiểu tế bào khác nhau trong cơ thể, như xương, sụn, mỡ, tế b ào thần kinh... Thêm vào đó chúng là một nguồn tế b ào đầy hứa hẹn cho việc cấy ghép v à sinh dược phẩm, chúng cũng phục vụ nh ư là một mô hình tối ưu của sự phát t riển của động vật có xương sống. Trong các nghiên c ứu về sự biệt hoá, các tế b ào MSC biệt hoá thành xương, sụn và mỡ được sử dụng nhiều nhất như là bằng chứng cụ thể về tiềm năng biệt hoá của tế b ào gốc. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG P HÁP Thu nhận tuỷ xương chuột Chuột (Mus musculus var. Albino) bị giết bằng cách kéo gi ãn đốt sống cổ, sau đó thu nhận hai xương đùi và xương cẳng chân. Các khúc xương được rửa bằng dung dịch PBSA hai l ần. Dùng kéo và k ẹp tách bỏ mô cơ bám trên các đoạn xương. Cuối cùng, tu ỷ xương được thu nhận bằng cách: d ùng ống kim với mũi kim 26 G có chứa sẵn môi trường nuôi cấy, chọc xuy ên vào tu ỷ xương và dội rửa hai lần.
333 Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT Nuôi cấy chọn lọc tế b ào gốc trung mô Hỗn hợp tế b ào có trong tu ỷ xương bao gồm tế b ào gốc tạo máu, tế bào máu trưởng thành và t ế bào gốc trung mô. Tuy nhi ên, chỉ có tế b ào gốc trung mô mới có khả năng bám dính vào b ề mặt nhựa của b ình Roux. Sau vài l ần thay môi trường, ta có thể loại bỏ được tất cả các tế b ào tạp nhiễm, chỉ c òn lại duy nhất tế b ào gốc trung mô. Tiến h ành như sau: h uyền phù tế bào tuỷ xương sau khi thu nhận được nuôi trong b ình Roux v ới mật độ 1.104 tế b ào/cm2 ở điều kiện 37 0C, 5% CO 2. Sau 24 gi ờ, các tế b ào gốc trung mô bắt đầu bám tr ên bề mặt b ình Roux, thay môi tr ường để loại bỏ các tế b ào không bám, tiếp tục nuôi đến khi tế bào đạt mật độ 70 -80% bình Roux v ới chế độ thay môi trường là 3 ngày/l ần. Cấy chuyền tăng sinh Khi m ật độ tế b ào MSC trong bình nuôi đạt khoảng 70 -80%, ti ến hành c ấy chuyền tăng sinh nhằm cung cấp không gian v à ch ất dinh dưỡng cho tế b ào MSC tăng sinh và phát tri ển đạt hiệu quả cao. Tiến h ành như sau: đổ bỏ môi trường cũ v à rửa tế b ào v ới 4 -5ml PBS-gentamycin (10 IU/ml) hai l ần. Sau đó, đổ bỏ dịch rửa v à bổ sung 4 -5ml trypsin/EDTA 0,25%. Sau 15 giây, ti ến hành đổ bỏ dung dịch enzyme nhưng vẫn chừa lại khoảng 1ml và ti ếp tục ủ trong tủ ấm 37 0C trong 2-3 phút. Sau đó, lắc nhẹ b ình Roux để tách tế b ào ra kh ỏi bề mặt đáy. Sau khi tế b ào tròn lên và tách ra kh ỏi bề mặt nuôi, tr ung hoà trypsin th ừa bằng 10 -11ml môi trường DMEM 10% FBS. Huy ền ph ù t ế b ào đó được chia đều cho 3 b ình Roux m ới. Biệt hoá tế b ào gốc trung mô Biệt hóa tế b ào gốc trung mô th ành tế bào tạo mỡ bằng môi trường nuôi DMEM/F12 10% FBS b ổ sung hỗn hợp 1 μM dexamethasone, 200 μM indomethacin, 1,7 μM insuline, 500 μM isobutyl -methylxanthine (tất cả đều của Sigma). Sự biệt hóa được ghi nhận khi quan sát d ưới kính hiển vi ở độ phóng đại X20, X40 thấy có sự xuất hiện các giọt mỡ nhỏ. Ngo ài ra, các t ế bào mỡ còn được xác định dựa vào phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Sudan black (Merck) l à thuốc nhuộm lipid, nó chỉ h òa tan trong lipid và t ạo màu đen. Biệt hoá th ành tế bào xương: Các tế bào MSC được nuôi trong môi trường DMEM/F12 10% FBS v ới 100 nM dexamethasone, 50 μg/ml L -ascorbic acid 2- phosphat (AsAP) và 100 mM β-glycerolphosphate (t ất cả đều của Sigma). Sau 7 -14 ngày, đánh giá sự biệt hoá thông qua khả năng tích tụ của calcium trong chất nền với phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Alizarin Red (Sigma). Biệt hoá th ành tế bào giống tế b ào thần kinh: Môi trường biệt hoá tế b ào gốc trung mô thành tế bào thần kinh là môi trường DMEM/F12 10% FBS, bổ sung 10% dịch chiết não chuột. Xác định tế b ào thần kinh sau khi được biệt hoá bằng h ình dạng đặc trưng của chúng.
334 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 KẾT QUẢ V À THẢO LUẬN 1. Nuôi c ấy chọn lọc tế b ào MSC Sau 24 gi ờ nuôi cấy, tế b ào MSC có hiện tượng bám tr ên bề mặt b ình Roux, trong khi các t ế bào tạo máu vẫn trôi lơ lửng trong dịch huyền ph ù tế bào. (a) (b)) (c) (d) Hình 1. Kết quả nuôi cấy chọn lọc MSC . (a) Tế bào MSC vừa mới thu nhận; (b) Tế bào MSC sau 24 giờ nuôi cấy, các tế bào MSC bắt đầu bám dính vào bề mặt bình nuôi; (c) Tế bào MSC sau 72 giờ nuôi cấy, các tế bào MSC bắt đầu trải dài hình dạng và tăng sinh; (d) Hình ảnh các tế bào MSC sau 240 giờ nuôi cấy, hầu hết các tế bào MSC lúc này đã có dạng hình thoi đặc trưng và tăng sinh mạnh. (Độ phóng đại X20) Sau 48 gi ờ, loại bỏ môi trường cũ và thay môi trường mới nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho sự phát triển của tế b ào MSC. Khi thay môi trư ờng, đồng thời loại bỏ đ ược những tế b ào chết cũng như các tế bào tạo máu còn lơ lửng trong môi trường cũ. Với lần thay môi trường đầu ti ên, không ti ến hành rửa tế bào vì kh ả năng bám dính của tế b ào MSC vào b ề mặt bình Roux v ẫn còn yếu. Sau 72 giờ, tế b ào MSC b ắt đầu trải ra tr ên bề mặt bình Roux, khi đó tế bào MSC đã có hình dạng đặc trưng, thường là hình thoi. Sau 120 gi ờ nuôi cấy, tế b ào MSC ti ếp tục trải rộng ra và phân chia gia tăng số lượng trên bề mặt b ình Roux. Sau 240 gi ờ, tế bào MSC h ợp dòng, bám đều và trải rộng tr ên bề mặt b ình Roux. Khi mật độ tế bào MSC đạt 70% - 80% di ện tích b ình Roux, ti ến hành cấy chuyền nhằm cung cấp không gian sống v à chất dinh dưỡng cho tế b ào MSC. 2. Cấy chuyền tăng sinh tế b ào MSC Khi vừa được cấy chuyền, tế bào MSC chưa có h ình dạng đặc trưng và trôi lơ lửng trong môi trường giống như khi vừa được thu nhận từ tuỷ xương.
335 Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT Sau 24 gi ờ, tế bào MSC b ắt đầu bám dính v à trải rộng. Sau 48 giờ, tế b ào MSC tr ải rộng, có dạng h ình thoi đặc trưng và bắt đầu tăng sinh. Tuy nhi ên, khả năng tăng sinh của tế bào MSC lúc này v ẫn còn rất chậm. Sau 152 gi ờ, tế bào MSC h ợp dòng và tr ải đều tr ên bề mặt b ình Roux. Biệt hoá tế b ào MSC X20 X40 (a) (b) X20 X20 (d) (c) Hình 2. Kết quả biệt hoá tế bào MSC. (a) Các tế bào tạo mỡ: sau 7-14 ngày trong môi trường biệt hoá tạo mỡ, các tế bào bắt đầu tích tụ các giọt mỡ ( ); (b) Các giọt mỡ bắt m àu đen khi nhuộm với thuốc nhuộm Sudan Black; (c) Các tế b ào tạo xương: sau 7-14 ngày trong môi trường biệt hoá tạo xương, các tế bào bắt đầu tròn lại và tích tụ calci trong chất nền. Sự tích tụ calci được xác định bằng cách nhuộm với Alizarin Red; (d) Tế b ào giống tế bào thần kinh: các tế bào MSC sau khi nuôi trong môi trường biệt hoá thần kinh, MSC thay đổi h ình dạng thành tế bào giống tế bào thần kinh với exon dài ( ), thân tế bào thần kinh ( ). Biệt hoá h ành tế bào mỡ Sau 48 gi ờ, các tế b ào bắt đầu tích tụ các giọt mỡ trong tế b ào chất. Các giọt mỡ nhỏ góp lại dần th ành các gi ọt lớn. Chúng chuyển từ dạng d ài, trải rộng chuyển sang dạng tròn. Các gi ọt mỡ có thể quan sát dễ d àng dưới kính hiển vi đảo ngược có độ phóng đại X20. Biệt hoá h ành tế bào xương Sau khi nuôi trong môi trư ờng biệt hóa, các tế b ào từ dạng d ài chuyển sang dạng tròn và hình h ạt đậu. Về mặt h ình thái h ọc, có thể đánh giá sơ bộ là các t ế bào này đ ã biệt hóa th ành công. D ạng thuôn d ài, trải rộng l à hình d ạng của tế b ào gốc trung mô v à dạng tròn hay hình h ạt đậu l à hình d ạng của tế b ào tạo xương (osteoblast). Khi nhu ộm với Alizarin red, các tế b ào tròn hay hình h ạt đậu sẽ nhuộm màu đỏ cam. Điều này chứng tỏ các tế bào có ngu ồn gốc từ tế bào MSC này đ ã có sự lắng tụ muối calci trong chất nền ngoại b ào. Như vậy, các tế bào MSC đ ã biệt hóa th ành các t ế bào tạo xương.
336 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Biệt hoá th ành tế bào giống tế b ào thần kinh Sau 10-14 ngày bi ệt hoá, một số tế b ào bắt đầu thay đổi h ình dạng với sợi trục kéo dài và m ột đầu ph ình to gi ống thân tế b ào thần kinh cũng như các nhánh nhỏ xuất phát từ thân giống như các sợi nhánh. KẾT LUẬN Thu nhận và nuôi cấy thành công t ế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột Mus Muscular var. Albino. Tế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột Mus Muscular var. Albino có khả năng biệt hóa th ành t ế bào tạo mỡ, xương và tế bào thần kinh khi nuôi cấy trong môi tr ường có bổ sung một số nhân tố cảm ứng biệt hoá thích hợp. TÀI LI ỆU THAM KH ÀO 1. Daniel R. Marshak, Richard L. Gardner & David Gottlieb (2001). Stem cell Biology. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2. Freshney R. I. (2000). Culture of animal cells - A Manual of basic Technique , 4th Ed. Newyork: Willey Liss. 3. Moustapha Kassen và Cs (2004). Mesenchymal Stem Cells: Cell Biology and Potenntial Use in Therapy. Basic & Clinical Pharmacology & Texicology, 95, 209-214. 4. Robert I.(2004). Mesenchymal stem cell. Vox Sanguinis . 38-41. SUMMARY Collecting and differentiating mesenchymal stem cells from mouse bone marrow Truong Dinh, Truong Hai Nhung, Pham Van Phuc, Phan Kim Ngoc University of Sciences HCMCity Bone marrow is a rich source of mesenchymal stem cells (MSCs). MSCs have been collected and cultured with DMEM/F12 medium plus 10% FBS (fetal bovine serum). At about 10th day, MSCs strongly expand and cover with 70 -80% Roux’s surface. At that time, MSCs are subcultured by trypsin/EDTA 0,25% to provide nutrients and surface for development. MSCs are pluripotential stem cells. They can differentiate to many different cell types, such as: osteoblasts, adipocytes, neuron -like cells... MSCs could be differentiated to osteoblasts in DMEM/F12, 10% FBS medium plus dexamethasone, glycerol phosphate, ascorbate, EGF (epidermal growth factor); to adipocytes in DMEM/F12, 10% FBS plus isobutyl-methylxanthine, dexamethasone, insulin, indomethacin; to neuron -like cells in DMEM/F12, 10% FBS plus mouse brain crude extract.