Bước đầu khảo sát tần suất phân bố kiểu hình của các STR thường được sử dụng trong xét nghiệm dấu vân tay DNA ở người Việt Nam

Chia sẻ: Trần Thị Hạnh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

82
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của nghiên cứu là bước đầu khảo sát tần suất phân bố kiểu hình của các STR (Short tandem repeat) có trong quần thể người Việt để làm cơ sở dữ liệu cho xét nghiệm nhận dạng cá thể ở người Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bước đầu khảo sát tần suất phân bố kiểu hình của các STR thường được sử dụng trong xét nghiệm dấu vân tay DNA ở người Việt Nam

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT TẦN SUẤT PHÂN BỐ KIỂU HÌNH CỦA CÁC STR THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM DẤU VÂN TAY DNA Ở NGƯỜI VIỆT NAM Trần Khánh Linh*, Lê Thúy Quyên*, Võ Đức Xuyên An**, Phạm Hùng Vân* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Để có thể tính được xác suất sai lầm trong phân tích kết quả xét nghiệm dấu vân tay DNA phát hiện quan hệ huyết thống trên cơ sở phát hiện các STR, cơ sở dữ liệu về tần số phân bố các kiểu hình STR rất là quan trọng. Tại Việt Nam, cho đến hiện nay vẫn chưa có một cơ sở dữ liệu như vậy. Mục đích nghiên cứu: Mục đích của nghiên cứu là bước đầu khảo sát tần suất phân bố kiểu hình của các STR (Short tandem repeat) có trong quần thể người Việt để làm cơ sở dữ liệu cho xét nghiệm nhận dạng cá thể ở người Việt Nam. Đối tượng và phương pháp: Đối tượng nghiên cứu là 180 người Việt Nam được lấy mẫu bằng quệt niêm mạc má hay chân tóc. Các mẫu được tách chiết DNA và sau đó sử dụng bộ mồi multiplex primers của Beckman Coulter đặc hiệu 12 loci STR (TH001, D18S51, AMOELOGEN, D13S1357, D7S820, D16S539, PENTA E, D3S1358, D8S1179, TPOX, CSF1PO, PENTA D) để khuếch đại qua PCR. Sản phẩm PCR được phát hiện và xác định kiểu hình STR qua điện di mao quản trên máy giải trình tự CEQ 8000 bằng chương trình phân tích đoạn chuyên dụng cho STR. Kết quả ghi nhận được tính toán bằng phần mềm PowerStats để tính tần suất alen và các chỉ số tin cậy của pháp y đối với 12 loci STR trong một mẫu 180 người Việt Nam không có quan hệ huyết thống. Kết quả: Đối với TH01 có 6 alen; D18S51 có 14 alen; AMOELOGEN có 2 alen; D13S1357 có 8 alen; D7S820 có 9 alen;D16S539 có 7 alen; Penta E có 18 alen; D3S1358 có 8 alen, D8S1179 có 10 alen; TPOX có 6 alen; CSF1PO có 7 alen, PENTA D có 11 alen. Tất cả các alen (kiểu hình) đều được tính tần số xuất hiện trong tổng số các kiểu hình xuất hiện và tần số các kiểu hình trong từng STR. Kết luận: Đây là lần đầu tiên một nghiên cứu về tần suất các kiểu hình STR được thực hiện tại miền nam Việt Nam. Quy trình xét nghiệm và cơ sở dữ liệu thu được từ nghiên cứu đã được ứng dụng cụ thể trong một số trường hợp nhận dạng cá thể người Việt Nam. Từ khóa: Xét nghiệm nhận dạng cá thể người; Đa hình di truyền; Trình tự lặp lại ngắn (STR); Dữ liệu quần thể người Việt Nam; Tần suất alen. ABSTRACT THE PRELIMINARY CALCULATION OF ALLELE FREQUENCY OF 12 STR LOCI WHICH ARE FREQUENTLY USED FOR DNA FINGERPRINTING TEST IN VIETNAMESE POPULATION. Tran Khanh Linh, Le Thuy Quyen, Vo Duc Xuyen An, Pham Hung Van * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 – 2011: 1 - 6 Background: In order to calculate mistakes probability in results analysis of fingerprinting test which determine family relationships based on detected STRs, a database for allele frequency of 12 STR loci is very important. In Viet Nam, there is no a database like that up till now. * Bộ môn Sinh học, khoa Khoa học Cơ bản – Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh Công ty Nam Khoa Địa chỉ liên hệ: ThS. Trần Khánh Linh ĐT: 0985274284 Email: trankhanhlinh08@yahoo.com ** Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 1 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 The aim of study: The aim of this study is determine the allele frequencies of 12 STR (short tandem repeat) loci in Vietnamese population to establish an DNA database for the human identity testing in Vietnamese people. Materials and methods: 180 unrelated Vietnamese peoples were obtained samples by buccal swab cytobrush or hair-root. DNA was extracted from buccal swab samples or hair-root samples and then using multiplex primers kit of Beckman Coulter special for12 STR loci (TH001, D18S51, AMOELOGEN, D13S1357, D7S820, D16S539, PENTA E, D3S1358, D8S1179, TPOX, CSF1PO, PENTA D) to amplified by PCR. The PCR products were detected and identified STR phenotype by capillary electrophoresis on the CEQ 8000 Genetic Analyzer with fragment analysis program special for STR. Results was calculated by PowerStats software to calculate the allele frequencies and forensic efficiency values for the 12 loci in a sample180 unrelated Vietnamese. Results: Analyzing of 180 samples showed that the TH01 locus has 6 alleles; D18S51 locus has 14 alleles ; AMOELOGEN locus has 2 alleles; D13S1357 locus has 8 alleles ; D7S820 locus has 9 alleles; D16S539 locus has 7 alleles; PENTA E locus has 18 alleles; D3S1358 locus has 8 alleles, D8S1179 locus has 10 alleles; TPOX locus has 6 alleles; CSF1PO có locus has 7 alleles, PENTA D có locus has 11 alleles. All kind of alleles were calculated allele frequencies in total of alleles was observed and allele frequencies of each STR locus. Conclusion: This is the first time, a study of allele frequency of 12 STR loci were carried out in southern Viet Nam. The study is still continues and updates. Keywords: Human identity testing; Genetic polymorphism; Short tandem repeats (STR); Viet Nam Population data; Allele frequency. nhau thì khá giống nhau, nhưng nhiều vùng GIỚI THIỆU trên bộ NST người cho ta thấy một sự khác Những tiến bộ đáng chú ý trong kỹ thuật nhau lớn giữa phân tử DNA của các người phân tích DNA hơn hai thập kỷ qua đã có một khác nhau. Và những vùng trình tự như vậy tác động to lớn đến lĩnh vực nhận dạng cá thể được gọi là “đa hình”. Các trình tự đa hình người. Các kỹ thuật phân tích DNA đã mở ra này sẽ tạo nên dấu vân tay DNA của từng cá một xu hướng mới trong phân tích pháp y. thể và được sử dụng trong việc nhận dạng cá Trước 1985, tất cả sự đa hình của yếu tố miễn thể người (5). Việc nhận dạng cá thể người dịch và các dấu ấn sinh hóa được sử dụng để bằng kỹ thuật phân tích dấu vân tay DNA đã nhận dạng cá thể người và chúng đều có được nghiên cứu từ nhiều năm nay bởi các những mặt hạn chế. Hướng đi mới của kỹ nhà khoa học ở nhiều nước trên thế giới. Hiện thuật phân tích DNA được mở ra lần đầu tiên nay trên thế giới có rất nhiều phương pháp bằng việc ứng dụng các tiểu vệ tinh sử dụng xét nghiệm dấu vân tay DNA. So với các các mẫu dò đa vị trí, cung cấp khả năng nhận phương pháp trước đây, phương pháp phân dạng cá thể cao hơn các phương pháp trước tích STR có nhiều ưu điểm nổi bật như kết đây. Tuy nhiên, các bước thực hiện phân tích quả có độ chính xác cao, khắc phục được tình tiểu vệ tinh thì quá phức tạp và yêu cầu một trạng số lượng mẫu quá ít, mẫu bị suy giảm lượng lớn DNA bản mẫu, trong khi quá trình do tác động của môi trường(4). Phương pháp thu lấy DNA bản mẫu thì khó khăn. Sự phát phân tích STR dựa trên kỹ thuật PCR là một triển của kỹ thuật PCR đã mở ra một bước kỹ thuật mới phổ biến vào giữa thập niên 90. ngoặt trong vấn đề phân tích DNA khi giúp Kỹ thuật phân tích STR được sử dụng để in khắc phục những hạn chế của các phương dấu vân tay DNA của mỗi cá nhân. Dấu vân pháp phân tích trước đó (3). Mặc dù trình tự tay DNA của hai người bất kỳ là cực kỳ thấp nucleotide của phân tử DNA ở các cá thể khác nhưng chúng ta phải chứng minh được điều 2 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 đó. Để kết luận nhận dạng cá thể người có tính chính xác cao và thuyết phục, đồng thời được công nhận bởi tòa án thì chúng ta phải có cơ sở dữ liệu thống kê được tần suất alen STR hiện diện trong quần thể. Từ tần suất alen STR chúng ta mới trả lời được câu hỏi xác suất trùng lắp của một dấu vân tay DNA cụ thể là bao nhiêu (11). Chính vì lý do đó mà hầu hết các nước trên thế giới đã thực hiện và phát triển các chương trình kiểm tra DNA của họ, bao gồm xây dựng cơ sở dữ liệu thông qua việc hợp tác với các cá nhân hoặc các tổ chức như FBI chịu trách nhiệm chuẩn hóa, huấn luyện và phát triển phương pháp xét nghiệm dấu vân tay DNA ở Mỹ. Tương tự như vậy, ở Châu Âu hệ thống Viện khoa học pháp y (The European Network of Forensic Science Institutes –ENFSI) và nhóm dấu vân tay DNA Châu Âu (European DNA Profiling group -EDNAP) hợp tác để phát triển các dữ liệu DNA của người dân Châu Âu(10). Ở Việt Nam, nhu cầu nhận dạng cá thể người khá cao, cụ thể như trong các trường hợp nhận dạng pháp y, nhận dạng cha con, ….nhưng cho đến nay chúng ta chỉ có duy nhất một công trình nghiên cứu về 16 locus STR trên 178 người Việt Nam sống tại Hà Nội của một tác giả người Nhật (13) và trước đó cũng chỉ có 2 nghiên cứu về locus STR nhưng bằng kỹ thuật phân tích RFLP(6,7,8,9). Như vậy có thể thấy rằng ở Việt Nam hiện tại có rất ít nghiên cứu về sự phân bố các STR trên người.Vì vậy, chúng tôi đã chọn đề tài Khảo sát tần suất các STR thường được sử dụng trong xét nghiệm dấu vân tay DNA trên người Việt Nam nhằm tăng khả năng nhận dạng cá thể người Việt Nam. Đề tài nếu thành công sẽ mở ra nhiều triển vọng ứng dụng kỹ thuật xét nghiệm STR. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Thu thập mẫu: Các mẫu quệt niêm mạc má bằng cytobrushes vô trùng của Agencourt Orapure hoặc mẫu tóc của 180 người Việt Chuyên Đề Khoa học Cơ bản Nghiên cứu Y học Nam không có quan hệ huyết thống (lấy từ sinh viên Đại học Y Dược Tp.HCM trong khoảng thời gian từ tháng 9/2008 đến tháng 9/2009). Hóa chất: Hoá chất dùng cho tách chiết DNA (bộ thuốc thử NKDNAPREP-PHCHL của công ty Nam Khoa). Hoá chất dùng cho quá trình PCR đối với 12 locus (bộ mồi GenomeLabTMHuman STR Primer Set của Beckman Coulter (2); iTaq DNA polymerase của Bio-Rad); Hoá chất dùng trong phân tích đoạn (bộ kit của Beckman Coulter). Phương pháp nghiên cứu: Tiến hành trích biệt DNA từ mẫu quệt niêm mạc má và mẫu chân tóc bằng phương pháp phenol chloroform với bộ kit trích biệt DNA của công ty Nam Khoa. Để xác định hàm lượng và độ tinh sạch của dung dịch DNA trích biệt, lấy 1 lượng nhỏ dịch trích biệt pha loãng 20 lần và sử dụng máy định lượng DNA GeneQuantPro RNA/DNA của Pharmacia, Cambridge, England (260 nm cho DNA và 280 nm cho protein) để đo (12). Kết qủa trích biệt DNA có độ tinh sạch khá cao với OD 260/280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 và hàm lượng DNA > 10ng/ul. Kỹ thuật PCR: Sau khi có trích biệt DNA, thực hiện PCR khuếch đại các đoạn STR với bộ mồi multiplex primer của Beckman Coulter. Quá trình được thực hiện với các nhiệt độ gắn mồi theo protocol của Beckman Coulter. Kỹ thuật phân tích đoạn: Sử dụng một phần nhỏ sản phẩm STR PCR đưa vào hệ thống điện di mao quản của máy CEQ 8000 và chạy bằng chương trình phân tích đoạn (1). Xử lý thống kê: Sử dụng phần mềm excell để tính tính được giá trị kích thước trung bình (Mean), độ lệch chuẩn (SD), độ tin cậy hay độ chính xác (Precision) của số liệu để đánh giá mức độ tin cậy của phương pháp xét nghiệm STR. Sử dụng phần mềm Power Stats phiên bản 1.2 của Promega để tính được các chỉ số thống kê như xác suất nhận dạng cá thể người PD (Power of Discrimination), xác suất loại 3 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 trừ PE (Power of Exclusion), chỉ số huyết thống PI (Paternity Index), xác suất trùng lắp pM (Matching Probability), tần số dị hợp tử He (Heterozygosity), tần số đồng hợp tử Ho (Homozygosity) (14). KẾT QUẢ Kết quả khảo sát độ tin cậy của xét nghiệm STR: Dựa vào kết quả tính độ tin cậy, độ chính xác của 12 locus STR, chúng tôi nhận thấy số liệu phân tích alen của tất cả 12 locus STR có độ chính xác thấp nhất là trên 99%. Điều đó có nghĩa là phương pháp xét nghiệm STR mà chúng tôi đang tiến hành có độ chính xác rất cao hơn 99%. Kết quả chỉ số thống kê tổng hợp của tất cả 12 locus STR: Xác suất trùng lắp (pM) = 5.0892877 x 10-13. Con số này cho ta biết rằng khả năng hai người bất kỳ có dấu vân tay DNA giống nhau hoàn toàn là 5.0892877 x 10-13 hay 1 trên 1.9649115 x 1012 tức là phải gần 2000 tỷ người thì mới có một người có dấu vân tay trùng khớp. Khả năng nhận dạng (PD) = 0,999999999999491. Nghĩa là phương pháp xét nghiệm STR để thực hiện dấu vân tay DNA phục vụ cho việc nhận dạng có thể người có khả năng nhận dạng chính xác hơn 99,9999999491 %. Khả năng loại trừ (PE) = 0,9999923. Chỉ số này được sử dụng trong những trường hợp xét nghiệm huyết thống. Nghĩa là dấu vân tay DNA của một người khác với một người được chọn lọc ngẫu nhiên trong quần thể là 99,99923% Chỉ số huyết thống (PI) = 90097. Chỉ số này được sử dụng trong những trường hợp xét nghiệm huyết thống. Nghĩa là số lần giống nhau giữa một đứa trẻ và một người cha sinh học là 90097 lần. Kết quả cơ sở dữ liệu về kiểu hình của 12 locus STR ở người Việt Nam được liệt kê trong bảng sau: Bảng 1: Tổng hợp tần suất alen và các chỉ số thống kê của 12 locus STR Allele CSF1PO D3S1358 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 Penta D Penta E TH01 4 5 _ _ _ _ 6 _ _ 0,003 _ 7 0,005 _ 0,011 _ 8 _ _ 0,162 9 0,033 _ 9.3 _ 10 _ TPOX _ _ _ 0,069 _ _ _ _ 0,003 _ 0,132 _ 0,005 _ _ 0,041 0,003 0,294 _ _ 0,324 0,008 _ 0,088 0,003 0,093 0,569 0,071 0,003 0,132 0,201 _ 0,332 0,016 0,396 0,110 _ _ _ _ _ _ _ _ 0.038 _ 0,198 _ 0,168 0,170 0,107 0,115 _ 0,170 0,052 0,047 0,041 11 0,321 _ 0,357 0,113 0,223 0,288 0,008 0,124 0,228 _ 0,266 12 0,374 0,016 0,198 0,107 0,148 0,272 0,074 0,140 0,129 _ 0,008 13 0,058 0,085 0,027 0,159 0,058 0,099 0,129 0,069 0,060 _ 0,005 14 0,011 0,074 0,003 0,217 0,003 0,016 0,176 0,025 0,091 _ _ 15 _ 0,286 _ 0,140 _ _ 0,239 0,005 0,077 _ _ Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Allele CSF1PO D3S1358 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 Penta D Penta E TH01 TPOX 16 _ 0.264 _ 0,077 _ _ 0,170 0,003 0,060 _ _ 17 _ 0,203 _ 0,008 _ _ 0,038 _ 0,049 _ _ 18 _ 0,058 _ 0,005 _ _ 0,058 _ 0,069 _ _ 19 _ 0,014 _ _ _ _ 0,027 _ 0,041 _ _ 20 _ _ _ _ _ 0,016 _ 0,014 _ _ 21 _ _ _ _ _ 0,033 _ 0,016 _ _ 22 _ _ _ _ _ 0,014 _ 0,011 _ _ 23 _ _ _ _ _ 0,008 _ 0,011 _ _ 24 _ _ _ _ _ 0,008 _ _ _ _ Hops 0,753 0,835 0,769 0,929 0,863 0,797 0,890 0,802 0,879 0,582 0,780 Hexp 0,713 0,145 0,791 0,105 0,773 0,088 0,849 0,051 0,791 0,086 0,779 0,091 0,854 0,046 0,811 0,057 0,893 0,025 0,592 0,227 0,727 0,123 0,855 0,895 0,912 0,949 0,914 0,909 0,954 0,943 0,975 0,773 0,877 0,660 0,760 0,740 0,830 0,760 0,740 0,840 0,790 0,880 0,530 0,690 0,514 0,666 0,543 0,854 0,720 0,593 0,775 0,603 0,753 0,270 0,563 2,020 3,030 2,170 7,000 3,640 2,460 4,550 2,530 4,140 1,200 2,280 pM PD PIC PE PI KẾT LUẬN Đề tài đã hoàn thành được 2 mục tiêu đặt ra là: 1. Ứng dụng kỹ thuật sinh học hiện đại như kỹ thuật PCR vào qui trình xét nghiệm dấu vân tay DNA trên người Việt Nam, tạo công cụ khảo sát tần suất phân bố các STR làm cơ sở dữ liệu phục vụ cho quá trình nhận dạng cá thể người. Ở mục tiêu này, đề tài đã xây dựng thành công 1 qui trình tách chiết DNA để phân tích các STR. Qui trình được phát triển bởi đề tài này có đặc điểm dễ dùng, có thể được thực hiện dễ dàng bởi một kỹ thuật viên trình độ trung cấp được huấn luyện ngắn hạn. Do vậy, qui trình để xét nghiệm STR trở thành một công cụ hữu hiệu để kiểm tra huyết thống và lập được cơ sở dữ liệu STR. 2. Ứng dụng kỹ thuật PCR STR để phát Chuyên Đề Khoa học Cơ bản triển cơ sở dữ liệu STR góp phần làm tăng khả năng nhận dạng cá thể người, tính được tần suất tương đối của các alen. Đề tài đã bước đầu hợp tác với công ty Nam Khoa để triển khai đánh giá qui trình trong thực tiễn cũng như đăng ký đưa qui trình vào danh mục các kỹ thuật được phép ứng dụng trong lĩnh vực xét nghiệm huyết thống ở nước ta. Hai ứng dụng của xét nghiệm STR nhận dạng cá thể người đã được thực hiện tại Việt Nam trong thời gian qua: Kiểm tra huyết thống: huyết thống của một đứa trẻ có thể được xác định bằng cách so sánh dấu vân tay DNA của đứa trẻ với dấu vân tay của cha mẹ hoặc người cha giả định. Khi không thể lấy dấu vân tay DNA từ một trong hai bố mẹ thì có thể lấy được dấu vân tay của những người này thông qua dấu vân tay của những người họ hàng gần. Chẩn đoán bệnh di truyền: ngoài những ứng dụng của kỹ thuật STR 5