Cải thiện khả năng biểu hiện protein Sumo-IL11 từ tế bào Escherichia coli bằng cách lựa chọn điều kiện lên men phù hợp

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 289­295<br />  DOI:     10.15625/0866­7160/v37n1se.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> CẢI THIỆN KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN PROTEIN SUMO­IL11 <br /> TỪ TẾ BÀO Escherichia coli BẰNG CÁCH LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN LÊN MEN <br /> PHÙ HỢP<br /> <br /> Nguyễn Thị Quý, Dương Thu Hương, Đặng Thị Ngọc Hà, <br /> Lê Thị Thu Hồng, Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải*<br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam *tnhai@ibt.ac.vn <br /> <br /> TÓM TẮT: Vi khuẩn Escherichia coli thường được sử dụng để sản xuất các loại protein tái tổ <br /> hợp cho mục đích nghiên cứu và thương mại. Sự tích lũy protein tái tổ  hợp phụ thuộc vào mật <br /> độ tế bào cuối cùng và hoạt tính riêng của protein. Một trong những cách cải thiện mức độ tổng  <br /> hợp protein là kiểm soát chặt chẽ điều kiện lên men. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết  <br /> quả  nghiên cứu  ảnh hưởng của các yếu tố  lên men đến mật độ  tế  bào và khả  năng biểu hiện <br /> protein SUMO­IL11 của tế bào E. coli. Môi trường TB là môi trường giàu dinh dưỡng và có đệm  <br /> phosphate nên protein SUMO­IL11 được biểu hiện tốt nhất. Mật độ  tế  bào và protein SUMO­<br /> IL11 tăng lên đáng kể khi tế bào được cảm ứng ở 37 oC với nồng độ IPTG 0,05 mM ở thời điểm  <br /> cảm ứng OD600=2. Dưới những điều kiện này, mật độ tế bào đã tăng lên 9,4 lần (từ OD 600=2,07 <br /> lên 19,48). Lượng protein SUMO­IL11 tạo ra đạt 1,43 g/l, tăng gấp 14,3 lần so với ban đầu và <br /> chiếm 6,8% protein tổng số.<br /> Từ khóa: Escherichia coli, biểu hiện protein, protein tái tổ hợp, protein SUMO­IL11.<br /> <br /> MỞ ĐẦU ứng…   luôn  là   các   yếu  tố   tác   động   đáng  kể <br /> đến sự biểu hiện của protein tái tổ hợp và sinh  <br /> Gần   đây,  Escherichia   coli  là   đối   tượng <br /> khối tế  bào [1]. Vì vậy, trước khi lên men  ở <br /> chính để  biểu hiện protein tái tổ hợp vì chúng <br /> quy mô lớn người ta đều thăm dò những yếu <br /> có tốc độ  sinh trưởng nhanh, dễ  nuôi cấy trên <br /> tố   thích   hợp   nhằm   nâng   cao   năng   suất   của  <br /> môi   trường   không   đắt   tiền,   việc   thu   hồi  <br /> protein đích.<br /> protein tái tổ  hợp không quá phức tạp và các <br /> chủng đều có sẵn trên thị  trường. Tuy nhiên,  Interleukin­11   người   (IL­11)   là   một <br /> protein tái tổ hợp thường biểu hiện  ở mức độ  cytokine đa chức năng, nó kích hoạt các tiền tế <br /> thấp  nên   việc  biểu  hiện   protein   cần   có  quá  bào   tạo   máu  và   các   yếu  tố   sinh  trưởng   tạo <br /> trình tối  ưu để  thu được nhiều sản phẩm có  máu khác để biệt hóa và thành thục các tế bào <br /> hoạt tính trên một đơn vị  thể tích và thời gian  đại bào hay còn gọi là megakaryocytes (chịu  <br /> [2]. Có nhiều phương pháp khác nhau nhằm  trách nhiệm chính trong sản xuất tiểu cầu). Ở <br /> cải thiện sự biểu hiện của protein tái tổ hợp là   bài báo trước, chúng tôi đã trình bày kết quả <br /> sử  dụng các vector biểu hiện phù hợp hoặc  tạo chủng  E. coli  Rosetta 2 biểu hiện protein  <br /> các chủng có thêm tRNA cho mã hiếm, thiết   IL­11  dung hợp với protein SUMO. Kết quả <br /> kế  chủng biểu hiện, điều hòa quá trình phiên  khảo sát ban đầu cho thấy protein SUMO­IL11 <br /> mã và dịch mã. Ngoài ra, kỹ  thuật biểu hiện  biểu hiện mạnh và đặc biệt protein ở dạng tan <br /> gen dưới dạng dung hợp hay đồng biểu hiện   trong tế  bào. Tuy nhiên, mật độ  tế  bào sau 4 <br /> với   chaperones   cũng   làm   tăng   hiệu   quả   sự  giờ  cảm  ứng không cao. Để  thu được nhiều  <br /> tổng hợp protein đích  ở  tế  bào chủ. Phương   protein SUMO­IL11 cho những nghiên cứu sau <br /> pháp hiện nay được sử dụng phổ biến nhất là  này,   cần   phải   khảo   sát   một   số   yếu   tố   ảnh <br /> nâng cao sinh khối tế  bào bằng kỹ  thuật lên  hưởng lên quá trình biểu hiện gen  ở  bình tam <br /> men. Trong đó, thành phần môi trường, nồng  giác.   Do   đó,   chúng   tôi   đã   thăm   dò   sự   ảnh <br /> độ  chất  cảm  ứng,  nhiệt  độ,  thời  điểm  cảm  hưởng của thành phần môi trường, nồng độ <br /> <br /> <br /> 33<br /> IPTG, nhiệt độ, thời điểm cảm  ứng đến khả  tế bào E. coli Rosetta 2 được khảo sát như sau: <br /> năng biểu  hiện  protein  SUMO­IL11 trong   E.   Tế   bào mang  plasmid  SUMO­il11  được   nuôi <br /> coli Rosetta 2. cấy  ở   37oC  qua   đêm   trong  môi   trường  LBA <br /> (môi trường LB có chứa 100 µg/ml ampicillin). <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Dịch tế bào được chuyển sang 9 bình tam giác <br /> Chủng E. coli Rosetta 2 được dùng để biểu  100 ml, mỗi bình chứa 10 ml môi trường lên <br /> hiện protein. Vector SUMO­il11 do nhóm tác  men (các môi trường đã được mô tả   ở  phần <br /> giả  Nguyễn Thị  Quý và nnk. (2014) thiết kế  Vật  liệu)  sao  cho  OD600=0,1.  Các  mẫu  được <br /> [5]   được   dùng   làm   vector   biểu   hiện   protein   nuôi tiếp  ở  cùng điều kiện trong khoảng thời <br /> dung hợp SUMO­IL11. gian 1,5 giờ  để  OD600 đạt từ  0,4 đến 0,8. Sau <br /> đó các mẫu được cảm ứng bằng cách bổ sung <br /> Các môi trường dùng cho lên men gồm: LB   IPTG đến nồng độ cuối cùng là 0,5 mM và lắc  <br /> (yeast extract 0,5%, peptone 1%, NaCl 1%), TB  tiếp ở 30oC trong 4 giờ. Sau khi nuôi cấy cảm  <br /> (peptone 1,2%, yeast extract 2,4%, K2HPO4  72  ứng, mật độ tế bào được ghi lại. Tế bào được  <br /> mM,   KH2PO4  17   mM,   glycerol   0,4%),   SB  đưa về  OD600=10 và điện di biến tính trên gel <br /> (peptone 3,2%, yeast extract 2%, NaCl 0,5%),  SDS­PAGE 14% để  xác định môi trường nào <br /> M9   (NaH2PO4  0,6%,   KH2PO4  0,3%,   NaCl  giúp protein SUMO­IL11 biểu hiện tốt nhất. <br /> 0,05%, NH4Cl 0,1% và các yếu tố  vi lượng),  <br /> M9 + 1% glucose, M9 + 1% glycerol, M9 + 0,5  Sau khi tìm ra môi trường phù hợp, sự biểu <br /> yeast extract, M9 + 1% glucose + 0,5% yeast  hiện protein SUMO­IL11 tiếp tục được khảo <br /> extract   và   M9   +   1%   glycerol   +   0,5%   yeast  sát trên môi trường đó với nồng độ  IPTG từ <br /> extract.   Các   môi   trường   được   khử   trùng   ở  0,05 – 2 mM để  tìm nồng độ  IPTG thích hợp. <br /> 121oC, 1 atm, 30 phút, để  nguội về  nhiệt độ  Tương  tự   như  vậy,  sự   biểu hiện protein và <br /> phòng trước khi sử  dụng. Các hóa chất khác  mật độ tế bào tiếp tục được đánh giá trên các  <br /> dùng cho điện di protein, nhuộm Coomassie có  yếu tố  còn lại là nhiệt độ  và thời điểm cảm <br /> xuất  xứ  từ  hãng  Merck (Đức),  thang protein   ứng.   Protein   tổng   số   được   đo   bằng   máy <br /> chuẩn của hãng Fermentas (Đức). Kháng thể 1  NanoDrop   của   hãng   IMPLEN   (Đức).   Protein <br /> đơn   dòng   kháng   IL­11   được   mua   của   hãng  SUMO­IL11 từ dịch lên men được định lượng <br /> Acris Antibodies (Mỹ). Kháng thể  2 cộng hợp  bằng phương pháp ELISA.<br /> enzyme peroxidase được mua của hãng Sigma <br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> (Hoa Kỳ).<br /> Từng điều kiện  ảnh hưởng đến mức độ  Ảnh   hưởng   của   thành   phần   môi   trường  <br /> biểu hiện protein dung hợp SUMO­IL11 của   đến sự biểu hiện protein SUMO­IL11<br /> <br /> a b Mật độ tế bào thời điểm thu mẫu của chủng E. coli  tái tổ hợp trong <br /> các môi trường khác nhau<br /> 2.500<br /> <br /> <br /> kDa 2.000<br /> <br /> 116,0<br /> OD600 thu mẫu<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 1.500<br /> 66,2<br /> 1.000<br /> 45,0<br /> SUMOIL­11 0.500<br /> 35,0<br /> 0.000<br /> 25,0 LB M9 M9 +1% M9 + M9 + M9 + M9 + TB SB<br /> glucose 1% 0,5% 1% 1%<br /> glycerol YE glucose glycerol<br /> SUMO 18,4 + 0,5% + 0,5%<br /> YE YE<br /> 14,4 Môi trường<br /> <br /> Hình 1. Protein tổng số biểu hiện từ 9 mẫu môi trường (a) và mật độ  tế bào sau 4 giờ cảm ứng <br /> <br /> <br /> 34<br /> IPTG (b). ĐC: Dòng đối chứng mang vector SUMO; M: thang protein chuẩn (Fermentas); YE:  <br /> yeast extract<br /> <br /> Mỗi loại protein được tổng hợp ở mức độ  môi trường còn lại đều chứa cả nguồn nitơ và <br /> khác nhau trong môi trường khác nhau nên cần  carbon nên mật độ  tế  bào đã được cải thiện  <br /> thăm dò thành phần môi trường phù hợp nhằm  hơn. Đặc biệt trong điều kiện nuôi cấy bằng <br /> nâng cao sinh khối tế  bào và sản lượng riêng  môi trường TB protein SUMO­IL11 được tổng <br /> của protein. Vì vậy, chúng tôi đã khảo sát sự  hợp nhiều nhất và có mật độ  tế  bào cao nhất  <br /> biểu hiện protein SUMO­IL11 của tế  bào  E.  nên đây là môi trường phù hợp cho sự  biểu <br /> coli Rosetta 2 trong 9 môi trường lên men. Kết  hiện protein. Lý do vì TB là môi trường giàu <br /> quả  điện di protein tổng số  trên hình 1a cho  dinh dưỡng, ngoài peptone và yeast extract cao  <br /> thấy protein SUMO­IL11 (~ 37 kDa) biểu hiện   hơn   LB,   môi   trường   này   còn   có   thêm   0,4%  <br /> ở  cả  9 môi trường nghiên cứu. Đặc biệt băng  glycerol cần thiết cho tế  bào tăng sinh khối.  <br /> SUMO­IL11   biểu   hiện   đậm   nhất   ở   môi  Đồng thời đệm phosphate có khả  năng kiểm <br /> trường TB. Mẫu đối chứng (ĐC) chỉ xuất hiện  soát sự thay đổi của pH môi trường đã giúp tế <br /> một băng protein SUMO (~ 18 kDa) vì đây là  bào sinh trưởng thuận lợi và biểu hiện protein <br /> dòng tế  bào chứa vector SUMO không mang  SUMO­IL11. <br /> gen ngoại lai. Ảnh   hưởng   của   nồng   độ   IPTG   đến   sự <br /> Hình 1b cho thấy thành phần môi trường  biểu hiện protein SUMO­IL11<br /> cũng  ảnh hưởng  đến sự  sinh trưởng của  tế <br /> Theo Savvas (1996) [6], ngoài thành phần <br /> bào. Mật độ tế bào ở những môi trường M9 và <br /> môi trường,   nồng độ  chất cảm  ứng cũng là <br /> M9 chỉ có nguồn carbon glucose hoặc glycerol  <br /> một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến mật độ <br /> thấp nhất. Các môi trường còn lại là TB, SB,  <br /> tế  bào và sự  biểu hiện gen ngoại lai. Vì vậy,  <br /> LB, M9 có nitơ  và carbon đều có mật độ  tế <br /> việc   thăm   dò   nồng   độ   chất   cảm   ứng   có   ý  <br /> bào   cao   hơn.   Lý   do   là   trong   quá   trình   sinh <br /> nghĩa thiết thực cho quá trình sản xuất. Sau  <br /> trưởng, tế  bào cần nguồn carbon và nitơ  để <br /> khi xác định được TB là môi trường biểu hiện <br /> tổng   hợp   protein,   AND,   ARN   và   tăng   sinh <br /> phù   hợp,   chúng   tôi   kiểm   tra   khả   năng   sinh <br /> khối. Môi trường M9 là môi trường tối thiểu <br /> tổng  hợp   protein  SUMO­IL11  của   tế   bào  E. <br /> chỉ   chứa   các   muối   khoáng   cần   thiết   cho   vi  <br /> coli với nồng độ IPTG 0,05, 0,1, 0,3, 0,5, 1, 1,5 <br /> khuẩn   phát   triển.   Do   không   được   bổ   sung <br /> và 2 mM. Kết quả từ hình 2a cho thấy, protein <br /> thêm nguồn carbon và nitơ  hoặc chỉ thêm mỗi <br /> SUMO­IL11   biểu   hiện   nhiều   nhất   nhất   ở <br /> nguồn   carbon   nên   vi   khuẩn   chỉ   tăng   trưởng <br /> nồng độ  IPTG từ  0,05 đến 0,3 mM. Khi tăng <br /> đến một giới hạn nhất định. Vì thế mật độ  tế <br /> IPTG từ  0,5 mM trở  lên thì băng SUMO­IL11 <br /> bào   ở   nhóm   môi   trường   M9,   M9   +   glucose <br /> tạo ra ít hơn.<br /> hoặc glycerol là thấp nhất. Trong khi đó nhóm <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 35<br /> Hình 2. Protein tổng số  biểu hiện từ   E. coli  Rosetta 2 mang vector SUMO­il11 được cảm  ứng <br /> nồng độ IPTG khác nhau. a) tế bào đưa về cùng giá trị OD=10; b) điện di theo OD 600 đo được tại <br /> thời điểm thu mẫu; M: thang protein chuẩn (Fermentas)<br /> <br /> Bảng 1. Mật độ tế bào của chủng E. coli tái tổ hợp ở nồng độ IPTG khác nhau<br /> Nồng độ IPTG (mM) 0,05 0,1 0,3 0,5 1,0 1,5 2,0<br /> OD600 thu mẫu 5,084 2,460 1,780 1,776 1,664 1,572 1,692<br /> Như  vậy, tế  bào được cảm  ứng từ  nồng   sinh  trưởng  chậm  lại,  do  đó  mật độ   tế   bào <br /> độ  0,05 mM tới 0,3 mM biểu hiện protein tốt   thấp và protein tạo ra cũng giảm đi. <br /> nhất.   Tuy   nhiên,   để   xác  định   nồng   độ   thích  Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biểu hiện <br /> hợp nhất trong khoảng này, chúng tôi so sánh  protein SUMO­IL11<br /> mật độ tế bào (OD600) từ 3 mẫu cảm ứng 0,05;  <br /> 0,1 và 0,3 mM với nhau. Kết quả trên bảng 1   Nhiệt độ nuôi cấy luôn là một trong những <br /> cho  thấy,   mẫu   0,05   mM   IPTG   có   OD600  cao  yếu tố  quan trọng hàng đầu  ảnh hưởng đến <br /> gấp đôi so với mẫu 0,1 mM. Đây cũng là mẫu   hiệu   suất   và   chất   lượng   protein   tái   tổ   hợp. <br /> có mật độ  tế  bào cao nhất trong cả  dải nồng   Theo nhiều tác giả, nhiệt độ cao tác động đến <br /> độ IPTG đã khảo sát. Do protein tổng số được  các   quá   trình   trong   tế   bào,   ảnh   hưởng   đến <br /> tra vào giếng với cùng một lượng tế  bào như  năng suất  và chất  lượng protein. Theo Chou <br /> nhau (OD=10) nên khi băng protein ở các giếng  (2007) [3], protein biểu hiện  ở  nhiệt  độ  cao  <br /> đậm như  nhau thì mẫu nào có OD600  cao hơn  thường ở  thể vùi không có hoạt tính sinh học. <br /> sẽ   có   lượng   protein   nhiều   hơn.   Vì   băng  Cũng theo Lee & Lee (2002) [4], nhiệt độ càng <br /> SUMO­IL11   ở   mẫu   0,05   mM   ít   hơn   không  cao, lượng mRNA càng dễ bị phân hủy và khả <br /> đáng kể so với mẫu 0.1 mM nhưng ngược lại   năng đào thải plasmid càng lớn. Thông thường, <br /> OD600 của mẫu 0,05 mM cao hơn gấp đôi. Do  ở  37 C tế  bào  E. coli  sinh trưởng tốt nhất và <br /> o<br /> <br /> <br /> đó  lượng  SUMO­IL11  ở   mẫu  0,05  mM  theo  quá trình biểu hiện protein cũng diễn ra mạnh  <br /> ước tính sẽ cao hơn mẫu 0,1 mM gấp khoảng  mẽ  nhất. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã <br /> 2   lần.   Kết   quả   điện   di   protein   theo   giá   trị  khảo sát sự biểu hiện của protein SUMO­IL11  <br /> OD600 đo tại thời điểm thu mẫu từ hình 2b đã   ở  20, 25, 30, 37 và 40 C. Qua giá trị  OD600  ở <br /> o<br /> <br /> <br /> phản ánh đúng như mong đợi. Như  vậy, nồng  thời điểm thu mẫu sau 4 giờ  cảm  ứng (bảng  <br /> độ  0,05 mM IPTG là phù hợp nhất cho tế bào   2), chúng tôi thấy nhiệt độ đã ảnh hưởng đến <br /> biểu   hiện   protein   SUMO­IL11.   Cảm   ứng   tế  mật độ tế bào. Các mẫu cảm ứng từ 25 C đến <br /> o<br /> <br /> <br /> bào ở nồng độ IPTG quá thấp sẽ hạn chế tốc   37 C có OD600 cao nhất hay mật độ tế bào cao <br /> o<br /> <br /> <br /> độ phiên mã, ảnh hưởng tới năng suất protein.  nhất. Trong khi đó tăng nhiệt độ  lên 40 C thì <br /> o<br /> <br /> <br /> Ở nồng độ IPTG cao, tế bào trở lên mẫn cảm  mật độ  tế  bào bị  giảm đi. OD600  từ  mẫu cảm <br /> ứng ở 20oC chỉ bằng một nửa so với mẫu nuôi <br /> <br /> 36<br /> ở  25­37oC chứng tỏ   ở  nhiệt  độ  thấp tốc  độ  sinh trưởng của tế bào diễn ra chậm hơn.<br /> <br /> a b<br /> Nhiệt độ (o C) 20o C 25oC 30o C 37o C 40o C<br /> kDa M 20 25 30 37 40 TS T C TS T C TS T C TS T C TS T C<br /> 116,0 Hình 3. Protein từ chủng E. coli <br /> 66,2 Rosetta 2 mang vector SUMO­<br /> 45,0 il11 biểu hiện  ở   các   nhiệt  độ <br /> 35,0 khác nhau<br /> 25,0<br /> (a)  protein  tổng số;   (b)  mẫu siêu <br /> 18,4<br /> âm phá tế bào. TS: protein tổng số; <br /> T: pha tan; C: pha không tan ;  M: <br /> 14,4<br /> thang protein chuẩn (Fermentas)<br /> <br /> Bảng 2. Mật độ tế bào E. coli ở nhiệt độ cảm ứng khác nhau<br /> Nhiệt độ cảm ứng 20oC 25oC 30oC 37oC 40oC<br /> OD600 thu mẫu 2,430 5,730 5,080 5,330 4,120<br /> <br /> Nhiệt   độ   cũng   ảnh   hưởng   đến   lượng  miễn dịch cao do không bị  biến đổi cấu trúc.  <br /> protein SUMO­IL11 tích lũy. Hình 3a cho thấy,  Vì vậy, để  đánh giá sơ  bộ  nhiệt độ  có  ảnh <br /> tế   bào   cảm   ứng   ở   37oC   biểu   hiện   protein  hưởng   đến   tính   tan   của   protein   SUMO­IL11 <br /> SUMO­IL11   nhiều   nhất   (băng   protein   đậm  hay không, chúng tôi đã kiểm tra protein  ở pha <br /> nhất). Trong khi đó tế bào cảm ứng ở nhiệt độ  tan và không tan của tế bào. Hình 3b cho thấy,  <br /> thấp hoặc cao hơn 37oC đều biểu hiện protein  phần lớn protein SUMO­IL11  đều  ở  pha tan <br /> SUMO­IL11   ít   hơn.   Trạng   thái   tồn   tại   của  khi biểu hiện  ở  20, 25, 30, 27 và 40oC. Như <br /> protein   tái   tổ   hợp   là   một   trong   những   điều  vậy, đối với thí nghiệm này, 37oC là nhiệt độ <br /> kiện rất quan trọng  ảnh hưởng đến hoạt tính  mà tế bào sinh trưởng tốt nhất cũng như biểu  <br /> của protein. Thông thường, các protein ở dạng  hiện protein nhiều nhất và protein ở trạng thái <br /> tan sẽ giữ được hoạt tính sinh học và tính sinh  tan.<br /> <br /> a b<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> SUMO­IL11<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. Kết quả điện di protein tổng số (a) và mật độ tế bào thu mẫu (b) <br /> ở thời điểm cảm ứng khác nhau. M: thang protein chuẩn (Fermentas).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 37<br />  So sánh các thông số trước và sau khi khảo sát điều kiện lên m en<br /> men   đến   lượng   protein   SUMO­IL11   tạo   ra,  <br /> 25.00<br /> 20.84 chúng tôi xác định hàm lượng protein SUMO­<br /> 19.48<br /> 20.00<br /> IL11 trong dịch lên men tổng trước và sau khi <br /> 15.00 tối  ưu bằng phương pháp ELISA. Kết quả  từ <br /> Mức tăng<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Trước tối ưu<br /> Sau tối ưu hình 5 cho thấy, mật độ tế bào (OD 600) sau khi <br /> 10.00<br /> 6.86<br /> tối   ưu   đã   tăng   hơn   9   lần.   Đặc   biệt   lượng  <br /> 5.00<br /> 2.07 1.43<br /> 3.21 3.20<br /> protein SUMO­IL11 tạo ra từ tế bào là 1.43 g/l,  <br /> 0.10<br /> 0.00 tăng gấp 14,3 lần so với thời  điểm ban  đầu <br /> OD600 SUMO-IL11 Protein tổng số Tỷ lệ SUMO-<br /> (g/l) (g/l) IL11/Protein trước   khi   tiến   hành   khảo   sát   điều   kiện   lên <br /> men. Ngoài ra tỷ lệ phần trăm protein SUMO­<br /> tổng số (%)<br /> Thông số<br /> <br /> Hình   5.  Kết   quả   đánh   giá   lượng   protein  IL11 so với protein tổng số cũng tăng từ  3,2%  <br /> SUMO­IL11 trước và sau khi lựa chọn được  tới 6,8%. Kết quả  thí nghiệm chứng tỏ  việc <br /> điều kiện lên men phù hợp cho tế bào E. coli. kiểm soát chặt chẽ  các điều kiện lên men đã <br /> cải thiện đáng kể sản lượng riêng của protein  <br /> Ảnh hưởng của thời điểm cảm ứng đến sự  SUMO­IL11 và sinh khối tế bào.<br /> biểu hiện protein SUMO­IL11<br /> KẾT LUẬN<br /> Thông thường,  thời  điểm  cảm  ứng thích <br /> hợp đối với tế  bào  E. coli  từ  OD600=0,6­0,8.  Sau khi khảo sát từng yếu tố   ảnh hưởng  <br /> Với những protein kém bền, kết vón, bị  phân  đến   khả   năng   biểu   hiện   protein   dung   hợp  <br /> cắt   thì   thời   điểm   cảm   ứng   được   tiến   hành  SUMO­IL11   của   tế   bào  E.   coli  Rosetta   2, <br /> sớm hơn. Để tìm mật độ tế bào thích hợp cho   chúng tôi đã cải thiện được mức độ biểu hiện  <br /> gen  il­11  biểu hiện, tế  bào  E. coli  được cảm  protein và sinh khối tế  bào  ở  bình tam giác. <br /> ứng  từ   OD600=0,4­4.   Hình  4a  cho  thấy,   băng  Lượng protein SUMO­IL11 tăng từ 0,1 g/l  lên <br /> SUMO­IL11 biểu hiện  ở  tất cả các mẫu cảm  1,43 g/l dịch tế  bào. Mật độ  tế  bào tăng từ  2  <br /> ứng từ mật độ thấp đến cao. Tuy nhiên ở mật   tới 19,48 sau khi tìm được điều kiện biểu hiện  <br /> độ  tế  bào OD600=3,5 và 4 thì protein SUMO­ tối  ưu. Nghiên cứu này tạo điều kiện thuận  <br /> IL11 biểu hiện kém đi, băng protein hẹp hơn   lợi   cho   lên   men   trên   quy   mô   lớn,   cung   cấp <br /> các mẫu còn lại. Ngoài ra, cần phải xem xét  protein tổng số cho các nghiên cứu tiếp theo.<br /> thời điểm cảm  ứng tác động như  thế  nào đến  Lời cảm ơn: Bài báo được thực hiện từ nguồn <br /> mật độ tế bào thu mẫu. Hình 4b cho thấy mật   kinh phí của đề tài độc lập cấp nhà nước do Bộ <br /> độ  tế  bào phụ  thuộc chặt chẽ  vào thời điểm  Khoa học và Công nghệ  quản lý “Nghiên cứu <br /> cảm   ứng.   Giá   trị   OD600  bắt   đầu   tăng   từ   lúc  sản   xuất   Interleukin­3   và   Interleukin­11   tái   tổ <br /> cảm ứng OD600=0,4 và đạt cao nhất ở OD600=2  hợp chất lượng cao dùng trong y học (điều trị)” <br /> (OD thu mẫu tăng từ  6,11 đến 19,48) nghĩa là  giai đoạn 2013­2015. Công trình được thực hiện <br /> mật độ  tế  bào đã tăng khoảng 3,2 lần. Lý do   nhờ  trang thiết bị  của Phòng thí nghiệm Trọng  <br /> được cho là thời điểm cảm  ứng sớm (OD600  2) có thể  TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> là   lúc   tế   bào   đã   bắt   đầu   bước   vào   pha   cân <br /> 1. Blommel P. G., Becker K. J., Duvnjak P., <br /> bằng nên sức sống giảm, một số  tế  bào chết <br /> Fox B. G., 2007. Enhanced bacterial protein <br /> nên OD600 thu mẫu giảm dần. <br /> expression   during   auto­induction   obtained <br /> Đánh giá lượng SUMO­IL11 trước và sau  by   alteration   of   lac   repressor   dosage   and <br /> khi lựa chọn điều kiện lên men phù hợp medium composition. Biotechnol. Prog., 23: <br /> Để  đánh giá  ảnh hưởng của điều kiện lên  585­598.<br /> <br /> <br /> 38<br /> 2. Broedel S. E., Papciak S. M., Jones W. R.,  Theories  and Applications  of  Chem.  Eng., <br /> 2001.   The   selection   of   optimum   media  8: 246­359.<br /> formulations   for   improved   expression   of  5. Nguyen   Thi   Quy,   Le   Ngoc   Giang,   Le <br /> recombinant   proteins   in  E.   coli.   Technical  Quynh Giang, Duong Thu Huong, Dang Thi <br /> Bulletin ­ Athena Enzyme System Group, 2:  Ngoc Ha, Do Thi Huyen, Le Thi Thu Hong, <br /> 1­8. Truong   Nam   Hai,   2014.   Expression   of <br /> 3. Chou   C.   P.,   2007.   Engineering   cell  recombinant   human   interleukin­11   as <br /> physiology to enhance recombinant protein  soluble form in Escherichia coli. Journal of <br /> production   in   Escherichia   coli.   Appl.  Biotechnology, 12(3): 417­422.<br /> Microbiol. Biotechnol., 76: 521­532. 6. Savvas   C.   M.,   1996.   Strategies   for <br /> 4. Lee S. J., Lee S. Y., 2002. Efficient high­ achieving high­level expression of genes <br /> level   production   of   spider   silk   protein   by  in  Escherichia   coli.   Am.   Soc. <br /> fed­batch   cultivation   of   recombinant  Microbiol., 60(3): 512­538.<br /> Escherichia   coli   and   its   purification. <br /> <br /> <br /> <br /> THE SELECTION OF OPTIMUM FERMENTATION CONDITION <br /> FOR IMPROVED EXPRESSION OF SUMO­IL11 IN Escherichia coli<br /> <br /> Nguyen Thi Quy, Duong Thu Huong, Dang Thi Ngoc Ha, <br /> Le Thi Thu Hong, Do Thi Huyen, Truong Nam Hai<br /> Institute of Biotechnology, VAST<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Escherichia coli  is routinely used for the production of recombinant proteins for research purposes and for <br /> commercial applications. The level of intracellular accumulation of a recombinant protein is dependent on the <br /> final cell density and the specific activity of the protein. One of several strategies typically used to increase  <br /> recombinant protein production is well control of fermentation condition. In our previous publication, we <br /> showed the preliminary expression of SUMO­IL11 protein in  E. coli  Rosetta 2. As expected, recombinant <br /> protein was well expressed as soluble form. However, the cell density at 600 nm was about 2 after 4 hours of  <br /> IPTG induction. In this paper, we present the effect of fermentation factors on the expression level of SUMO­<br /> IL11 protein and cell density in E. coli Rosetta 2. SUMO­IL11 was highest expressed in TB owing to its rich <br /> medium and phosphate buffer for controlling pH fluctuation. The cell density and protein amount increased <br /> significantly when the cells were induced with 0.05 mM IPTG at 37 oC and the induction time of OD600=2. <br /> Under these optimum conditions, the cell density increased 9,4 folds (OD 600=19.48 compared to 2.07). Protein <br /> amount of SUMO­IL11 synthesized by  E. coli  reached to 1.43 g/l or raised 14.3 folds. The SUMO­IL11 <br /> content accounted for 6.8% of the total protein in the cells.<br /> Keywords: Escherichia coli Rosetta 2, IPTG, high cell density, SUMO­IL11 protein, media composition.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 22­10­2014<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 39<br />