Đánh giá giá trị của HOS test trên các mẫu tinh trùng bất động

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> ĐÁNH GIÁ GIÁ TRỊ CỦA HOS TEST<br /> TRÊN CÁC MẪU TINH TRÙNG BẤT ĐỘNG<br /> Nguyễn Thị Thanh Thảo*; Nguyễn Khang Sơn*<br /> TÓM TẮT<br /> Nghiên cứu đánh giá giá trị của HOS test (Hypo-Osmotic Swelling Test, HOS test, HOST)<br /> trên các mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, chúng tôi nhận thấy:<br /> - Loại dung dịch áp lực thẩm thấu tối ưu cho nghiệm pháp 50% nước cất/50% môi trường<br /> G-IVF. Phản ứng HOS test xảy ra ngay sau khi tinh trùng tiếp xúc với dung dịch thử, phản ứng<br /> đầy đủ nhất sau 30 phút.<br /> - Với độ nhạy 73,9%, độ đặc hiệu 94,1%, giá trị tiên đoán dương tính 87,4%, HOS test là<br /> nghiệm pháp đáng tin cậy cho việc lựa chọn tinh trùng sống trong các mẫu tinh trùng bất động<br /> hoàn toàn, phục vụ kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương no n (ICSI - Intra Cytoplasmic<br /> Sperm Injection).<br /> * Từ khóa: Tinh trùng bất động; HOS test; Tiêm tinh trùng vào bào tương no n.<br /> <br /> Evaluate the Value of Hypo-Osmotic Swelling Test on Immotile<br /> Spermatozoa Samples<br /> Summary<br /> The study evaluated the value of HOS test for identifying viable sperms on completely immotile<br /> spermatozoa samples, we found that:<br /> - The optimal hypo-osmotic swelling test solution was 50% distilled water/50% G-IVF medium.<br /> HOS test reaction occurred immediately after sperms contacted with the test solution, optimum<br /> sperm reaction after 30 minutes.<br /> - With a sensitivity of 73.9%, a specificity of 94.1%, a positive predictive value of 87.4%, HOS test<br /> is a reliable test to select viable sperms from completely immotile spermatozoa samples for ICSI.<br /> * Keywords: Immotile spermatozoa samples; HOS test; Intracytoplasmic sperm injection.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Khi đưa tế bào vào trong môi trường<br /> áp lực thẩm thấu thấp (môi trường nhược<br /> trương), nước sẽ đi vào trong tế bào để<br /> cân bằng áp lực giữa bên trong và bên<br /> ngoài màng tế bào; tế bào nào sống với<br /> chức năng màng còn nguyên sẽ có biểu<br /> <br /> hiện trương phồng lên. Ứng dụng điều<br /> này, năm 1984 Jeyendran và CS đ tiến<br /> hành sử dụng dung dịch áp lực thẩm<br /> thấu thấp để đánh giá tính toàn vẹn<br /> màng bào tương tinh trùng. Trong môi<br /> trường áp lực thẩm thấu thấp, tinh trùng<br /> sống sẽ có biểu hiện cuộn và phồng đuôi.<br /> <br /> * Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn khang sơn (khangson@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/08/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017<br /> <br /> 94<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> Ban đầu HOS test chỉ được dùng để đánh<br /> giá tỷ lệ sống chết trong mẫu tinh dịch,<br /> sau đó được dùng để đánh giá khả năng<br /> thụ tinh của mẫu tinh trùng. Với sự phát<br /> triển mạnh mẽ của ngành hỗ trợ sinh sản<br /> hiện nay, HOS test có vai trò quan trọng<br /> trong phát hiện tinh trùng sống trong mẫu<br /> tinh trùng bất động hoàn toàn với mục<br /> đích sử dụng tinh trùng sống để tiêm vào<br /> bào tương của noãn (ICSI). Việc kết hợp<br /> HOS test với ICSI làm tăng hiệu quả của<br /> chu kỳ ICSI với mẫu tinh trùng bất động<br /> hoàn toàn [1, 2].<br /> <br /> của Traphaco (Việt Nam). Eosin Y của<br /> Merck (CHLB Đức). Các ống Falcon của<br /> Corning (Hoa Kỳ). Pipet, lam, lamen, lọ vô<br /> trùng đựng tinh dịch, đầu côn. Tủ ấm,<br /> kính hiển vi.<br /> <br /> Có nhiều loại dịch áp lực thẩm thấu<br /> thấp khác nhau, thời gian ủ như thế nào<br /> là thích hợp cho phản ứng, giá trị của<br /> HOS test trên mẫu tinh trùng bất động<br /> hoàn toàn cũng chưa được nghiên cứu<br /> nhiều và sâu. Với mong muốn đánh giá<br /> một cách đầy đủ giá trị của HOS test trên<br /> mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, làm<br /> tăng tỷ lệ thành công trong các chu kỳ thụ<br /> tinh trong ống nghiệm, đặc biệt với mẫu<br /> tinh trùng bất động hoàn toàn, chúng tôi<br /> thực hiện nghiên cứu này nhằm: Đánh giá<br /> giá trị của HOS test trên các mẫu tinh trùng<br /> bất động.<br /> <br /> + Dung dịch 1 (DD1): tỷ lệ nước cất/môi<br /> trường 25%/75%.<br /> <br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> Mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn của<br /> 37 người đàn ông.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất:<br /> Môi trường G-IVF (gọi tắt là môi trường)<br /> của Vitrolife (Thụy Điển). Nước cất tiêm<br /> <br /> * Quy trình nghiên cứu:<br /> - Bước chuẩn bị:<br /> + Thu thập mẫu nghiên cứu: thu thập<br /> mẫu tinh dịch vào lọ nhựa vô trùng, để ly<br /> giải hoàn toàn ở 37oC trước thí nghiệm.<br /> + Tạo 3 nhóm dung dịch HOS test áp<br /> lực thẩm thấu thấp với mức khác nhau.<br /> <br /> + Dung dịch 2 (DD2): tỷ lệ nước cất/môi<br /> trường 50%/50%.<br /> + Dung dịch 3 (DD3): tỷ lệ nước cất/môi<br /> trường 75%/25%.<br /> + Dung dịch 4 (DD4): tỷ lệ nước cất/môi<br /> trường 100%/0%.<br /> - Bước 1: sau khi tinh dịch đ ly giải<br /> hoàn toàn, tiến hành đánh giá chất lượng<br /> mẫu tinh dịch theo quy trình thường quy,<br /> gồm các thông số mật độ, tỷ lệ sống chết<br /> bằng nhuộm eosin, độ di động, hình thái<br /> theo WHO (2010) [3]. Những mẫu bất<br /> động 100% sẽ được tiếp tục thí nghiệm.<br /> - Bước 2: nghiên cứu lựa chọn loại dung<br /> dịch HOS test phù hợp, thời gian tối ưu<br /> khi ủ tinh trùng trong dung dịch HOS test.<br /> - Cho 0,1 ml tinh dịch vào ống Falcon<br /> đựng sẵn 1 ml DD1 đ ủ ấm, trộn đều bằng<br /> pipet, ủ ấm.<br /> - Sau 1 phút, nhỏ 10 µl hỗn dịch lên<br /> lam kính, đếm số lượng tinh trùng có phản<br /> ứng HOS test dương tính trong tổng số<br /> 95<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> 200 tinh trùng dưới kính hiển vi có độ<br /> phóng đại 400. Xác định thay đổi tỷ lệ tinh<br /> trùng sống/chết ngay sau nghiệm pháp<br /> HOS test của hỗn dịch bằng test eosin.<br /> - Đánh giá lại sau: 5 phút, 10 phút,<br /> 15 phút, 30 phút, 90 phút, 120 phút.<br /> - Thực hiện tương tự với DD2, DD3,<br /> DD4.<br /> <br /> - Xác định thời gian ủ tinh trùng phù<br /> hợp cho phản ứng HOS test tối ưu.<br /> - Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán<br /> dương của HOS test.<br /> * Xử lý số liệu: các số liệu thu thập<br /> được xử lý theo phương pháp thống kê<br /> y sinh học theo t-test bằng phần mềm<br /> Microsoft Excel 2010, SPSS 20.0.<br /> <br /> * Chỉ tiêu nghiên cứu:<br /> <br /> * Địa điểm và thời gian nghiên cứu:<br /> <br /> - Tỷ lệ phần trăm tinh trùng có phản ứng<br /> HOS test trong các loại dung dịch áp lực<br /> thẩm thấu khác nhau.<br /> <br /> nghiên cứu thực hiện tại Bộ môn Mô phôi,<br /> Trường Đại học Y Hà Nội từ tháng 10 2016 đến 6 - 2017.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Xác định loại dung dịch HOS test phù hợp và thời gian tối ƣu khi ủ tinh trùng<br /> trong dung dịch HOS test.<br /> 50<br /> <br /> Tỉ lệ (%)<br /> <br /> 40<br /> HOST (+)_dung dịch<br /> 1<br /> HOST (+)_dung dịch<br /> 2<br /> HOST (+)_dung dịch<br /> 3<br /> HOST (+)_dung dịch<br /> 4<br /> <br /> 30<br /> 20<br /> 10<br /> 0<br /> <br /> 1<br /> <br /> 5<br /> <br /> 10<br /> <br /> 15<br /> <br /> 30<br /> <br /> 90<br /> <br /> 120<br /> <br /> Thời gian (phút)<br /> Biểu đồ 1: Tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test ở 4 loại dung dịch khảo sát,<br /> biến đổi theo thời gian.<br /> - Tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOST (+) tăng dần theo thời gian từ 1 - 30 phút, sau đó<br /> ít biến đổi ở tất cả 4 loại dung dịch khảo sát.<br /> - Phản ứng phản ứng HOST (+) luôn đạt cao nhất ở DD4, thấp nhất ở DD1; ở DD2<br /> và DD3 gần tương đồng nhau.<br /> 96<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> 100<br /> <br /> Tỉ lệ (%)<br /> <br /> 80<br /> Eosin (+)_dung dịch 1<br /> 60<br /> <br /> Eosin (+)_dung dịch 2<br /> <br /> 40<br /> <br /> Eosin (+)_dung dịch 3<br /> <br /> 20<br /> <br /> Eosin (+)_dung dịch 4<br /> <br /> 0<br /> 1<br /> <br /> 5<br /> <br /> 10<br /> <br /> 15<br /> <br /> 30<br /> <br /> 90 120<br /> <br /> Thời gian (phút)<br /> Biểu đồ 2: Tỷ lệ tinh trùng chết (eosin +) ở mỗi loại dung dịch HOS test,<br /> biến đổi theo thời gian.<br /> - Tỷ lệ tinh trùng chết tăng dần sau thời gian ủ trong dung dịch HOS test, đặc biệt<br /> sau giai đoạn 30 phút.<br /> - DD3 và DD4 luôn có tỷ lệ tinh trùng chết cao hơn so với ở DD1 và DD2.<br /> Bảng 1: Tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test ở 4 loại dung dịch khảo sát, tại thời<br /> điểm 30 phút.<br /> DD1<br /> <br /> DD2<br /> <br /> DD3<br /> <br /> DD4<br /> <br /> HOST (+) (%)<br /> <br /> 24,5<br /> <br /> 30,2<br /> <br /> 31,9<br /> <br /> 37,9<br /> <br /> Tỷ lệ tinh trùng chết trước HOST test (%)<br /> <br /> 64,4<br /> <br /> 64,4<br /> <br /> 64,4<br /> <br /> 64,4<br /> <br /> Tỷ lệ tinh trùng chết sau HOST test (%)<br /> <br /> 65,9<br /> <br /> 67,7<br /> <br /> 78,1<br /> <br /> 81,2<br /> <br /> - Tại thời điểm 30 phút, DD4 có tỷ lệ tinh trùng HOS test dương tính cao nhất (37,9%);<br /> dung dịch DD1 có tỷ lệ tinh trùng phản ứng HOS test thấp nhất (24,5%), khác biệt có<br /> ý nghĩa thống kê (p < 0,05).<br /> - Không có sự khác biệt về tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test ở dung dịch DD2<br /> và DD3.<br /> - Tỷ lệ chết của tinh trùng sau HOS test tăng cao ở loại dung dịch DD3 và DD4<br /> (78,1% và 81,2%); khác biệt có ý nghĩa so với DD1 và DD2 (p < 0,01).<br /> - DD2 cho phản HOS test rõ và ít ảnh hưởng đến sự sống của tinh trùng.<br /> 2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và giá trị chẩn đoán dƣơng của nghiệm pháp<br /> HOS test với DD2 tại thời điểm 30 phút.<br /> Với loại dịch DD2 (50/50), ủ ở 37oC trong 30 phút, giá trị của phản ứng HOS test<br /> của tinh trùng biểu hiện qua bảng 2:<br /> 97<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> Bảng 2: Giá trị của phản ứng HOS test với DD2.<br /> Số ƣợng tinh trùng sống<br /> <br /> Số ƣợng tinh trùng chết<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> Tinh trùng HOST (+)<br /> <br /> 1.897<br /> <br /> 274<br /> <br /> 2.171<br /> <br /> Tinh trùng HOST (-)<br /> <br /> 668<br /> <br /> 4.361<br /> <br /> 5.029<br /> <br /> 2.565<br /> <br /> 4.635<br /> <br /> 7.200<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> - Độ nhạy của phản ứng HOS test hay tỷ lệ dương tính thật bằng số tinh trùng sống<br /> và có HOS test (+) trên tổng số tinh trùng sống (= 73,9%).<br /> - Độ đặc hiệu của phản ứng HOS test hay tỷ lệ âm tính thật bằng số tinh trùng chết<br /> và có HOS test (-) trên tổng số tinh trùng chết (= 94,1%).<br /> - Giá trị tiên đoán dương của phản ứng HOS test bằng số tinh trùng sống và có<br /> HOS test (+) trên tổng số tinh trùng có HOS test (+) là 87,4%.<br /> BÀN LUẬN<br /> Khi tinh trùng tiếp xúc với dung dịch áp<br /> lực thẩm thấu thấp, tỷ lệ tinh trùng có phản<br /> ứng HOS test (+) tăng theo thời gian, từ<br /> phút 30 trở đi tỷ lệ tinh trùng có phản ứng<br /> HOS test hầu như không thay đổi ở cả<br /> bốn loại dịch (biểu đồ 1). Do vậy, khi đánh<br /> giá lựa chọn loại dịch phù hợp, ta sẽ đánh<br /> giá ở thời điểm 30 phút. DD4 có tỷ lệ tinh<br /> trùng HOS test dương tính cao nhất (37,9%),<br /> thấp nhất ở DD1 (24,5%), không có sự<br /> khác biệt về tỷ lệ tinh trùng có phản ứng<br /> HOS test ở DD2 và DD3 (bảng 1). Sự<br /> khác biệt trên là do các loại dịch có áp lực<br /> thẩm thấu khác nhau. Khi tinh trùng ở<br /> trong môi trường nhược trương, nước sẽ<br /> đi từ ngoài vào trong tế bào cho đến khi<br /> đạt được cân bằng về áp lực thẩm thấu<br /> giữa trong và ngoài tế bào. Ở loại DD1,<br /> áp lực thẩm thấu gần với áp lực thẩm<br /> thấu của tế bào, lượng nước đi vào tế<br /> bào ít, do vậy số tinh trùng có biểu hiện<br /> HOS test (+) sẽ thấp. Ở loại dịch 2, với tỷ<br /> lệ 50% nước cất, lượng nước đi vào tinh<br /> trùng ở mức độ đủ để có tỷ lệ tinh trùng<br /> biểu hiện HOS test (+) khá cao. Ở loại<br /> dịch 3, 4, với áp lực thẩm thấu rất thấp,<br /> 98<br /> <br /> lượng nước vào trong tế bào rất lớn,<br /> chính vì vậy số tinh trùng có HOS test (+)<br /> cao nhất.<br /> Khi đánh giá loại dịch thẩm thấu thấp<br /> phù hợp, phản ứng HOS test của tinh<br /> trùng ở loại dịch 50% môi trường và 50%<br /> nước cất tối ưu nhất. Tối ưu ở đây được<br /> hiểu là điều kiện mà tỷ lệ tinh trùng có<br /> phản ứng HOS test cao, nhưng đồng thời<br /> tỷ lệ tinh trùng chết cũng thấp. Ở loại dịch<br /> 50/50, tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS<br /> test khá cao, đồng thời tổn thương do<br /> stress áp lực thẩm thấu thấp tương đối<br /> thấp, biểu hiện bằng phần trăm tinh trùng<br /> chết khi nhuộm eosin sau HOS test thấp<br /> hơn đáng kể (67,7%) so với loại dịch 100%<br /> nước cất (81,2%), p < 0,01 (biểu đồ 2,<br /> bảng 1).<br /> Tỷ lệ tinh trùng chết ở loại DD1 và DD2<br /> sau HOS test thấp nhất so với hai loại<br /> dịch còn lại, khác biệt có ý nghĩa thống kê<br /> (p < 0,01), nhưng giữa hai nhóm không có<br /> sự khác biệt đáng kể (p > 0,05). Ngược lại,<br /> tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test ở<br /> loại dịch 100% nước cất tuy cao nhất nhưng<br /> phần trăm tinh trùng chết sau HOS test<br /> cũng cao nhất (81,2%), khác biệt có ý nghĩa<br /> <br />