Đánh giá tác dụng điều trị của tấm vật liệu tương đương trung bì trên vết bỏng nhiệt thực nghiệm

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

48
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết nghiên cứu tiến hành trên 30 thỏ, mỗi thỏ được gây hai vết bỏng độ sâu trên lưng bằng nhiệt ướt. Một nhóm được che phủ bằng tấm vật liệu tương đương trung bì chế tạo từ tế bào (TB) gốc (TBG) trung mô màng dây rốn người (vùng A), một nhóm đối chứng (vùng B). Bắt đầu che phủ vết thương (VT) bỏng sau bằng tấm vật liệu tương đương trung bì từ ngày thứ 5 sau cắt lọc hoại tử.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đánh giá tác dụng điều trị của tấm vật liệu tương đương trung bì trên vết bỏng nhiệt thực nghiệm

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2013 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ CỦA TẤM VẬT LIỆU TƢƠNG ĐƢƠNG TRUNG BÌ TRÊN VẾT BỎNG NHIỆT THỰC NGHIỆM Đinh Văn Hân*; Phan Minh Hoàng** TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành trên 30 thỏ, mỗi thỏ đƣợc gây hai vết bỏng độ sâu trên lƣng bằng nhiệt ƣớt. Một nhóm đƣợc che phủ bằng tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì chế tạo từ tế bào (TB) gốc (TBG) trung mô màng dây rốn ngƣời (vùng A), một nhóm đối chứng (vùng B). Bắt đầu che phủ vết thƣơng (VT) bỏng sau bằng tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì từ ngày thứ 5 sau cắt lọc hoại tử. Kết quả: tốc độ biểu mô hóa giữa vùng A và vùng B tại thời điểm ngày thứ 10 sau ghép TBG khác biệt có ý nghĩa thống kê. Tỷ lệ VT bỏng vùng A khỏi hoàn toàn (46,67%) cao hơn so với vùng B (40%) tại thời điểm 16 - 20 ngày sau gây bỏng. Tỷ lệ nhiễm khuẩn không khác nhau giữa 2 vùng. Ngày thứ 10 sau ghép TBG trung mô, vùng A có số lƣợng TB viêm ít hơn nhiều so với vùng B, p < 0,05. Tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì có biểu hiện làm tăng quá trình liền VT so với nhóm chứng, trong khi đó, tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì có tác dụng hạn chế nhiễm khuẩn tại vết bỏng chƣa thể hiện rõ ràng. * Từ khóa: Vết bỏng nhiệt thực nghiệm; Tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì; Tác dụng. Assessing effects of transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells on experimentally induced thermal burns SUMMARY 30 healthy rabbits were given full-thickness thermal burns, each rabbit had two burn wounds areas on back. One area was covered by umbilical cord mesenchymal stem cells after necrosis tissue early-excision on 5th day of burn (A area); the rest was used as controls (B area). Results: the epithelization rate of A and B areas at 10-day period after the transplantation had a statistical difference. The complete healing rate of burn wounds in A area was higher than that in B area (73.3 vs. 60%), at period of 16 - 20 days after inducing burn injuries. The infection rate between the two areas was not different. At the 10 day-period after the transplantation, the number of infection cells in A area was statistically significant lower than in A area (p < 0.05). Human umbilical cord mesenchymal stem cells enhanced burn wound healing faster than the controls, while their effectiveness on inhibiting infection at the burn wounds were not clearly. * Key words: Experimental induced thermal burn; Human umbilical cord mesenchymal stem cells; Effect. ĐẶT VẤN ĐỀ Vật liệu tƣơng đƣơng da đã đƣợc nghiên cứu phát triển và chế tạo trong thực nghiệm từ vài thập kỷ trƣớc đây [1, 2]. Tuy nhiên, các vật liệu này đều có hạn chế trong sử dụng cũng nhƣ hiệu quả thành công trong điều trị, do thiếu thành phần của trung bì. * Viện Bỏng Lê Hữu Trác ** Bệnh viện Chợ Rẫy Người phản hồi (Corresponding): Phan Minh Hoàng (dminhhoang2010@gmail.com) Ngày nhận bài: 3/6/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30//2013 Ngày bài báo được đăng: 1/10/2013 28 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2013 Do đó, một số vật liệu khác đƣợc chế tạo dựa trên công nghệ mô tạo ra tấm vật liệu bao gồm cả thành phần tƣơng tƣơng biểu bì và thành phần tƣơng đƣơng trung bì bằng cách kết hợp các yếu tố trung bì và biểu bì, các yếu tố này đƣợc phát triển dựa trên nguyên lý cơ bản là nuôi cấy nguyên bào sợi và TB biểu bì trên giá đỡ 3 chiều nhƣ tấm collagen. Một số vật liệu tƣơng đƣơng trung bì đã đƣợc sử dụng để phát triển nghiên cứu chế tạo vật liệu thay thế da. Tuy nhiên, các vật liệu này đều phải dùng thành phần đồng loại hay dị loại nhƣ collagen của bò [5, 6] hoặc trung bì không còn TB sống lấy từ tử thi [7] hoặc các giá đỡ tổng hợp bằng polymer [8]…, các thành phần này đều rất đắt và tiểm ẩn nguy cơ lây bệnh truyền nhiễm… Trong da, nguyên bào sợi là TB chủ yếu đƣợc bao quanh bởi đệm gian bào. Đặc biệt, trong liền VT da, vai trò của nguyên bào sợi tạo ra ECM đáng nhiều hơn so với da bình thƣờng. Nguyên bào sợi da nuôi cấy đƣợc ghi nhận là tăng sinh và tổng hợp đệm gian bào khi có mặt một số hormon hay yếu tố tăng trƣởng [10]. Gần đây, các nguyên bào sợi có thể đƣợc biệt hóa từ TBG trung mô màng dây rốn. Các TB này có khả năng nhân lên mạnh và nhiều hơn nguyên bào sợi da. Hơn nữa, dây rốn hiện đang là rác thải y học, nhƣng lại là một nguồn mô cung cấp TB lý tƣởng do mỗi dây rốn đều có diện tích 3.000 - 4.000 cm2, do đó chỉ cần một mẫu dây rốn là đã có thể cung cấp số lƣợng cực kỳ lớn TB trung mô để chế tạo các tấm tế bào hay tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì dùng trong nghiên cứu in vitro và điều trị bệnh. Trong điều kiện hiện nay, chúng tôi phát triển loại vật liệu tƣơng đƣơng trung bì mới bằng cách nuôi cấy TBG trung mô trong môi trƣờng đặc biệt có chứa một số yếu tố để tạo tấm TB, sau đó thay môi trƣờng chuyên biệt cho nguyên bào sợi và kích thích chúng tiết ra, những thành phần đệm gian bào để tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì mà không cần giá đỡ hay các thành phần dị loại hay đồng loại khác. Chúng tôi đánh giá loại vật liệu này bằng nghiên cứu hình thái cấu trúc mô, siêu cấu trúc mô TB trong tấm vật liệu. Đồng thời, đánh giá khả năng ứng dụng in vivo của vật liệu này bằng cách ghép chúng lên động vật với mô hình điều trị VT vết bỏng nghiệm ở thỏ. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tƣợng nghiên cứu. - 30 con thỏ khỏe mạnh. Thỏ thí nghiệm đều trƣởng thành (từ 10 - 12 tháng tuổi), trƣớc thí nghiệm đƣợc theo dõi từ 2 - 3 ngày. - Tiêu chuẩn lựa chọn: thỏ khỏe mạnh, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mƣợt, không có bệnh ngoài da, đƣờng ruột, cân nặng từ 2 - 3 kg, thỏ đƣợc nuôi đảm bảo theo tiêu chuẩn thực nghiệm. - Trong thời gian thực nghiệm, thỏ đƣợc nhốt riêng mỗi con 1 chuồng, có đánh số để tiện việc theo dõi. 2. Chất liệu nghiên cứu. Tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì do Labo Nghiên cứu và ứng dụng điều trị bỏng, Viện Bỏng Lê Hữu Trác chế tạo. 3. Phƣơng pháp nghiên cứu. * Gây bỏng thực nghiệm: Mỗi thỏ đƣợc gây 2 vết bỏng trên lƣng với độ sâu tƣơng đƣơng. Vết bên phải (gọi tắt là vùng A) đƣợc che phủ bằng tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì vào ngày thứ 5 sau gây bỏng. Vết bên trái (gọi tắt là vùng B) chỉ đƣợc ghép màng tegaderm đơn thuần không có tế bào. Gây bỏng theo phƣơng 30 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2013 pháp của Halovec và Pociado 1961 (có cải tiến). Cố định thỏ vào bàn thí nghiệm chuyên dụng. Cạo sạch lông ở vùng lƣng thành 2 mảng đối xứng, vùng cạo lông hình tròn có đƣờng kính 5 cm. Diện tích gây bỏng là: S = Πr² = 3,14 x 2,5² = 19,6 cm². Gây mê tĩnh mạch thỏ bằng ketamin 5 mg/kg cân nặng. Dụng cụ gây bỏng là bình kim loại hình trụ, đáy tròn có đƣờng kính 5 cm, cao 25 cm (có cán cầm tay). Đổ nƣớc sôi (t = 1000C) vào bình đến độ cao 10 cm. Đặt đáy bình vào vùng da đã chuẩn bị, cùng lúc đặt túi cát nặng 1 kg lên miệng bình. Giữ túi cát vào cán bình cho thăng bằng, không xê dịch để tạo vết bỏng đồng nhất. Thời gian áp đáy bình vào da thỏ 30 giây để tạo vết bỏng sâu độ IV. Sau khi gây bỏng, vùng tổn thƣơng có màu trắng đục, da xung quanh vết bỏng xung huyết màu hồng nhạt. Thỏ tỉnh sau vài phút và ăn uống sau vài giờ. * Phương pháp tạo tấm vật liệu tương đương trung bì: Nuôi cấy TB trung mô với số lƣợng tƣơng đƣơng 5.000 TB/cm2 đĩa nuôi cấy, d = 100 mm. Sau khi đạt 100% độ che phủ (confluent), tiếp tục đƣợc nuôi cấy thêm vài tuần. Trong thời gian nuôi cấy, thay thế môi trƣờng bằng biệt hóa nguyên bào sợi để kích thích tiết đệm gian bào. Khi các TB mọc chồng lấn nhiều lớp lên nhau và có đệm gian bào, tấm vật liệu sẽ quan sát rõ bằng mắt thƣờng và dƣới kính hiển vi. Dấu hiệu thấy rõ là tấm vật liệu bắt đầu co và tách ra khỏi bề mặt nuôi cấy ở mép đĩa. Dùng dụng cụ cell lifter gạt nhẹ để tách hoàn toàn tấm vật liệu khỏi bề mặt đĩa. Tấm vật liệu sau đó đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu đánh giá hình thái cấu trúc và ghép điều trị VT bỏng thực nghiệm. Tiến hành 10 thí nghiệm, sử dụng 5 dòng TB ở P3 và P4 thu đƣợc từ mô dây rốn. * Ghép tấm vật liệu tương đương trung bì lên vết bỏng: Chuẩn bị sẵn tấm TB đặt lên vết bỏng vùng A vào ngày thứ 5 sau gây bỏng. Sau khi đặt, dùng một lớp gạc vaseline để áp và cố định tấm TB lên VT bỏng. Đối với vết bỏng vùng B, chỉ phủ màng tegaderm không có TBG, sau đó đắp gạc có tẩm vaselin. * Xét nghiệm vi khuẩn bỏng: Tiến hành xét nghiệm vi khuẩn vùng VT nghiên cứu và đối chứng tại 3 thời điểm khác nhau: trƣớc ghép TB (ngày thứ 5 sau gây bỏng), ngày thứ 5 sau khi ghép TB (ngày thứ 10 sau gây bỏng), ngày thứ 10 sau ghép TB (ngày thứ 15 sau gây bỏng). Xác định loài và số lƣợng vi khuẩn/cm² bề mặt vết bỏng. * Xét nghiệm mô học: - Sinh thiết mô vết bỏng bằng dụng cụ sinh thiết (Biopsy punch) vào 2 thời điểm: trƣớc ghép TB (D1), ngày thứ 5 sau ghép (D5) tức ngày thứ 10 sau gây bỏng, ngày thứ 10 sau ghép TB (D10) tức ngày 15 sau gây bỏng. - Nhuộm hematoxylin-eosin (HE). - Quan sát tiêu bản dƣới kinh hiển vi quang học có độ phóng đại 40 - 400 lần, nhận xét sự biến đổi TB và cấu trúc mô. Đếm số lƣợng TB và cấu trúc mô. Đếm số lƣợng TB viêm (bạch cầu trung tính, đại thực bào, TB lympho), nguyên bào sợi, TB sợi, mạch máu tân tạo trên một đơn vị diện tích (ĐVDT) dƣới kính hiển vi quang học có gắn vi mét thị kính (1 ĐVDT = 122.400 µm²). Mỗi tiêu bản đếm 4 ĐVDT, lấy giá trị trung bình cho từng tiêu bản. Xác định chỉ số phân bào (Mitose Index-MI) bằng cách đếm số lƣợng TB phân chia trên 200 TB sừng lớp mầm. 31 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2013 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Diễn biến lâm sàng thỏ nghiên cứu * Thay đổi trọng lượng của thỏ trong quá trình gây bỏng thực nghiệm: 2.4 2.32 2.3 1.96 2.2 kg 2.13 2.06 2.1 2 1.9 1.8 1.7 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Biểu đồ 1: Thay đổi trọng lƣợng thỏ nghiên cứu. (Lần 1: trước khi gây bỏng thực nghiệm; lần 2: ngày thứ 5 sau bỏng [(ngày bắt đầu ghép TB)]; lần 3: ngày thứ 10 sau bỏng (ngày thứ 5 sau ghép TB); lần 4: ngày thứ 15 sau bỏng (ngày thứ 10 sau ghép TB). Trọng lƣợng thỏ giảm ở những ngày đầu sau gây bỏng thực nghiệm. Trọng lƣợng giảm là do tính chất của chấn thƣơng cấp tính, đau đớn, VT bỏng rộng và sâu, không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Ở thời điểm 10 ngày sau gây bỏng (5 ngày sau ghép TB), trọng lƣợng thỏ bắt đầu hồi phục, đến thời điểm 15 ngày sau khi gây bỏng (10 ngày sau ghép TB), trọng lƣợng của thỏ trở về gần với giá trị ban đầu trƣớc gây bỏng. * Diễn biến tại chỗ vùng tổn thương: Bảng 1: Diễn biến hình ảnh lâm sàng tại chỗ VT bỏng thực nghiệm có ghép TBG (vùng A) và vùng không ghép TBG (vùng B). THỜI ĐIỂM VÙNG A VÙNG B 5 ngày đầu sau - VT viêm nề, sung huyết đỏ. Nền VT hoại - VT viêm nề, sung huyết đỏ. Nền VT gây bỏng tử trắng rải rác. đỏ, đôi chỗ hoại tử trắng. - Bờ mép VT không viêm nề. Trƣớc ghép - Bờ mép VT không viêm nề. - Nền VT ẩm, giả mạc bám dễ bóc, viêm - Nền VT ẩm, giả mạc màu vàng nhạt nề giảm, còn hoại tử trắng. bám nền VT, tiết dịch vừa, đôi chỗ hoại tử trắng. - Bờ mép VT không viêm nề. - Bờ mép VT không viêm nề. Ngày thứ 5 sau - VT sạch khô, không tiết dịch. Vảy tiết ghép (ngày thứ khô màu vàng sậm, cạo sạch lớp vẩy tiết 10 sau bỏng) bên dƣới rƣớm máu. Nền VT màu hồng nhạt. - Bờ mép VT không viêm nề. - VT sạch, tiết dịch ít. Vảy tiết dễ bóc, màu vàng nhạt, cạo sạch lớp vẩy tiết bên dƣới rƣớm máu. Nền VT màu hồng. - Bờ mép VT không viêm nề. 32 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2013 (1) (2) (3) Ngày thứ 10 sau - Diện tích VT thu nhỏ, nền VT sạch, màu - Diện tích VT co nhỏ lại nhƣng lớn hơn ghép hồng, mô hạt đỏ, biểu mô hóa từ bờ mép so với vùng A. Nền VT ẩm, sạch, màu hồng nhạt, dịch tiết vừa. Mô hạt đỏ, (ngày thứ 15 sau VT, mạch máu tăng sinh mạnh. biểu mô hóa từ bờ mép VT chậm. bỏng) - Bờ mép VT không viêm nề. - Bờ mép VT không viêm nề. Ngày thứ 15 sau - Nền VT phẳng, nông, không co dúm. - Nền VT phẳng, rƣớm máu, sẹo co 2 ghép (ngày thứ Biểu mô hóa từ bờ mép VT tốt. dúm. Diện tích VT < 5 cm , nền VT màu 20 sau bỏng) hồng nhạt. - VT cơ bản đã khỏi. Bảng 2: Diện tích sẹo bỏng sau liền (cm2). THỜI ĐIỂM DIỆN TÍCH SẸO BỎNG SAU KHI LIỀN p Vùng A (n = 30) Vùng B ( n = 30) D5 4,68 ± 1,64 4,5 ± 1,48 0,488 D10 14,18 ± 3,33 12,52 ± 2,83 < 0,05 D15 16,95 ± 2,31 15,74 ± 1,93 < 0,05 Diện tích sẹo bỏng đã liền ở vùng A cao hơn ở vùng B và có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) vào ngày thứ 10 sau ghép tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì. Bảng 3: Tỷ lệ % liền VT theo thời gian THỜI ĐIỂM TỶ LỆ PHẦN TRĂM DIỆN TÍCH VẾT THƢƠNG ĐÃ LIỀN p Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) D5 26,53 ± 12,04 25,84 ± 11,4 0,601 D10 77,44 ± 12,24 68,76 ± 11,14 < 0,05 D15 93,23 ± 3,74 87,36 ± 4,78 < 0,05 Tốc độ biểu mô hóa của vùng A nhanh hơn vùng B. Tuy nhiên, sự thay đổi tốc độ biểu mô hóa giữa vùng A và vùng B trong 5 ngày đầu sau ghép không có ý nghĩa thống kê (p = 0,601). Nếu so sánh thay đổi tốc độ biểu mô hóa giữa vùng A và vùng B trong khoảng thời gian tại ngày thứ 10 sau ghép TBG, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê đối với cả diện tích (p < 0,05), chứng tỏ càng về sau, tốc độ biểu mô hóa vùng A càng nhanh hơn vùng B. Bảng 4: So sánh tỷ lệ VT khỏi hoàn toàn giữa vùng A và vùng B trong từng giai đoạn. VÙNG A THỜI GIAN VÙNG B p Số thỏ % Số thỏ % < 15 ngày sau gây bỏng 0 0 0 0 > 0,05 16 - 20 ngày sau gây bỏng 14 46,67 12 40 > 0,05 > 20 ngày sau gây bỏng 16 53,33 18 60 > 0,05 Tổng 30 100 30 100 Trong giai đoạn 16 - 20 ngày, tỷ lệ VT bỏng vùng A khỏi hoàn toàn (46,67%) cao hơn so với vùng B (40%), tuy nhiên chƣa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). 33