Đánh giá tính an toàn của Adenovirus tái tổ hợp mang gen mã hóa IL-12 người trên chuột nhắt

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2019<br /> <br /> ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN CỦA ADENOVIRUS TÁI TỔ HỢP<br /> MANG GEN MÃ HÓA IL-12 NGƯỜI TRÊN CHUỘT NHẮT<br /> Nguyễn Thái Biềng1; Hoàng Quốc Trường2; Đặng Quang Chung3; Hồ Anh Sơn1<br /> <br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá tính an toàn của Adenovirus tái tổ hợp mang gen mã hóa IL-12 người<br /> trên chuột nhắt. Đối tượng và phương pháp: chuột nhắt BALB/c được chia 3 nhóm, mỗi nhóm<br /> 9 con, gồm nhóm chứng, nhóm tiêm adenovirus tái tổ hợp mang gen mã hóa IL-12 người liều<br /> 6 7<br /> 10 vp/con, nhóm tiêm adenovirus tái tổ hợp mang gen mã hóa IL-12 người liều 10 vp/con.<br /> Chuột được theo dõi tình trạng toàn thân, đánh giá chức năng gan thận, kiểm tra<br /> Adenovirus tái tổ hợp mang gen mã hóa IL-12 người có mặt trong các tạng chuột. Kết quả:<br /> chuột tiêm Adenovirus tái tổ hợp mang gen mã hóa IL-12 người khỏe mạnh, không có chuột<br /> chết. Chức năng gan thận ở các nhóm chuột tiêm Adenovirus tái tổ hợp mang gen mã hóa<br /> IL-12 người không có khác biệt đáng kể thông qua các chỉ số ALT, AST, bilirubin, ure, creatinin.<br /> Không phát hiện thấy Adenovirus tái tổ hợp mang gen mã hóa IL-12 người có mặt trong các<br /> tạng chuột bằng kỹ thuật PCR. Kết luận: Adenovirus tái tổ hợp mang gen mã hóa IL-12 người<br /> 7<br /> an toàn đối với chuột nhắt với mức liều 10 vp/con.<br /> * Từ khóa: Adenovirus; IL-12; Tái tổ hợp mang gen mã hóa IL-12 người; Chuột nhắt.<br /> <br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ protein trung gian như IP-10 và Mig được<br /> cảm ứng bởi IFN-γ. Vector Adenovirus tái<br /> Interleukin-12 (IL-12) là một trong tổ hợp gắn gen mã hóa IL-12 là sản phẩm<br /> những cytokine triển vọng đối với liệu của đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng<br /> pháp miễn dịch chống ung thư. IL-12 kích dụng gen mã hóa IL-12 trong điều trị ung<br /> hoạt và khơi mào các tế bào T hỗ trợ týp 1 thư tế bào gan”, tích hợp vector Ad thế hệ<br /> (Th1); kích thích biệt hóa tế bào T gây độc 3 và gen mã hóa IL-12 người đã được<br /> (TCD8+); thúc đẩy tế bào T duy trì sản chứng minh có thể chuyển vào tế bào<br /> xuất interferon-gamma (IFN-γ) cần thiết ung thư gan, cũng như tạo được IL-12<br /> cho ức chế khối u; tác động trực tiếp đến người trên thực nghiệm. Để có thể sử<br /> tế bào giết tự nhiên tiêu diệt ung thư. dụng trong nghiên cứu tiếp theo, chúng<br /> Ngoài ra, IL-12 còn có tác dụng chống tôi tiến hành: Đánh giá tính an toàn của<br /> tăng sinh mạch gián tiếp thông qua chế phẩm này trên động vật thực nghiệm.<br /> <br /> 1. Học viện Quân y<br /> 2. Bệnh viện Trung ương Quân đội 108<br /> 3. Bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng<br /> Người phản hồi (corresponding): Hồ Anh Sơn (hoanhsonhp@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 19/09/2019; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/10/2019<br /> Ngày bài báo được đăng: 18/10/2019<br /> <br /> 9<br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2019<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP - Đánh giá chức năng gan, thận: xác<br /> NGHIÊN CỨU định hoạt độ/nồng độ của AST, ALT,<br /> 1. Đối tượng nghiên cứu. bilirubin toàn phần, ure, creatinin huyết<br /> thanh chuột (thời điểm 1 tuần sau tiêm).<br /> - Chuột nhắt trắng BALB/c được nuôi<br /> trong phòng thí nghiệm, chăm sóc theo - Phát hiện vật liệu di truyền của Ad-<br /> hướng dẫn tại Viện Nghiên cứu Y-Dược IL12 trong một số tạng chuột bằng phản<br /> học Quân sự, Học viện Quân y. ứng PCR (sau 3 tuần tiêm). Thành phần<br /> và điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR<br /> - Chế phẩm Adenovirus tái tổ hợp<br /> khuếch đại đoạn gen IL-12 người bao<br /> mang gen IL-12 (Ad-IL12) và Adenovirus<br /> gồm: 12,5 mcl 2X PCR Master mix; 10 pM<br /> tái tổ hợp không chứa gen mã hóa IL-12<br /> (Ad), do Khoa Sinh học Phân tử, Bệnh mồi xuôi và mồi ngược; 5 mcl ADN tổng<br /> viện Trung ương Quân đội 108 cung cấp. số; bổ sung nước vô trùng đến 25 mcl.<br /> Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR được<br /> 2. Hóa chất, phương tiện nghiên cứu. thực hiện như sau: 95°C, 5 phút; 35 chu kỳ<br /> - Cặp mồi pORF-IL12 forward, [95°C, 20 giây; 58°C, 30 giây; 72°C, 1 phút];<br /> 5’-TGGGAGTACCCTGACACCT-3’ và pORF-IL12<br /> 72°C, 5 phút; giữ nhiệt ở 4oC. Sản phẩm<br /> reverse, 5’-GTACCCCTACTCCAGGAAC-3’<br /> của phản ứng PCR được phát hiện khi<br /> được sử dụng để khuếch đại trình tự<br /> cho sản phẩm điện di trên gel agarose 1%.<br /> đoạn gen mã hóa IL-12.<br /> - Máy soi gel & chụp ảnh Gel-Doc KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> (Dolphin), bộ điện di (Bio-RAD), máy PCR<br /> 1. Tình trạng toàn thân chuột trong<br /> 9700 (Applied BioSystems), máy ly tâm<br /> quá trình thí nghiệm.<br /> (Beckman), máy đo quang phổ DU 730<br /> Sau khi tiêm tĩnh mạch với Ad-IL12,<br /> (Beckman), máy block nhiệt (Eppendorf).<br /> chuột vẫn ăn uống, hoạt động bình<br /> 3. Phương pháp nghiên cứu. thường, nhanh nhẹn, lông mượt, mắt<br /> Chuột nhắt trắng được chia ngẫu trong, hậu môn khô; không thấy các biểu<br /> nhiên làm 3 nhóm, mỗi nhóm 9 con: hiện, diễn biến bất thường như: xù lông,<br /> - Nhóm 1: tiêm tĩnh mạch đuôi Ad-IL12 chảy máu, đi lỏng, co giật… Cả 3 nhóm<br /> với liều 106 vp/chuột, 1 lần duy nhất. không có chuột nào bị chết.<br /> - Nhóm 2: tiêm tĩnh mạch đuôi Ad-IL12 Bảng 1: Trọng lượng cơ thể chuột<br /> với liều 107 vp/chuột, 1 lần duy nhất. nghiên cứu.<br /> - Nhóm 3 (chứng): tiêm tĩnh mạch đuôi<br /> Trọng lượng cơ thể (g)<br /> dung dịch sodium chloride (NaCl) 0,9 % x Nhóm n<br /> 0,20 ml/chuột, 1 lần duy nhất. Ngày 0 Ngày 7<br /> 6<br /> * Đánh giá tính an toàn của Ad-IL12: Nhóm 1 (10 vp/con) 9 22,4 ± 1,12 23,2 ± 0,88<br /> <br /> - Tình trạng toàn thân, trọng lượng cơ 7<br /> Nhóm 2 (10 vp/con) 9 22,1 ± 1,15 22,8 ± 0,96<br /> thể, tình trạng sống chết, phân và các bất<br /> Nhóm 3 (chứng) 9 22,3 ± 1,28 23,2 ± 1,0<br /> thường khác (nếu có).<br /> <br /> 10<br />  T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2019<br /> <br /> Trọng lượng cơ thể chuột nhóm có xu Hoạt độ enzym ALT (U/L) huyết thanh<br /> hướng tăng so với trước khi thí nghiệm ở của các nhóm chuột thí nghiệm đều nằm<br /> tất cả các nhóm. Như vậy, Ad-IL12 ở các trong giới hạn bình thường và tương tự<br /> mức liều nghiên cứu không ảnh hưởng nhau. Như vậy, Ad-IL12 ở 2 mức liều<br /> đến cân nặng của chuột thí nghiệm. nghiên cứu (106 và 107 vp/chuột) không<br /> Không chuột nào có diễn biến bất thường ảnh hưởng đến hoạt độ enzym ALT huyết<br /> (xù lông, chảy máu, đi lỏng, co giật…). thanh chuột thí nghiệm.<br /> Bảng 4: Kết quả hàm lượng bilirubin<br /> 2. Kết quả xét nghiệm sinh hóa chức<br /> toàn phần ở chuột nghiên cứu.<br /> năng gan, thận.<br /> Nhóm Hàm lượng bilirubin<br /> Bảng 2: Kết quả hoạt độ enzym AST ở n<br /> nghiên cứu toàn phần (mcmol/l)<br /> chuột nghiên cứu<br /> 6<br /> Nhóm 1 (10 vp/con) 6 33,7 ± 14,75<br /> Hoạt độ enzym 7<br /> Nhóm nghiên cứu n Nhóm 2 (10 vp/con) 6 51,0 ± 19,87<br /> AST (U/l)<br /> 6<br /> Nhóm 1 (10 vp/con) 6 195,5 ± 26,87 Nhóm 3 (chứng) 6 41,9 ± 16,67<br /> 7<br /> Nhóm 2 (10 vp/con) 6 176,9 ± 33,23 p > 0,05<br /> <br /> Nhóm 3 (chứng) 6 187,1 ± 14,48 Sự khác biệt về hàm lượng bilirubin<br /> p > 0,05 toàn phần huyết thanh ở các nhóm chuột<br /> thí nghiệm không có ý nghĩa thống kê so<br /> Tiêm Ad-IL12 ở cả 2 mức liều (106 và với nhóm chứng. Như vậy, Ad-IL12 ở cả<br /> 107 vp/chuột) đã làm tăng nhẹ hoạt độ 2 mức liều (106 và 107 vp/chuột) không<br /> enzym AST huyết thanh ở chuột thí ảnh hưởng tới hàm lượng bilirubin toàn<br /> nghiệm. Tuy nhiên, hoạt độ enzym AST phần huyết thanh ở chuột thí nghiệm.<br /> huyết thanh tăng nhẹ trong thời gian ngắn<br /> (sau 7 ngày thí nghiệm) chưa có ảnh Bảng 5: Kết quả hàm lượng ure huyết<br /> hưởng đến tình trạng toàn thân chuột. thanh ở chuột nghiên cứu.<br /> Sau 1 tuần tiêm virut, hoạt độ enzym AST Nhóm Hàm lượng ure<br /> n<br /> (U/L) huyết thanh các nhóm chuột không nghiên cứu (mmol/l)<br /> khác biệt có ý nghĩa thống kê. 6<br /> Nhóm 1 (10 vp/con) 6 6,7 ± 1,67<br /> 7<br /> Bảng 3: Kết quả hoạt độ enzym ALT ở Nhóm 2 (10 vp/con) 6 7,2 ± 1,85<br /> chuột nghiên cứu. Nhóm 3 (chứng) 6 6,3 ± 1,06<br /> <br /> Nhóm Hoạt độ enzym p > 0,05<br /> n<br /> nghiên cứu ALT (U/L)<br /> 6<br /> Hàm lượng ure ở các nhóm chuột thí<br /> Nhóm 1 (10 vp/con) 6 33,0 ± 5,57<br /> nghiệm đều nằm trong giới hạn bình thường<br /> 7<br /> Nhóm 2 (10 vp/con) 6 43,3 ± 27,5 và tương tự nhau. Như vậy, 2 nhóm tiêm<br /> Nhóm 3 (chứng) 6 27,7 ± 8,21 Ad-IL12 ở 2 mức liều nghiên cứu (106 và<br /> 107 vp/chuột) không ảnh hưởng rõ rệt đến<br /> p > 0,05<br /> hàm lượng ure chuột thí nghiệm.<br /> <br /> 11<br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2019<br /> <br /> Bảng 6: Kết quả hàm lượng creatinin huyết thanh ở chuột nghiên cứu.<br /> <br /> Nhóm nghiên cứu n Hàm lượng creatinin (mcmol/l)<br /> 6<br /> Nhóm 1 (10 vp/con) 6 45,1 ± 8,72<br /> 7<br /> Nhóm 2 (10 vp/con) 6 36,9 ± 12,8<br /> <br /> Nhóm 3 (chứng) 6 48,7 ± 11,7<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> <br /> Hàm lượng creatinin huyết thanh ở các nhóm chuột thí nghiệm đều nằm trong giới<br /> hạn bình thường và tương tự nhau. Như vậy, Ad-IL12 ở 2 mức liều nghiên cứu (106 và<br /> 107 vp/chuột) không có ảnh hưởng rõ rệt đến hàm lượng creatinin huyết thanh chuột<br /> thí nghiệm.<br /> 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu IL-12 trong<br /> các tạng chuột sau khi tiêm Ad-IL12 đường tĩnh mạch.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại đoạn gen mã hóa IL-12 người<br /> từ mẫu ADN tổng số tách chiết từ các mẫu tạng của chuột.<br /> (Nhóm 1 (A); 2 (B) và nhóm chứng; gan (G), tim (Ti), cơ vân (Cơ), phổi (P), não (N),<br /> thận (Th) và huyết thanh (M); mẫu (-), chứng âm PCR; mẫu (+), chứng dương plasmid)<br /> <br /> 12<br />  T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2019<br /> <br /> Không phát hiện đoạn gen virut mã thước tương thích cho đóng gói. Việc loại<br /> hóa IL-12 người trong các mẫu tạng: tim, bỏ các gen của virut giảm mạnh đáp ứng<br /> gan, phổi, thận, não, cơ vân, huyết thanh độc tế bào của vật chủ [1, 2, 3].<br /> ở chuột được tiêm Ad-IL12 so với nhóm Một số công trình nghiên cứu của<br /> chứng không tiêm virut. Như vậy, Ad-IL12 Ng và CS (2001) cho thấy vector thế hệ<br /> với 2 liều tiêm, không phát triển, nhân lên thứ ba này an toàn hơn và độc tính giảm<br /> trong các mô, cơ quan của chuột được đáng kể khi sử dụng liều cao trên chuột<br /> kiểm tra. [0]. Ngoài ra, các thụ thể lipoprotein biểu<br /> hiện ở mức độ thấp khi sử dụng vector<br /> BÀN LUẬN HDAd được sản xuất trong thời gian dài<br /> Ad-IL12 không làm biến đổi các chỉ số nhằm chống lại hiện tượng xơ vữa động<br /> sinh hóa, phản ánh chức năng gan thận. mạch trên mô hình chuột có tiền sử tăng<br /> Chuột sau tiêm Ad-IL12 vẫn hoạt động cholesterol đã được đề cập đến trong<br /> bình thường, không chết và vẫn phát triển nghiên cứu của Nomura và CS [5]. Đồng<br /> đều. Các phản ứng khuếch đại tìm gen thời, vector này cũng sử dụng trong công<br /> mã hóa IL-12 không phát hiện thấy tim, nghệ ex vivo thông qua đưa gen xơ nang<br /> gan, phổi, thận, não, cơ vân, huyết thanh qua tuyến mồ hôi vào cơ thể con người<br /> ở các nhóm chuột được tiêm Ad-IL12. Khi cho hiệu quả chuyển gen cao [6]. Việc sản<br /> tiêm động vật với Ad vector thế hệ sớm xuất virut tái tổ hợp Helper-dependent<br /> (1, 2) kết quả gây độc tính muộn, xảy ra Adenovirus mang và dẫn chuyển gen trị<br /> 1 ngày đến vài tuần do biểu hiện mức độ liệu có thể lây nhiễm tế bào đích với hiệu<br /> thấp của protein virut từ mạch khuôn của quả cao, chất lượng tốt, loại bỏ tạp nhiễm<br /> vector. Trong khi đáp ứng với độc tính của Helper virus đang được tiếp tục tối<br /> gây ra bởi Ad thế hệ 3 (Helper-dependent ưu để có sản phẩm virut tái tổ hợp mang<br /> Adenovirus, HDAd) chỉ xuất hiện trong gen trị liệu an toàn.<br /> 24 - 48 giờ sau khi tiêm, do vắng mặt gen<br /> biểu hiện của virut. Việc sử dụng HDAd KẾT LUẬN<br /> đã đem lại ưu thế trong trị liệu, đồng thời Sử dụng Ad-IL12 với mức liều 106 và<br /> hạn chế rất nhiều độc tính các đoạn gen 107 vp/chuột không gây biến đổi chức<br /> độc trên Ad. Với mục đích thiết kế làm năng gan, thận chuột. Không phát hiện<br /> giảm tối ưu đáp ứng miễn dịch và cải thấy Ad-IL12 trong các tạng chuột bằng<br /> thiện hơn nữa độ an toàn của vector kỹ thuật PCR.<br /> Adenovirus, hệ thống vector HDAd đã ra<br /> đời. Đây là hệ vector được thiết kế để xóa TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> bỏ tất cả trình tự gen mang mã của virut 1. He X.X, Chang Y, Meng F.Y, Wang M.Y,<br /> (tức là loại bỏ tất cả gen gây độc của Xie Q.H, Tang F, Li P.Y, Song Y.H, Lin J.S.<br /> virut). Toàn bộ trình tự gen bị xóa bỏ của MicroRNA-375 targets AEG-1 in hepatocellular<br /> virut sẽ thay thế bằng thiết kế mang gen carcinoma and suppresses liver cancer cell<br /> trị liệu hoặc trình tự ADN không mang mã growth in vitro and in vivo. Oncogene. 2012,<br /> được gọi là “nhồi”, giữ cho vector có kích 31, pp.3357-3369.<br /> <br /> 13<br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2019<br /> <br /> 2. Nicola Brunetti-Pierri et al. Helper-dependent 5. Nomura S. Low-density lipoprotein receptor<br /> adenoviral vectors for liver-directed gene therapy. gene therapy using Helper-dependent<br /> Hum Mol Genet. 2011, 20 (1), pp.1-28. Adenovirus produces long-term protection<br /> 3. Robertson M.J et al. Interleukine 12 against atherosclerosis in a mouse model of<br /> immunotherapy after autologous stem cell familial hypercholesterolemia. Gene Therapy.<br /> transplantation for hematological malignancies.<br /> 2004, 11, pp.1540-1548.<br /> Clin Cancer Res. 2002, 8 (11), pp.3383-3393.<br /> 6. Palmer D et al. Improved system<br /> 4. Ng P.P. Cre levels limit packaging signal<br /> excision efficiency in the Cre/loxP helper- for Helper-dependent Adenoviral vector<br /> dependent adenoviral vector system. Journal production. Molecular Therapy. 2003, 8,<br /> of Virology. 2002, 76, pp.4181-4189. pp.846-852.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 14<br />