zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Luận Văn - Báo Cáo

» Báo cáo khoa học

Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên trong tế bào

Chia sẻ: Sunshine_3 Sunshine_3 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Báo xấu

46
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Miễn dịch hiển vi điện tử là phương pháp kết hợp kỹ thuật miễn dịch với kỹ thuật hiển vi điện tử để định vị các thμnh phần miễn dịch đặc hiệu, các đại phân tử sinh vật. Phương pháp định vị hiển vi điện tử các thμnh phần miễn dịch trong tế bμo có thể tiến hμnh theo nhiều phương pháp khác nhau. Trước tiên tế bμo cần cắt mỏng tại nhiệt độ thấp (không đúc) hoặc tại nhiệt độ phòng (có đúc). Việc đánh dấu miễn dịch có thể thực hiện trực tiếp hoặc gián tiếp trước khi đúc, sau khi đúc hoặc trên lát cắt lạnh ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên trong tế bào

TCNCYH 26 (6) - 2003 §Þnh vÞ miÔn dÞch hiÓn vi ®iÖn tö c¸c kh¸ng nguyªn trong tÕ bµo NguyÔn Kim Giao ViÖn VÖ sinh dÞch tÔ trung −¬ng Sù kÕt hîp c¸c kü thuËt miÔn dÞch víi kü thuËt hiÓn vi ®iÖn tö ®· ®−îc sö dông tõ l©u trong sinh häc tÕ bµo (TB). HiÖn nay ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch hiÓn vi ®iÖn tö (MDHV§T) ®−îc ¸p dông réng r·i ®Æc biÖt lµ nghiªn cøu chÈn ®o¸n vi sinh vËt. Trong nghiªn cøu nµy, chóng t«i ®· sö dông kü thuËt ®¸nh dÊu miÔn dÞch b»ng vµng gi¸n tiÕp sau khi ®óc víi tÕ bµo Vero nu«i cÊy nhiÔm vi rót sëi vµ tÕ bµo TVP nu«i cÊy nhiÔm vi rót rota SA11. Theo dâi c¸c h¹t ®en trªn ¶nh, chóng t«i ®· ®Þnh vÞ ®−îc c¸c vi rót rota trong tÕ bµo TVP vµ nhËn biÕt ®−îc qu¸ tr×nh h×nh thµnh cña vi rót sëi trong TB Vero. I. §Æt vÊn ®Ò Môc tiªu nghiªn cøu cña ®Ò tµi nh»m: MiÔn dÞch hiÓn vi ®iÖn tö lµ ph−¬ng 1. Lùa chän vµ x¸c ®Þnh ®−îc nh÷ng ph¸p kÕt hîp kü thuËt miÔn dÞch víi kü ®iÒu kiÖn, nh÷ng th«ng sè tèt nhÊt lµm tiªu thuËt hiÓn vi ®iÖn tö ®Ó ®Þnh vÞ c¸c thµnh b¶n miÔn dÞch hiÓn vi ®iÖn tö ph¸t hiÖn phÇn miÔn dÞch ®Æc hiÖu, c¸c ®¹i ph©n tö kh¸ng nguyªn mÆt ngoµi tÕ bµo phï hîp sinh vËt. víi ®iÒu kiÖn ViÖt Nam. Ph−¬ng ph¸p ®Þnh vÞ hiÓn vi ®iÖn tö c¸c 2. Nghiªn cøu x¸c ®Þnh sù tån t¹i cña thµnh phÇn miÔn dÞch trong tÕ bµo cã thÓ vi rót rota trªn tÕ bµo TVP vµ sù nh©n lªn tiÕn hµnh theo nhiÒu ph−¬ng ph¸p kh¸c cña vi rót sëi trªn tÕ bµo Vero trong qu¸ nhau. Tr−íc tiªn tÕ bµo cÇn c¾t máng t¹i tr×nh nu«i cÊy nhiÖt ®é thÊp (kh«ng ®óc) hoÆc t¹i nhiÖt ®é II. VËt liÖu, mÉu, thiÕt bÞ vµ qui phßng (cã ®óc). ViÖc ®¸nh dÊu miÔn dÞch tr×nh kü thuËt nghiªn cøu cã thÓ thùc hiÖn trùc tiÕp hoÆc gi¸n tiÕp 1. Nguyªn lý chung tr−íc khi ®óc, sau khi ®óc hoÆc trªn l¸t c¾t l¹nh [1, 3]. chÊt ®óc WF l¸t c¾t tÕ bµo tiªu b¶n chÊt cè ®Þnh (4,5% PFA 0,1% GA) l−íi ®óc c¾t l¸t máng cè ®Þnh Khö n−íc tÝm l−íi l−íi Quan s¸t HV§TTQ parafilm röa ®¸nh dÊu miÔn dÞch Nhuém d−¬ng b¶n 6
TCNCYH 26 (6) - 2003 H×nh 1: Qui tr×nh lµm tiªu b¶n ®Þnh vÞ kh¸ng nguyªn trong tÕ bµo sau ®óc mÉu Nh÷ng tÕ bµo hoÆc m« ®−îc cè ®Þnh vµ ®óc trong nh÷ng khu«n ®óc b»ng nh÷ng chÊt ®Æc biÖt ®Ó gi÷ cÊu tróc vµ b¶o toµn chøc n¨ng miÔn dÞch. Nh÷ng mÉu ®óc ®−îc c¾t thµnh nh÷ng l¸t cùc máng vµ ®Æt lªn trªn c¸c l−íi nicken. TiÕp ®ã nh÷ng l¸t c¾t ®−- îc béc lé tíi c¶ kh¸ng thÓ thø nhÊt, kh¸ng thÓ thø hai råi ®−îc röa vµ nhuém tr−íc khi kiÓm tra ë kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö truyÒn qua t¹i ®é phãng ®¹i cao. Kü thuËt c¾t cùc máng kh«ng nh÷ng cho phÐp ®Þnh vÞ nh÷ng kh¸ng nguyªn ë phÝa trong mÉu mµ cßn tiÕp cËn ®−îc tíi nh÷ng protein, nh÷ng kh¸ng nguyªn vµ nh÷ng ®¹i ph©n tö kh¸c trªn bÒ mÆt cña l¸t c¾t v× chóng sÏ bÞ béc lé trong qu¸ tr×nh c¾t. H×nh 1 lµ s¬ ®å chung lµm tiªu b¶n ®Ó ®Þnh vÞ kh¸ng nguyªn trong tÕ bµo sau ®óc mÉu . H×nh 2 lµ s¬ ®å ®¸nh dÊu miÔn dÞch hiÓn vi ®iÖn tö trªn l¸t c¾t máng. §iÒu cÇn chó ý ë ®©y lµ kh¸ng kh¸ng thÓ hoÆc kh¸ng thÓ thø hai ®−îc thay b»ng ProteinA-Au. H×nh 2: S¬ ®å ®Þnh vÞ kh¸ng nguyªn trªn l¸t c¾t b»ng ®¸nh dÊu miÔn dÞch g¾n vµng gi¸n tiÕp 2. VËt liÖu 4.1. M¸y c¾t tiªu b¶n siªu máng: - Ho¸ chÊt: paraformaldehyde, Ultramicrotome III (LKB, Thuþ §iÓn). glutaraldehyde, OsO4, ®Öm PBS, BSA, 4.2. KÝnh hiÓn vi ®iÖn tö truyÒn qua: ethanol, uranyl acetate, lead citrate . JEM 1010 (JEOL, Japan) víi c¸c th«ng - L−íi nicken, giÊy ¶nh ®en tr¾ng sè: Sterlin. phim FUJI-FG + §iÖn ¸p gia tèc ®iÖn tö 30-100KV, 3. MÉu nghiªn cøu + §é phãng ®¹i x 50-600.000, - TÕ bµo nu«i cÊy TVP nhiÔm vi rót + §é ph©n gi¶i 3A0 Rota dßng SA11 vµ kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu C¸c ¶nh chôp trªn phim FUJI-FG, in (nhËn tõ POLYOVAC) trªn giÊy ¶nh Sterlin hoÆc l−u trªn ®Üa cøng - TÕ bµo vero nu«i cÊy nhiÔm vi rót sëi cña hÖ Digital camera-Computer kÌm víi chñng v¸c xin Moraten vµ kh¸ng thÓ ®Æc JEM1010. hiÖu (nhËn tõ Khoa vi rót ViÖn VSDTTW) 5. Qui tr×nh kü thuËt 4. ThiÕt bÞ nghiªn cøu Qui tr×nh kü thuËt gåm hai b−íc nh− 7
TCNCYH 26 (6) - 2003 sau. mµng formvar phñ c¸c bon 5.1. Cè ®Þnh, ®óc vµ c¾t mÉu 5.2. Thùc hiÖn ®¸nh dÊu miÔn dÞch vµ a. Cè ®Þnh: 3% paraformaldehyde+0,2% nhuém d−¬ng b¶n glutaraldehyde trong ®Öm phosphate a. Röa l−íi nickel víi l¸t c¾t b»ng 2-3 pH 7,2-74 t¹i 40C. trong 40 phót ®Õn 1 giät PBS pH-7.2 giê b. §Æt næi l−íi trªn giät 1% hydrogen b. Röa: 0,1M ®Öm phosphate 2 lÇn 10 peroxide (v/v) trong 5 phót. Qu¸ tr×nh ¨n phót mßn nµy lµm béc lé nhiÒu h¬n c¸c kh¸ng nguyªn cña l¸t c¾t. Röa kü l−íi trong n−íc c. Röa: trong dung dÞch NH4Cl 0,05M cÊt. hoÆc 0,1M ®Öm phosphate (pH 7,2-74). c. §Æt næi l−íi trªn giät 2% PBS-BSA d. Khö n−íc: trong 20 phót ®Ó phãng bÕ c¸c vÞ trÝ kh¸ng + 30% ethanol (10 phót) nguyªn kh«ng ®Æc hiÖu. + 50% ethanol (10 phót) d. L−íi ®−îc ®Æt næi trªn giät kh¸ng thÓ + 70% ethanol (2 lÇn, 20 phót,) ®Æc hiÖu thø nhÊt pha lo·ng trong 0,5% + 90% ethanol (2 lÇn, 20 phót,) PBS-BSA vµ ñ trong 20 phót. + 100% ethanol (2 lÇn, 30phót) e. Röa thËn träng b»ng 0,2% PBS - e. TÈm: BSA, + 2/3 ethanol+1/3 LRWhite, 30 phót f. C¸c l−íi l¹i ®−îc ñ tiÕp trong proteinA g¾n h¹t vµng (d=5-10nm) trong 20 phót. + 1/2 ethanol+1/2 LRWhite, 30 phót h. Röa trong PBS mét sè lÇn + 1/3 ethanol+2/3 LRWhite, 30 phót i. Cè ®Þnh nhanh b»ng h¬i OsO4. f. Ng©m: k. Röa kü víi ammonium acetate 0,1% + LR White, 1 giê l. Nhuém d−¬ng 2 lÇn theo ph−¬ng + LR White, 18 giê ph¸p Reynold (uranyl acetate 5%, lead + LR White qua ®ªm citrtate 1%). C¸c l−íi ®−îc lµm kh« tõ tõ + LRWhite, 1-3 giê tr−íc khi quan s¸t. g. §óc: trong khu«n ®óc nh− capsule Chó ý: Trong suèt qu¸ tr×nh tiÕn hµnh, gelatin c¸c l−íi kh«ng ®−îc ®Ó kh« vµ thËn träng h. Lµm cøng: ®Ó tñ Êm 40-450C, tõ 1-3 gi÷ cho nã næi trªn mÆt giät. ngµy. Iii. KÕt qu¶ i. C¾t tiªu b¶n trªn m¸y c¾t siªu máng víi ®é dÇy 400-500A0 k. §Æt m¶nh c¾t trªn líi nicken cã 8
TCNCYH 26 (6) - 2003 100 nm H×nh 3. Mét phÇn cña tÕ bµo TVP víi vi rót rota ®−îc nh©n lªn 0,5 µ H×nh 4. Qu¸ tr×nh h×nh thµnh cña vi rót sëi trong tÕ bµo Vero 1. TÕ bµo nu«i cÊy TVP nhiÔm vi rót bµo nu«i cÊy TVP nhiÔm vi rót rota dßng rota dßng SA11 SA11. Thùc hiÖn viÖc ®Þnh vÞ kh¸ng nguyªn vi rót rota theo qui tr×nh trªn vµ Trong mét nghiªn cøu vÒ sù nh©n lªn nhËn ®−îc h×nh 3. Nh÷ng h¹t vµng trßn cña c¸c chñng vi rót rota trªn c¸c dßng tÕ ®en ®Ëm cã t¹i nh÷ng cÊu tróc trªn ¶nh bµo nu«i cÊy, chóng t«i nhËn ®−îc mÉu tÕ ( ) x¸c nhËn r»ng nh÷ng cÊu tróc ®ã lµ 9
TCNCYH 26 (6) - 2003 nh÷ng vi rót rota ®−îc nh©n lªn trong tÕ ®iÖn tö sÏ kh«ng cã ®é t−¬ng ph¶n cao v× bµo nu«i cÊy TVP. OsO4 lµ chÊt t¸n x¹ ®iÖn tö m¹nh [4]. 2. X¸c ®Þnh qu¸ tr×nh h×nh thµnh cña VÒ c¸c kh¸ng nguyªn cã mÆt trong vi rót sëi trong tÕ bµo Vero mÉu: c¸c kh¸ng nguyªn cã thÓ cßn rÊt Ýt H×nh 4 lµ l¸t c¾t máng cña tÕ bµo Vero sau cè ®Þmh víi glutaraldehyde, do ®ã c¸c ®· bÞ huû ho¹i do nhiÔm vµ nh©n lªn cña vi m« hoÆc tÕ bµo th−êng cè ®Þnh b»ng rót rota. B»ng kü thuËt ®¸nh dÊu miÔn dÞch formaldehyde (paraformaldehyde) hoÆc hiÓn vi ®iÖn tö trªn l¸t c¾t máng, ta cã thÓ b»ng hçn hîp cña formaldehyde víi theo dâi ®−îc vi rót trong qu¸ tr×nh h×nh glutaraldehyde (tû lÖ formaldehyde lµ tõ 2- thµnh. C¸c h¹t chÊm ®en lµ h¹t vµng chØ 8 % vµ glutaraldehyde lµ 0.1-0.5%). Mét c¸c kh¸ng nguyªn vi rót sëi n»m r¶i r¸c ®iÒu quan träng lµ c¸c kh¸ng nguyªn néi trong bµo t−¬ng. T¹i mét sè vïng bµo bµo cÇn dÔ dµng tiÕp cËn ®−îc víi c¸c t−¬ng s¸t mµng tÕ bµo h×nh thµnh kh¸ng thÓ b»ng c¸ch t¨ng tÝnh thÈm thÊu nucleocapcid vµ chuÈn bÞ ®©m chåi (→). qua c¸c mµng hoÆc b»ng c¸ch c¾t mÉu C¸c h¹t vi rót sëi t¸ch rêi khái mµng vµ tËp thµnh c¸c l¸t c¾t siªu máng. trung ë bªn ngoµi tÕ bµo ( ). C¸c tÕ bµo cã thÓ ®−îc lµm t¨ng tÝnh thÊm b»ng c¸c dung m«i h÷u c¬ nh− IV. Bµn luËn aceton, chlorofom, chÊt tÈy nh− saponin Nh− ®· tr×nh bÇy trong phÇn më ®Çu, hoÆc Twen80. miÔn dÞch hiÓn vi ®iÖn tö lµ kÕt hîp ®ång thêi hai ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu, ph−¬ng VÕ kü thuËt ®¸nh dÊu: Trong nghiªn ph¸p hiÓn vi ®iÖn tö vµ ph−¬ng ph¸p miÔn cøu nµy chóng t«i ®· sö dông c¸ch ®¸nh dÞch. dÊu miÔn dÞch gi¸n tiÕp ®Ó kh¾c phôc nh÷ng khã kh¨n kü thuËt (kh¸ng thÓ thø §øng vÒ mÆt sinh häc vµ sinh ho¸ häc, nhÊt rÊt khã thu ®−îc nhiÒu, sù céng hîp cã ba yªu cÇu cÇn thùc hiÖn ®Ó ®Þnh vÞ cña kh¸ng thÓ thø nhÊt víi ®Ých ®iÖn tö l¹i chÝnh x¸c bÊt cø ®¹i ph©n tö miÔn dÞch nµo rÊt khã, hiÖu suÊt kÐm vµ cã thÓ lµm ¶nh trong m«, tÕ bµo hoÆc ngay trªn c¸c vi rót. h−ëng xÊu tíi sù kÕt hîp cña kh¸ng thÓ §ã lµ cã ®−îc c¸c kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu vµ thø nhÊt víi kh¸ng nguyªn). ViÖc dÔ dµng c¸c chÊt ®¸nh dÊu, c¸c kh¸ng nguyªn cã cã ®−îc kh¸ng thÓ thø hai mµ ë ®©y chóng mÆt trong mÉu víi mét sè l−îng ®¸ng kÓ t«i sö dông ProteinA-Au (®· g¾n ®Ých ®iÖn vµ siªu cÊu tróc vi sinh vËt, tÕ bµo ®−îc tö Au víi ®−êng kÝnh lùa chän vµ cã b¸n gi÷ tèt [2, 3]. trªn thÞ tr−êng) ®¶m b¶o cho nghiªn cøu Ýt VÒ mÆt b¶o toµn siªu cÊu tróc: mÉu bÞ rñi ro [3] sinh vËt sÏ gi÷ ®−îc siªu cÊu tróc víi ®iÒu XuÊt ph¸t tõ yªu cÇu b¶o toµn siªu cÊu kiÖn lµ lÊy mÉu vµ cè ®Þnh mÉu tøc thêi vµ tróc sinh vËt vµ gi÷ ®−îc tÝnh kh¸ng xö lý tiÕp mÉu theo ph−¬ng ph¸p th−êng nguyªn cña mÉu ®ång thêi l¹i cã thÓ thùc qui. Cã mét sè chÊt cè ®Þnh ®−îc sö dông. hiÖn trong phßng thÝ nghiÖm HV§T cña Tuy nhiªn nh÷ng chÊt cè ®Þnh nµy (nh− ViÖn VÖ sinh dÞch tÔ trung −¬ng, chóng t«i OsO4) cã thÓ lµm gi¶m tÝnh kh¸ng nguyªn ®· chän c¸ch cè ®Þnh mÉu b»ng dung dÞch cña c¸c ph©n tö quan t©m nªn trong cè ®Þnh 3-4% paraformaldehyde +0,2% nghiªn cøu MDHV§T ng−êi ta th−êng h¹n glutaraldehyde trong dung dÞch ®Öm PBS, chÕ sö dông. Nh−ng ®iÒu bÊt lîi lµ kh«ng thêi gian 30-40 phót t¹i 40C, ®óc mÉu b»ng chØ c¸c tÕ bµo kh«ng cè ®Þnh tèt mµ ¶nh LR White t¹i 37-400C vµ ®¸nh dÊu miÔn 10
TCNCYH 26 (6) - 2003 dÞch gi¸n tiÕp trªn l¸t c¾t máng víi kh¸ng khái tÕ bµo ë ®ã vá ngoµi cña vi rót sëi thÓ thø hai thay b»ng proteinA-Au lµ thÝch ®−îc t¹o ra bëi mµng tÕ bµo. hîp. Tµi liÖu tham kh¶o Nh÷ng h×nh ¶nh HV§TTQ cña c¸c mÉu 1. Bozzola, J. J., and L. D. Russell. chôp ®−îc x¸c thùc viÖc lùa chän cña (1992). Electron Microscopy. Jones and chóng t«i lµ ®óng ®¾n. Bartlett, Boston, MA. 132 pp. V. KÕt luËn 2. Dawes, C. J. (1971). Biological - Th«ng qua nghiªn cøu ¸p dông, Techniques in Electron Microscopy. chóng t«i ®· chän ®−îc c¸ch cè ®Þnh mÉu Barnes and Noble Inc., New York. 240 pp. b»ng dung dÞch cè ®Þnh 3-4% 3. Hayat, M. A. (1989). Principles and paraformaldehyde +0,2% glutaraldehyde Techniques of Electron Microscopy: trong dung dÞch ®Öm PBS, thêi gian 30-40 Biological Applications. CRC Press, Boca phót t¹i 40C, ®óc mÉu b»ng LR White t¹i Raton, FL 469 pp. 37-400C vµ ®¸nh dÊu miÔn dÞch gi¸n tiÕp 4. Miller SE. Detection and trªn l¸t c¾t máng víi kh¸ng thÓ thø hai identification of viruses by electron ®−îc thay b»ng proteinA-Au. microscopy. J Electron Microsc Tech, - B»ng kü thuËt ®Þnh vÞ miÔn dÞch hiÓn 1986; 4:265-301. vi ®iÖn tö kh¸ng nguyªn trong tÕ bµo, ®· 5. Payne CM. Electron microscopy in x¸c ®Þnh ®−îc ch¾c ch¾n vi rót rota cã the diagnosis of infectious diseases. In: trong tÕ bµo nu«i cÊy TVP th«ng qua sù Connor DH, Chandler FW, Payne CM. chØ ®iÓm cña c¸c h¹t vµng. Electron microscopy in the diagnosis of - ThÊy râ qu¸ tr×nh nh©n lªn cña vi rót infectious diseases. In: Connor DH, sëi trªn tÕ bµo Ve ro, tõ giai ®o¹n tæng hîp Chandler FW. c¸c thµnh phÇn acide nucleic vµ protein cña vi rót trong tÕ bµo ®Õn giai ®o¹n nh÷ng virion hoµn chØnh nh− mäc chåi ®Ó t¸ch Summary Immunoelectronmicroscopic localization of Antigen in cells The Combination between Immunological techniques and Electron microscopy had been used in cellular biology for a long time. At present, Immunoelectronmicroscopic methods (IEM) are applied more, specially in the microbial diagnosis. In this study, We had used indirect immunogoldlabelling technique after embedding on Vero cells infected by measles viruses and TVP cells infected by rotavirus SA11. According to black particles in Immuno-electron microscopic figures, We localized rotaviruses in the TVP cells and realized the formaton of measles virus in the Vero cells. 11

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.01: Bộ Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Kinh Doanh MBA

165 tài liệu

2062 lượt tải

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.