Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu phân tích một số chất nhóm methylxanthines trong chè và phân loại chè Việt Nam dựa trên dữ liệu phổ

Chia sẻ: Acacia2510 _Acacia2510 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:22

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án là xây dựng và phát triển phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử và phổ hồng ngoại phản xạ kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến nhằm định lượng nhanh, chính xác một số hợp chất methylxanthines có mặt trong chè Việt Nam mà không cần tách loại chúng trên nền mẫu thực. Xây dựng và phát triển phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử và phổ hồng ngoại phản xạ kết hợp với thuật toán thống kê đa biến nhằm phân loại nguồn gốc địa lý chè Việt Nam dựa trên cùng dữ liệu phổ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu phân tích một số chất nhóm methylxanthines trong chè và phân loại chè Việt Nam dựa trên dữ liệu phổ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ HUẾ NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT NHÓM METHYLXANTHINES TRONG CHÈ VÀ PHÂN LOẠI CHÈ VIỆT NAM DỰA TRÊN DỮ LIỆU PHỔ CHUYÊN NGÀNH: Hóa Phân tích MÃ SỐ: 62440118 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC 1 - 2019 HÀ NỘI
Công trình đƣợc hoàn thành tại: - Khoa Hóa học – Trường ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐH Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: - PGS.TS. Tạ Thị Thảo - PGS.TS. Nguyễn Văn Ri 2
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ANN Artificial Neural Networks Mạng nơron nhân tạo CF Caffeine Cafein DA Discriminant Analysis Phân tích biệt thức HPLC High performer liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography IR Infrared reflectance spectroscopy Phổ hồng ngoại LC Liquid chromatography Sắc ký lỏng LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MC Mean centreing Phổ trung bình MS Mass Spectrometry Phổ khối MSC Multiplicative scatter correction Hiệu chỉnh phân tán nhiều lần PC Principal Component Cấu tử chính PCA Principal Component Analysis Phân tích cấu tử chính PCR Principal Component Regreesion Hồi quy cấu tử chính PLS Partial Least Squares Bình phương tối thiểu từng phần R Coeficient Regression Hệ số tương quan RB Robinson Briston Hệ đệm Robinson Briston Re Recovery Độ thu hồi RMSE Root mean square error Hệ số biến thiên SANAS Standad addition net analyte signal Phân tích thêm chuẩn đa biến SNV Standad normal transformation Biến đổi chuẩn hóa TB Theobromine Theobromin TP Theophylline Theophyllin UV-Vis Ultraviolet-visible Vùng tử ngoại – khả kiến LD Lâm Đồng PT Phú Thọ TN Thái Nguyên CTK Các tỉnh khác 3
GIỚI THIỆU VỀ LUẬN ÁN 1. Tính cấp thiết của Luận án Chè (Camellia sinensis L.o. Kuntze) từ lâu đã là một đồ uống quen thuộc của con người và được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, một số methylxanthines và các poliphenols trong chè có tác dụng phòng chống nhiều bệnh bao gồm bệnh tim mạch, hen suyễn, gan, các bệnh về răng miệng và đặc biệt có tác dụng phòng tránh, giảm nguy cơ mắc các bệnh ung thư. Trong lá chè, nhóm methylxanthines gồm ba chất là caffeine, theobromine và theophyline được quan tâm đặc biệt vì có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như: caffeine có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, tim và hô hấp; theobromine và theophyline là các chất có tác dụng làm giãn cơ trơn. Hiện nay, do nhu cầu sử dụng chè lớn đặc biệt là những loại chè có chất lượng cao đã dẫn tới thực trạng các sản phẩm chè nổi tiếng bị làm nhái thương hiệu với chất lượng không đảm bảo, nguồn gốc không rõ ràng. Trước thách thức trên, việc kiểm soát chất lượng và truy xuất nguồn gốc sản phẩm dần trở thành nhu cầu tất yếu mang lại những lợi ích thiết thực cho nhà sản xuất và người tiêu dùng. Trên thế giới, các nghiên cứu xác định đồng thời hàm lượng các methylxanthines trong chè chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performer Liquid Chromatography-HPLC). Ngoài ra, các nhà khoa học đang quan tâm phát triển nhóm các phương pháp phổ như quang phổ hấp thụ phân tử (Ultraviolet – Visible spectroscopy-UV-Vis) và quang phổ hồng ngoại phản xạ (Infrared reflectance spectroscopy – IR) kết hợp với các thuật toán thống kê đa biến cho phép xác định đồng thời các methylxanthines trong thực phẩm. So với các phương pháp phân tích hóa học, thì định lượng trong thực phẩm bằng phổ UV-Vis và phổ IR có ưu điểm nổi trội, không phải xử lý mẫu, phân tích nhanh, giá thành rẻ. Hiện nay, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào xác định đồng thời hàm lượng các methylxanthines trong chè và phân loại chè theo nguồn gốc địa lý dựa trên dữ liệu phổ UV-Vis, IR kết hợp với phân tích thống kê đa biến. Xuất phát từ các lý do nêu trên, đề tài luận án Tiến sĩ: “Nghiên cứu phân tích một số chất nhóm methylxanthines trong chè và phân loại chè Việt Nam dựa trên dữ liệu phổ” được thực hiện với 2 mục tiêu chính. 2. Mục tiêu chính của Luận án -Xây dựng và phát triển phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử và phổ hồng ngoại phản xạ kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến nhằm định lượng nhanh, chính xác một số hợp chất methylxanthines có mặt trong chè Việt Nam mà không cần tách loại chúng trên nền mẫu thực. 4
- Xây dựng và phát triển phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử và phổ hồng ngoại phản xạ kết hợp với thuật toán thống kê đa biến nhằm phân loại nguồn gốc địa lý chè Việt Nam dựa trên cùng dữ liệu phổ. 3. Những đóng góp mới của Luận án - Nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về xây dựng phương pháp phổ IR, UV-Vis phân tích định lượng methylxanthines trong chè Việt Nam. - Nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về xây dựng phương pháp phân loại nguồn gốc địa lý chè Việt Nam dựa trên dữ liệu phổ IR, UV-Vis. 4. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 3 chương, 32 bảng, 38 hình cùng các phụ lục, 110 tài liệu tham khảo. Luận án gồm 129 trang, gồm các phần chính: Đặt vấn đề (4 trang); Tổng quan (35 trang); Thực nghiệm (18 trang); Kết quả nghiên cứu và bàn luận (70 trang); Kết luận và Kiến nghị (2 trang). NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về chè và thị trƣờng chè của Việt Nam 1.1.1. Phân loại chè Việt Nam Chè có tên khoa học là Camellia sinensis, là loại cây xanh lưu niên mọc thành bụi hoặc các cây nhỏ, thông thường được cắt tỉa để thấp hơn 2 mét (6 ft) khi được trồng để lấy lá. Ở Việt Nam, chè phân bố tự nhiên tập trung ở vùng trung du miền núi nhiệt độ 15-230C, độ cao so với mực nước biển trên 1000 mét tại một số tỉnh miền núi phía Bắc: Thái Nguyên, Phú Thọ, Hà Giang, … và Lâm Đồng. Tùy theo giống chè, điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng, kĩ thuật chăm bón, canh tác, chế biến ...thì thành phần hóa học và giá trị kinh tế của chè sẽ khác nhau do đó có thể có các cách thức phân loại chè khác nhau: phân loại theo nguồn gốc thực vật, theo cách thức chế biến, theo nguồn gốc địa lý [4]. 1.1.2. Thành phần hóa học trong chè Chất lượng chè thành phẩm được quyết định bởi những thành phần hóa học của nguyên liệu và kỹ thuật chế biến. Thành phần sinh hóa của chè biến đổi rất phức tạp phụ thuộc vào giống, tuổi chè, điều kiện thổ nhưỡng, kỹ thuật canh tác, kĩ thuật chế biến… Trong thành phần lá chè xanh, nước chiếm 75- 80%, 20% tanin (hỗn hợp các catechine và dẫn xuất của chúng), 3-4% caffeine, và hàm lượng các chất khác (bảng 1.1) [4, 97]. 1.2. Giới thiệu về methylxanthines 1.2.1. Đặc điểm cấu tạo và tính chất Xanthine là một purine cơ sở được tìm thấy trong hầu hết các mô và chất của con người và các sinh vật khác. Methylxanthine là dẫn xuất methyl hóa của xanthine, chúng là các hợp chất hữu cơ dị vòng được xây dựng từ các vòng pyrimidinedione và imidazole. Methylxanthines bao gồm caffeine, 5
theobromine, theophylline, aminophylline, paraxanthine, pentoxifylline, IBMX. Các methylxanthines thường được dùng là chất kích thích nhẹ, giãn phế quản và điều trị các triệu chứng hen suyễn. Trong chè, cà phê, ca cao thường chỉ tìm thấy ba methylxanthines là caffeine (1,3,7-trimethylxanthine), theophylline (1,3-dimethylxanthine) và theobromine (3,7-dimethylxanthine). Công thức cấu tạo của các methylxanthines được thể hiện trong bảng 1.3 [63]. 1.2.2.Tác dụng sinh hóa Trong ba methylxanthines (caffeine, theobromine và theophylline), caffeine chiếm khối lượng lớn nhất, theobromine và theophylline chiếm lượng nhỏ hơn. Ví dụ: caffeine ước tính chiếm 0,4-2,4% trọng lượng khô trong cà phê và 2-5% trong chè; theobromine và theophylline chỉ chiếm khoảng 0,33% trọng lượng khô trong chè. Methylxanthines có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, làm cho tinh thần minh mẫn, là chất kích thích cơ năng và tăng cường hoạt động của tim. 1.3. Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng methylxanthines trong chè 1.3.1. Phương pháp săc kí lỏng hiệu năng cao Phương pháp HPLC là phương pháp phổ biến, được áp dụng nhiều nhất trong phân tích định lượng các methylxanthines trong chè. Theo các nghiên cứu trên thế giới, pha tĩnh được sử dụng phổ biến nhất là C18 với kích thước cột khác nhau. Pha động thường là các dung môi phân cực như H2O, MeOH, ACN…hay hỗn hợp của 2 hay 3 dung môi này theo những tỷ lệ nhất định. Một số loại detector đã được sử dụng như: detector quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis), detector khối phổ (MS) …[17, 24, 34, 65, 66]. Ở Việt Nam, theo TCVN 9744:2013 qui định phương pháp HPLC để xác định hàm lượng cafein của chè xanh như sau: Caffeine trong mẫu chè xanh được chiết bằng cách cho hồi lưu với nước có magie oxit. Sau khi lọc, hàm lượng caffeine được định lượng bằng HPLC với điều kiện: detector UV-273nm, cột tách C18 Partisphere kích thước 110 mm x 4,6 mm với hệ thống HPLC của hãng Whatman, dung môi pha động methalnol:nước (30:70, v/v), tốc độ dòng 1,0 ml/phút. 1.3.2. Phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến Định lượng các hợp chất hữu cơ bằng phổ hồng ngoại có ưu điểm nổi trội về đơn giản trong quá trình tiền xử lý mẫu, lượng mẫu phân tích ít, không cần phá hủy mẫu phân tích, quá trình chuẩn bị mẫu đơn giản, chi phí thấp do đó có thể hạn chế được các sai số trong quá trình chuẩn bị mẫu. trong vòng hai thập kỉ trở lại đây đã có rất nhiều công trình nghiên cứu định lượng các hợp chất hữu ích trong chè. Các mẫu chè thường được đo bằng phổ hồng ngoại phản xạ trong vùng số sóng 10.000 – 4000 cm-1. Dữ liệu phổ hồng ngoại kết hợp thuật toán hồi quy đa biến PLS đã định lượng thành công các 6
methylxanthines, poliphenols trong các mẫu chè. Các thuật toán tiền xử lý số liệu như SNV, MSC, MC cũng đã được ứng dụng để thu được kết quả tốt hơn [32, 37, 50, 70, 74, 82, 102]. 1.3.3. Phương pháp phổ quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến Trên thế giới, các nhà khoa học đã nghiên cứu phát triển phương pháp UV-Vis với mục đích định lượng các methylxanthines trong các nền mẫu phức tạp như chè, cà phê [49, 49, 60, 75, 92]… Để loại bỏ tannin trong nền mẫu, các mẫu chè sau khi ủ trong nước nóng ở 1000C sẽ được loại bỏ tannin bằng cách thêm dung dịch chì acetaete, lượng chì acetate được loại bỏ bằng dung dịch natri cacbonate. Dung dịch sau khi loại tannin sẽ đo phổ hấp thụ UV-Vis trong khoảng bước sóng 200-400 nm. Ma trận dữ liệu phổ được xử lý bằng mô hình hồi quy tuyến tính PLS [59] hoặc mô hình hồi quy phi tuyến tính ANN [49] trong đó nồng độ cafein, theobromin đã được xác định bằng phương pháp HPLC. Tuy nhiên, với phương pháp trên các nghiên cứu mới chỉ dừng lại trong việc xác định nồng độ CF trong các mẫu chè, TB và TP với hàm lương rất nhỏ nên không thể định lượng. 1.4. Ứng dụng thống kê đa biến trong phân loại chè 1.4.1. Các phương pháp nhận dạng và phân loại đối tượng 1.4.2. Phân loại chè dựa trên dữ liệu hàm lượng chất phân tích trong mẫu Chè được phân loại dựa trên hàm lượng các hợp chất hữu cơ chiếm lượng lớn trong chè như catechin, methylxathines, axit gallic… [27, 31, 41] hoặc dựa vào hàm lượng các kim loại trong chè [13, 58, 64, 71, 98, 105]. 1.4.3. Phân loại chè dựa trên dữ liệu phổ kết hợp thống kê đa biến Trong những năm gần đây, đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng các phương pháp phổ như IR, UV-Vis, NMR… kết hợp với phương pháp thống kê đa biến nhằm mục đích phân loại nguồn gốc chè [28, 38, 61, 62, 67, 95, 105]. 1.3 Kết luận phần tổng quan Thông qua tổng quan nhận thấy cần thiết xây dựng và phát triển phương pháp định lượng các methylxanthines và phân loại nguồn gốc địa lý chè Việt Nam dựa trên dữ liệu phổ. ừ những thực tiễn trên, luận án tiến sĩ “Nghiên cứu phân tích một số chất nhóm methylxanthines trong chè và phân loại chè Việt Nam dựa trên dữ liệu phổ” được thực hiện với các nội dung chính như sau: (1) Phát triển phương pháp tiêu chuẩn HPLC để phân tích các chất nhóm methylxanthines trong chè xanh làm cơ sở dữ liệu cho phân tích bằng phương pháp UV-Vis và IR kết hợp với hồi quy đa biến. (2) Nghiên cứu xây dựng quy trình xác định đồng thời nhóm các chất 7
methylxanthines trong chè xanh Việt Nam bằng phương pháp UV-Vis và IR kết hợp với hồi quy đa biến: nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến tuyến tính và phi tuyến tính trên cơ sở ma trận hàm lượng ba chất trong mẫu chè được xác định bằng phương pháp HPLC và ma trận tín hiệu thu được từ phương pháp UV-Vis và IR. (3) Ứng dụng qui trình phân tích xây dựng được để phân tích một số mẫu chè đang lưu hành trên thị trường và so sánh kết quả với phương pháp tiêu chuẩn HPLC. (4) Nghiên cứu xây dựng mô hình phân loại nguồn gốc địa lý của chè xanh Việt Nam trên cơ sở dữ liệu phổ UV-Vis và IR kết hợp với các thuật toán nhận dạng. CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 125 mẫu chè xanh thành phẩm được lấy trực tiếp từ cơ sở sản xuất có nguyên liệu lá chè xanh thuộc các tỉnh: Thái Nguyên, Lâm Đồng, Phú Thọ, Hà Giang, Yên Bái, Tuyên Quang, Hòa Bình. Trong đó: Thái Nguyên 35 mẫu, Lâm Đồng 25 mẫu, Phú Thọ 31 mẫu và 34 mẫu chè ở các tỉnh khác (Hà Giang, Yên Bái, Tuyên Quang). 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp định lượng đồng thời ba chất TB, TP và CF trong các mẫu chè 2.2.2.1. Phát triển phương pháp HPLC xác lập điều kiện tách TB, TP và CF Bước 1: Tối ưu hóa hệ thống HPLC: - Khảo sát: dung môi pha động, tỉ lệ thành phần pha động, tốc độ dòng…. Bước 2: Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích: - Tính chọn lọc, đặc hiệu và độ tinh khiết pic - Xây dựng đường chuẩn và đánh giá đường chuẩn: - Tính thích hợp của hệ thống - Độ lặp lại trong ngày - Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp. - Độ đúng (hiệu suất thu hồi) Bước 3: Xây dựng qui trình xử lý mẫu: nhiệt độ chiết, thời gian chiết mẫu 2.2.2.2. Phương pháp phổ IR, UV-Vis Bước 1: Tiến hành đo phổ IR, UV-Vis của từng mẫu ta thu được ma trận tín hiệu Bước 2: Xây dựng các mô hình hồi quy đa biến dựa trên ma trận tín hiệu của 25 mẫu chè và ma trận nồng độ tương ứng đã được xác định bằng HPLC.Trên 8
phần mềm Matlad sử dụng phương pháp PCR, PLS, ANN để xây dựng mô hình. Bước 3: Kiểm tra độ chính xác của mô hình thông qua 10 mẫu chè đã biết trước nồng độ các chất (bằng phương pháp HPLC), đánh giá sai số tương đối và các hệ số tương quan để lựa chọn mô hình phù hợp. Bước 4: Tiến hành đo mẫu thực tế dựa trên mô hình đã được xây dựng. 2.2.2. Phương pháp phân loại Bước 1: Tiến hành đo phổ IR, UV-Vis của từng mẫu ta thu được ma trận tín hiệu Bước 2: Sử dụng phương pháp thống kê PCA-DA và PLS- DA, ANN để phân loại chè theo nguồn gốc địa lý. Bước 3: Kiểm tra thử các mẫu chè bằng mô hình vừa xây dựng. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Phát triển phƣơng pháp HPLC định lƣợng đồng thời CF, TB, TP trong chè xanh 3.1.1.Tối ưu hóa các điều kiện tách CF, TB, TP trên hệ HPLC-UV 3.1.1.1 Khảo sát thành phần pha động  Khảo sát thành phần pha động và chương trình rửa giải Khảo sát một số loại pha động khác nhau gồm: MeOH/Nước; MeOH/ đệm phosphate; ACN/Nước; ACN/đệm phosphate. Từ kết quả thu được, lựa chọn hệ pha động là ACN và đệm phosphate.  Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ thành phần pha động Tiến hành khảo sát 3 tỉ lệ thể tích pha động ACN/đệm phosphate: 10/90, 15/85, 20/80. Kết quả thu được cho thấy tỉ lệ pha động ACN/đệm phosphate: 15/85 (v/v) là tốt nhất.  Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động Tiến hành khảo sát các tốc độ dòng pha động: 0,8 ml/phút, 1,0 ml/phút, 1,2 ml/phút. Từ đó, lựa chọn được tốc độ dòng tối ưu cho quá trình phân tích sắc ký là 1,0 ml/phút. Từ các kết quả khảo sát trên, lựa chọn được điều kiện tối ưu cho quá trình phân tích methylxanthines trong chè xanh. + Cột: C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) + Detector UV: 272 nm + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Nhiệt độ: nhiệt độ thường (250C-350C) + Thể tích mẫu tiêm vào cột: 10 µl + Hệ dung môi pha động: ACN/đệm phosphate: 15/85 (v/v) 9
TB - 3.5 1.10 1.00 TP - 4.2 0.90 0.80 CAF - 5.8 0.70 0.60 AU 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 Minutes a b Hình 3.1. SKĐ HPLC-UV phân tích TB, TP, CF tối ưu (a-mẫu chuẩn; b-mẫu chè xanh) 3.1.1.2 Xây dựng các phương trình đường chuẩn Các giá trị Pvalue thu được đều lớn hơn 0,05, chứng phương pháp xây dựng được không mắc sai số hệ thống (cả sai số hệ thống biến đổi và sai số hệ thống không đổi). Từ đó, xác định LOD và LOQ của đường chuẩn Bảng 3.1. LOD và LOQ của TB, TP, CF tính theo phương trình đường chuẩn Phƣơng trình đƣờng LOD LOQ Chất Sy b chuẩn (ppm) (ppm) TB y = 41401x – 14371 13896 41401 1,0 3,4 TP y = 37233x – 9488.9 9788 37233 0,8 2,6 CF y = 31341x – 17432 38925 31341 4,1 12,4 Hình 2 Đường chuẩn xác định TB, TP, CF bằng phương pháp HPLC 3.1.2.2 Độ chụm (độ lặp lại): Độ lệch chuẩn tương đối RSD% của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với ba chất phân tích có giá trị từ 0,16 – 8,2%. Như vậy, các kết quả đều nằm trong giới hạn cho phép của AOAC. Vì vậy phương pháp này có độ lặp phù hợp với sác xuất thống kê. 3.1.2.3 Độ đúng (độ thu hồi): Hiệu suất thu hồi trung bình đối với TB, TP, CF nằm trong khoảng cho 95% -115%. Chứng tỏ phương pháp phân tích xây dựng được có độ chính xác cao, có thể dùng để phân tích định lượng TB, TP, CF trong chè xanh. 3.1.3. Phân tích mẫu thực tế 3.1.3.1.Khảo sát điều kiện chiết mẫu 10
* Khảo sát thời gian chiết mẫu: Kết quả cho thấy, khi thay đổi thời gian chiết khác nhau (1 phút, 3 phút, 5 phút, 10 phút) thì hiệu suất chiết tăng và tiếp tục tăng từ 10 phút đến 15 phút thì hiệu suất chiết gần như không đổi. Chọn thời gian chiết là 10 phút cho khảo sát tiếp theo. * Khảo sát nhiệt độ chiết mẫu: Kết quả cho thấy, khi thay đổi nhiệt độ chiết khác nhau (200C, 500C, 700C, 800C, 900C ) thì hiệu suất chiết tăng và tiếp tục tăng từ 900C đến 1000C thì hiệu suất chiết gần như không đổi. Chọn nhiệt độ chiết là 900C là tối ưu. 3.1.3.2. Phân tích mẫu thực tế Kết quả hàm lượng ba chất trong mẫu chè thể hiện ở bảng 3.2. ảng 2 Hàm lượng TB, TP và CF trong mẫu chè Hàm lƣợng ba chất Hàm lƣợng ba chất STT Mẫu trong mẫu (mg/g) STT Mẫu trong mẫu (mg/g) TB TP CF TB TP CF 1 TN1 4,46 4,34 49,35 21 LD4 1,96 3,39 17,93 2 TN2 6,01 4,32 44,02 22 LD5 3,07 3,27 33,32 3 TN3 3,59 4,64 47,37 23 LD6 4,06 3,79 35,23 4 TN4 4,16 4,89 43,99 24 LD7 2,49 3,25 23,93 5 TN5 4,07 4,51 65,79 25 LD8 2,82 2,03 21,81 6 TN6 4,18 4,74 58,83 26 LD9 2,51 4,58 40,02 7 TN7 4,92 5,55 54,95 27 LD10 3,86 2,76 25,60 8 TN8 5,12 6,79 77,72 28 CTK1 4,20 5,48 63,51 9 TN9 3,36 6,92 77,01 29 CTK2 1,58 4,09 33,48 10 TN10 2,27 4,52 58,48 30 CTK3 3,35 3,56 26,98 11 TN11 4,00 5,17 53 31 CTK4 5,49 2,70 58,06 12 TN12 3,42 5,14 64,46 32 CTK5 3,31 2,38 79,39 13 TN13 3,86 5,3 54,23 33 CTK6 4,37 3,36 65,89 14 TN14 4,13 4,16 65,54 34 CTK7 1,40 1,35 50,82 15 TN15 4,16 5,07 55,19 35 CTK8 3,34 4,43 56,26 16 TN16 2,94 4,44 53,47 36 CTK9 4,19 5,23 58,64 17 TN17 4,26 5,29 53,28 37 CTK10 1,25 2,54 62,86 18 LD1 3,61 1,34 21,78 38 CTK11 3,62 5,48 59,02 19 LD2 3,66 2,66 24,62 39 CTK12 4,08 3,86 43,87 20 LD3 5,07 3,05 23,59 40 CTK13 3,33 4,46 54,47 11
3.1.4. Kết luận về phương pháp HPLC phát triển được: - Từ những kết quả thu được thấy rằng HPLC là phương pháp phân tích hiệu quả và chính xác đồng thời thành phần xanthines có trong mẫu chè. - Bộ số liệu từ HPLC có thể dùng để làm bộ số liệu chuẩn để xây dựng mô hình hồi quy đa biến nhằm định lượng đồng thời TB,TP và CF bằng phổ hồng ngoại và phổ UV-Vis 3.2. Nghiên cứu định lƣợng đồng thời ba methylxanthines trong chè bằng quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến 3.2.1. Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính 3.2.1.1. Phổ UV-Vis các dung dịch CF, TB, TP và các mẫu chè Phổ UV-Vis (190-700 nm) của các mẫu chè thu được ở hình 3.2(a) cho thấy có sự xuất hiện píc đặc trưng trong vùng bước sóng 190-240nm và 240- 310nm. Tuy nhiên, trong vùng bước sóng 190-240nm độ hấp thụ lặp lại kém. Chọn dữ liệu trong vùng phổ 240-310nm để tiến hành định lượng CF, TB, TP trong các mẫu chè. Abs Abs nm nm Hình 3.3. Phổ UV-Vis của các mẫu chè 3.2.1.2. Khảo sát tính chất cộng tính của caffeine, theobromine và theophylline Kết quả cho thấy phổ hấp thụ của ba chất có tính cộng tính nên sử dụng phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính để xác định đồng thời ba chất trên. Mặt khác, kết quả cho thấy nền mẫu có ảnh hưởng tới phép định lượng ba hợp chất này trong chè. Do vậy, để thu được kết quả chính xác cần phải loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu bằng cách loại bỏ các yếu tố gây ảnh hưởng hoặc sử dụng phương pháp thêm chuẩn đa biến. 12
3.2.1.3. Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến tuyến tính Ma trận mẫu chuẩn và ma trận mẫu kiểm tra định lượng đồng thời ba methylxanthines trong mẫu chè trình bày trong bảng 3.3. và bảng 3.4. Bảng 3.3. Hàm lượng CF, TB, TP trong các mẫu chè xanh sử dụng làm mẫu chuẩn STT Mẫu Hàm lƣợng ba chất STT Mẫu Hàm lƣợng ba chất trong mẫu (mg/g) trong mẫu (mg/g) TB TP CF TB TP CF 1 CTK1 4,20 5,48 63,51 14 TN8 5,12 6,79 77,72 2 CTK2 1,58 4,09 33,48 15 TN9 3,36 6,92 77,01 3 CTK3 3,35 3,56 26,98 16 TN10 2,27 4,52 58,48 4 CTK4 5,49 2,70 58,06 17 TN11 4,00 5,17 53 5 CTK5 3,31 2,38 79,39 18 TN12 3,42 5,14 64,46 6 CTK6 4,37 3,36 65,89 19 LD1 3,61 1,34 21,78 7 CTK7 1,40 1,35 50,82 20 LD2 3,66 2,66 24,62 8 CTK8 3,34 4,43 56,26 21 LD3 5,07 3,05 23,59 9 TN1 4,46 4,34 49,35 22 LD4 1,96 3,39 17,93 10 TN2 6,01 4,32 44,02 23 LD5 3,07 3,27 33,32 11 TN3 3,59 4,64 47,37 24 LD6 4,06 3,79 35,23 12 TN4 4,16 4,89 43,99 25 LD7 2,49 3,25 23,93 13 TN7 4,92 5,55 54,95 Bảng 3.4 Hàm lượng CF, TB, TP trong các mẫu chè xanh sử dụng làm mẫu kiểm tra STT Mẫu Hàm lƣợng ba STT Mẫu Hàm lƣợng ba chất trong mẫu chất trong mẫu (mg/g) (mg/g) TB TP CF TB TP CF 1 TN5 4,07 4,51 65,79 6 LD8 2,82 2,03 2,82 2 TN6 4,18 4,74 58,83 7 LD9 2,51 4,58 2,51 3 TN13 3,86 5,30 54,23 8 CTK9 4,19 5,23 58,64 4 TN14 4,13 4,16 65,54 9 CTK10 1,25 2,54 62,86 5 TN15 4,16 5,07 55,19 10 CTK11 3,62 5,48 59,02  Mô hình PCR Kết quả xử lý PCA cho thấy PC1 đã chiếm 63% tổng phương sai của tập số liệu. thêm PC2 thì tổng phương sai tích lũy đã được 98 %. Như vậy với 2 cấu tử đầu tiên đã chứa hầu hết thông tin của tập số liệu, chúng tôi lựa chọn số PC=2 để bắt đầu khảo sát lựa chọn số PC tối ưu. Độ chính xác của mô hình khi thay đổi các số PC từ 2 đến 20 được chỉ ra trong bảng 3.5. 13
Bảng 3.5 Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định các methylxanthin trong mẫu kiểm tra theo phương pháp UV-Vis kết hợp với PCR Hệ số tương quan R Hệ số biến thiên Số RMSE PC TB TP CF TB TP CF 2 0,18 0,00 0,18 0,94 1,56 15,84 5 0,53 0,28 0,14 0,73 1,37 17,57 10 0,54 0,36 0,31 0,73 1,32 15,84 15 0,76 0,43 0,25 0,69 1,26 14,95 17 0,79 0,41 0,28 0,61 1,19 15,58 20 0,90 0,35 0,24 0,45 1,22 15,10 Kết quả thu được sau khi sử dụng phương pháp PCR cho thấy khi thay đổi số PC từ 2 đến 20 thì giá trị R thấp và không biến đổi nhiều đối với TB và TP. hệ số biến thiên RMSE đối với CF tương đối cao. Do vậy không nên sử dụng phương pháp PCR trong phân tích định lượng đồng thời các methylxanthin bằng phổ UV-Vis.  Mô hình PLS Kết quả thu được cho thấy 11 cấu tử đầu tiên chứa hầu hết lượng thông tin của tập số liệu, lựa chọn PC= 11 đến 20 để khảo sát số PC tối ưu. Độ chính xác của mô hình khi thay đổi các số PC từ 2 đến 20 được chỉ ra trong bảng 3.6.. Bảng 3.6 Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định các methylxanthin trong mẫu kiểm tra theo phương pháp UV-Vis kết hợp với PLS Hệ số tƣơng quan Hệ số biến thiên Số R RMSE PC TB TP CF TB TP CF 11 0,49 0,65 0,63 0,72 0,78 8,45 12 0,60 0,78 0,68 0,69 0,65 7,77 13 0,67 0,79 0,74 0,62 0,68 7,03 14 0,75 0,78 0,71 0,51 0,58 7,77 15 0,72 0,77 0,72 0,55 0,61 7,72 16 0,82 0,81 0,73 0,46 0,54 7,55 17 0,87 0,81 0,72 0,44 0,54 7,53 18 0,88 0,83 0,71 0,41 0,51 7,65 19 0,84 0,81 0,72 0,54 0,54 7,54 20 0,84 0,81 0,72 0,53 0,53 7,46 14
Khi tăng số PC từ 11 đến 18 hệ số tương quan R tăng rõ rệt, ngược lại hệ số biến thiên RMSE giảm dần. Tiếp tục tăng số PC thì PC bằng 19 thì hệ số tương quan R giảm và hệ số biến thiên RMSE tăng. Tuy nhiên các giá trị R còn chưa cao điều này có thể do PLS là mô hình hồi quy đa biến tuyến tính nên khi làm việc với các mẫu có tương tác chưa biết của chất phân tích với nền mẫu cũng như ảnh hưởng của nền mẫu đáng kể thì sai số của phép đo tương đối lớn. Do đó, việc loại bỏ các chất gây ảnh hưởng hoặn áp dụng phương pháp thêm chuẩn đa biến để loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu là cần thiết.  Loại trừ ảnh hưởng của tannin trong nền mẫu chè Tiến hành xây dựng mô hình với 25 mẫu chuẩn và 10 mẫu kiểm tra sau khi loại tannin sử dụng số PC=20 với mô hình PCR và PC=18 với mô hình PLS. Kết quả thu được ở bảng 3.7. Bảng 3.7 Độ chính xác của mô hình PCR và PLS xác định các methylxanthin trong mẫu kiểm tra trước và sau khi loại tannin Mô hình PCR Mô hình PLS TB TP CF TB TP CF Không R 0,90 0,35 0,24 0,88 0,83 0,71 loại tanin RMSE 0,45 1,22 15,10 0,41 0,51 7,65 Loại R 0,92 0,45 0,42 0,84 0,87 0,72 tannin RMSE 0,43 1,13 14,10 0,54 0,49 7,54 Kết quả thu được ở bảng 3.14 cho thấy , giá trị RMSE thu được ở cả hai mô hình PLS và PCR sau khi đã loại tannin trong nền mẫu chè đã được cải thiện nhưng không đáng kể. Do đó, chúng tôi nghiên cứu sử dụng phương pháp thêm chuẩn đa biến để loại ảnh hưởng của nền mẫu trong phép định lượng ba methylxanthines trong các mẫu chè bằng phương pháp UV-Vis. 3.2.1.2. Phương pháp thêm chuẩn đa biến sử dụng mô hình SANAS Phương trình thêm chuẩn đa biến SANAS xác định đồng thời CF, TB, và TP dựa trên ma trận tín hiệu của 15 mẫu thêm chuẩn và ma trận tín hiệu đo của 15 mẫu tại 71 số sóng là độ hấp thụ quang trong vùng phổ từ 240-310 nm. Kết quả được chỉ ra trong các hình 3.4, 3.5. Hình 3.4 Đường thêm chuẩn xác định nồng độ methylxanthines trong mẫu xanh Thái Nguyên 15
Hình 3.5 Đường thêm chuẩn xác định nồng độ methylxanthines trong mẫu xanh Hà Giang Từ phương trình đường thêm chuẩn tính hàm lượng (mg/g) CF và TB trong các mẫu chè, đối chứng với phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC kết quả được chỉ ra trong bảng 3.8. Bảng 3.8. Kết quả phân tích hàm lượng TB, TP và CF trong các mẫu chè Hàm lƣợng Hàm lƣợng Hàm lƣợng TP CF (mg/g) TB (mg/g) (mg/g) Mẫu chè HPL UV- UV- UV-Vis HPLC HPLC C Vis Vis TN10 60,02 58,48 2,06 2,27 - < 1,49 CTK7 54,96 50,82 1,51 1,40 - 4,52 3.2. Nghiên cứu định lƣợng đồng thời ba methylxanthines trong chè bằng phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến 3.2.1. Phổ hồng ngoại phản xạ của các mẫu chè Tín hiệu phổ hồng ngoại phản xạ của 35 mẫu chè trong vùng phổ 4000-10000 cm-1 được trình bày ở hình 3.6. Nhận thấy trong vùng số sóng 4000-10000 cm-1 có đỉnh pic đặc trưng và rõ ràng. Sự xuất hiện các đỉnh pic đặc trưng trong vùng 4200- 5200cm-1 là do các liên kết C=O, C- C và C-N trong phân tử các methyxanthines quay và dao động. Đồng thời, trong vùng số song 6900 Hình 6. Dữ liệu phổ hồng ngoại phản cm-1 và 8800 cm-1 xuất hiện các pic xạ của 35 mẫu chè là do chuyển động quay và dao động của nhóm –CH3. 3.2.3. Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến tuyến tính 3.2.3.1. Mô hình PCR 16
Sau khi xử lý PCA cho thấy PC1 chiếm 78% tổng phương sai của tập số liệu. thêm PC2 thì tổng phương sai tích lũy đã được 98 %. Do vậy, lựa chọn số PC=2 để bắt đầu khảo sát lựa chọn số PC tối ưu. Độ chính xác của mô hình PCR với ma trận tín hiệu mẫu kiểm tra trước và sau khi tiến hành xử lý tiền số liệu khi thay đổi các số PC từ 2 đến 20 được trình bày trong hình 3.7. Từ kết quả số hình 3.6 có thể thấy khi tăng số PC từ 2 đến 5 hệ số tương quan R2 tăng rõ rệt, ngược lại hệ số biến thiên RMSE giảm. Chọn PC và phương pháp tiền xử lý tối ưu: TB: PC=9, MC; TP: PC=3, SNV; CF: PC=15, SNV. Hình 7 Độ chính xác của mô hình hồi quy xác định methylxanthines trong mẫu kiểm tra bằng phương pháp IR kết hợp với PCR 3.2.3.2. Mô hình PLS Kết quả thu được cho thấy 6 cấu tử đầu tiên chứa hầu hết lượng thông tin của tập số liệu, lựa chọn PC= 61 đến 15 để khảo sát số PC tối ưu.. Độ chính xác của mô hình PCR với ma trận tín hiệu mẫu kiểm tra trước và sau khi tiến hành xử lý tiền số liệu khi thay đổi các số PC từ 6 đến 15 được trình bày trong hình 3.8. Từ kết quả số hình 3.6 có thể thấy khi tăng số PC từ 6 đến 8 hệ số tương quan R tăng rõ rệt, ngược lại hệ số biến thiên RMSE giảm. So sánh với phương pháp hồi quy đa biến PCR chúng tôi nhận thấy có sự cải thiện đáng kể của giá trị R và RMSE. Nhìn chung phương pháp tiền xử lí số liệu MC cho kết quả tốt hơn so với phương pháp tiền xử lí số liệu SNV và không tiền xử lí. Chọn PC và phương pháp tiền xử lý tối ưu: TB: PC=11, MC; TP: PC=15, MC; CF: PC=14, MC. 0.8 Theobromin Ban đầu 0.7 SNV 0.6 MC Gias trị RMSE 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Số PC Hình 8 Độ chính xác của mô hình hồi quy xác định methylxanthines trong mẫu kiểm tra bằng phương pháp IR kết hợp với PCR 3.2.3.2. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế Kết quả phân tích mẫu thực tế thu được ở bảng 3.9. 17
ảng 9. Kết quả phân tích CF, TB và TP trong các mẫu chè được tính từ mô hình PLS dựa trên dữ liệu phổ phản xạ Mẫu Hàm lƣợng TB (mg/g) Hàm lƣợng TP(mg/g) Hàm lƣợng CF(mg/g) chè HPLC IR Sai số HPLC IR Sai số HPLC IR Sai số (%) (%) (%) TN16 2,94 2,90 1,10 4,44 4,20 5,42 53,47 51,09 5,42 TN17 4,26 4,27 0,22 5,29 5,10 3,75 53,28 52,27 3,75 CTK13 4,08 4,00 2,09 3,86 3,66 5,23 43,87 41,88 5,23 CTK14 3,33 3,13 5,92 4,46 4,37 2,01 54,47 53,09 2,01 LD10 3,86 3,73 3,35 2,76 2,65 4,05 25,60 24,59 4,05 Từ các kết quả thu được chúng tôi nhận thấy hàm lượng các methylxanthines thu được theo phương pháp IR kết hợp với thuật toán PLS và phương pháp phân tích tiêu chuẩn HPLC sai khác không có ý nghĩa thống kê. Trên cơ sở ma trận tín hiệu của 85 mẫu chè đo bằng phương pháp NIR kết hợp với thuật toán PLS tính hàm lượng CF, TB, TP trong mẫu chè và vẽ biểu đồ Boxplot các mẫu chè theo khu vực địa lý khác nhau. Kết quả trình bày trong hình 3.9. Boxplot of TB Boxplot of TP Vùng địa lý 8 Vùng địa lý 6 Các tỉnh khác Các tỉnh khác Lâm Đồng Lâm Đồng Phú Thọ 7 Phú Thọ Thái Nguyên Thái Nguyên 5 6 4 5 TB TP 3 4 3 2 2 1 1 Các tỉnh khác Lâm Đồng Phú Thọ Thái Nguyên Các tỉnh khác Lâm Đồng Phú Thọ Thái Nguyên Vùng địa lý Vùng địa lý Boxplot of CF Boxplot of TB+TP+CF 90 Vùng địa lý 100 Vùng địa lý Các tỉnh khác Các tỉnh khác Lâm Đồng Lâm Đồng 80 90 Phú Thọ Phú Thọ Thái Nguyên Thái Nguyên 70 80 60 70 TB+TP+CF 50 60 CF 40 50 30 40 20 30 10 20 Các tỉnh khác Lâm Đồng Phú Thọ Thái Nguyên Các tỉnh khác Lâm Đồng Phú Thọ Thái Nguyên Vùng địa lý Vùng địa lý Hình 9. Khối lượng TB, TP, CF trong các mẫu chè theo khu vực địa lý khác nhau 3.3. Phân loại chè theo nguồn gốc địa lý dựa trên dữ liệu phổ và các phƣơng pháp thống kê đa biến 3.3.1. Phân loại và nhận dạng chè theo nguồn gốc địa lý bằng phổ hấp thụ phân tử 18
3.3.1.1. Phân loại và nhận dạng theo PCA-DA Độ chính xác của phương pháp được đánh giá qua tỉ lệ nhận dạng đúng bằng cách so sánh kết quả nhận dạng trong các mẫu kiểm tra với việc gắn nhãn ban đầu. Nếu các kết quả cho thấy chưa đạt yêu cầu thì thay đổi các số PC khác nhau từ 1 đến 20 để lựa chọn mô hình hồi quy và số PC phù hợp. Sau khi khảo sát chọn được số PC tối ưu là 12. Kết quả nhận dạng 25 mẫu chè được thể hiện trong bảng 3.10. Bảng 3.10. Kết quả nhận dạng 25 mẫu chè dựa trên dữ liệu phổ UV-Vis kết hợp với PCA-DA Kết quả nhận dạng Độ Số Loại chính lƣợng chè mẫu TN LĐ PT TK xác (%) TN 05 03 01 01 0 LĐ 06 0 06 0 0 84 PT 07 0 02 05 0 TK 07 0 0 0 07 Từ kết quả bảng 3.11 cho thấy trong 25 mẫu chè thuộc 4 vùng địa lý khác nhau, các mẫu chè Lâm đồng và các tỉnh khác tỉ lệ nhận dạng đúng là 100%, 05 mẫu chè Thái Nguyên tỉ lệ nhận dạng đúng là 3/5 và 07 mẫu chè Phú Thọ tỉ lệ nhận dạng đúng là 05/07. 3.3.1.2. Phân loại và nhận dạng theo PLS-DA Kết quả thu được sau khi sử dụng phương pháp PLS-DA cho thấy tỉ lệ không nhận dạng của mô hình còn khá cao. Do đó không thể dùng mô hình PLS-DA trên cơ sở dữ liệu phổ UV-Vis để phân loại và nhận dạng nguồn gốc địa lý của các mẫu chè trên thị trường. 3.3.2. Phân loại và nhận dạng chè theo nguồn gốc địa lý bằng phổ hồng ngoại 3.3.2.1. Phân loại và nhận dạng theo PCA-DA Bảng 3.11. Kết quả nhận dạng 25 mẫu chè dựa trên dữ liệu phổ IR kết hợp với PCA-DA Kết quả nhận dạng Độ Số Loại chính lƣợng chè mẫu TN LĐ PT TK xác (%) TN 05 05 0 0 0 LĐ 06 0 05 0 01 92 PT 07 0 0 07 0 TK 07 0 01 0 06 19
Độ chính xác của mô hình với 25 mẫu kiểm tra đạt 92%: trong 25 mẫu chè thuộc 4 vùng địa lý khác nhau, các mẫu chè Thái Nguyên và Phú Thọ tỉ lệ nhận dạng đúng là 100%, 06 mẫu chè Lâm Đồng tỉ lệ nhận dạng đúng là 5/6 và 07 mẫu chè tỉnh khác tỉ lệ nhận dạng đúng là 06/07. 3.3.2.2. Phân loại và nhận dạng theo PLS-DA Kết quả nhận dạng 25 mẫu chè được thể hiện trong bảng 3.12. Độ chính xác của mô hình với 25 mẫu kiểm tra đạt 96% cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng mô hình PLS-DA trên cơ sở dữ liệu phổ hồng ngoại phản xạ để phân loại nguồn gốc địa lý của các mẫu chè trên thị trường. Bảng 3.12. Kết quả nhận dạng 25 mẫu chè dựa trên dữ liệu phổ IR kết hợp với PLS-DA Kết quả nhận dạng Độ Số Loại chính lƣợng chè TN LĐ PT TK xác mẫu (%) TN 05 05 0 0 0 LĐ 06 0 05 0 01 96 PT 07 0 0 07 0 TK 07 0 0 0 07 KẾT LUẬN Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam ứng dụng thành công kỹ thuật đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis và phổ phản xạ IR để định lượng đồng thời một số chất nhóm methylxanthin trên nền mẫu tự nhiên và tiến hành phân loại nguồn gốc địa lý của chè Việt Nạm. Các kết quả chính luận án đạt được như sau: 1. Đã khảo sát và lựa chọn được các điều kiện phù hợp cho phép xác định đồng thời các hợp chất TB, TP, CF trong chè bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao. Ở điều kiện đã nghiên cứu píc của ba methylxanthines tách hoàn toàn ra khỏi nhau, pic nhọn và cân đối. Kết quả phân tích hàm lượng ba methylxanthin trong các mẫu chè cho thấy có sự khác nhau cơ bản về hàm lượng methylxanthin ở các vùng địa lý khác nhau và đây là cơ sở để phân loại nguồn gốc địa lý chè Việt Nam. Bộ số liệu hàm lượng ba methylxanthin được xác định bằng phương pháp HPLC có thể dùng để làm bộ số liệu chuẩn để xây dựng mô hình hồi quy đa biến nhằm định lượng đồng thời TB,TP và CF bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử và phổ hồng ngoại. 20