Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính sinh học hạ đường huyết và hạ cholesterol máu của một số nhóm hoạt chất chính từ cây Nopal (Opuntia spp) được nhập vào Việt Nam

Chia sẻ: Acacia2510 _Acacia2510 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

19
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là xác định nhóm hoạt chất hay hợp chất chính trong cây xương rồng Nopal trồng tại Việt Nam có tác dụng hạ đường huyết và hạ cholesterol. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính sinh học hạ đường huyết và hạ cholesterol máu của một số nhóm hoạt chất chính từ cây Nopal (Opuntia spp) được nhập vào Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Tạ Thu Hằng NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC HẠ ĐƯỜNG HUYẾT VÀ CHOLESTEROL MÁU CỦA MỘT SỐ NHÓM HOẠT CHẤT CHÍNH TỪ CÂY NOPAL (OPUNTIA SPP) ĐƯỢC NHẬP VÀO VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62420116 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội-2017 1
Công trình đƣợc hoàn thành tại trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 1. PGS.TS Lê Tất Khƣơng 2. PGS.TS Nguyễn Văn Mùi Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Quang Huy Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên-ĐHQG Hà Nội Phản biện 2: GS. TS Đặng Thị Thu Trƣờng Đại học Bách khoa-Hà Nội Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại Học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên-ĐHQG Hà Nội Vào hồi giờ ngày tháng năm 201 Có thể tìm hiểu luận án tại: -Thƣ viện Quốc gia Việt Nam -Trung tâm Thông tin-Thƣ viện, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên- ĐHQG Hà Nội 2
MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài Xƣơng rồng (XR) Nopal thuộc chi Opuntia ficus-indica (L.) Mill, là một loài xƣơng rồng mà từ lâu đƣợc trồng rộng rãi trên khắp vùng khô cằn và bán khô cằn của thế giới. Nó có nguồn gốc từ Mêxicô. XR Nopal ngoài việc sử dụng nhƣ rau ăn hàng ngày và chế biến các loại thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm, chất đốt sinh học, xử lý nƣớc thải…[Error! Reference source not found.] theo truyền thống ở Mêxicô cây XR Nopal đƣợc sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đƣờng. Các nghiên cứu cho thấy loài Opuntia ficus-indica có tác dụng hạ glucose huyết, giảm rối loạn lipid máu, làm tăng dịch chuyến protein vận chuyển (GLUT4) glucose ra màng tế bào, tăng khả năng hấp thu glucose, giảm kích thƣớc tế bào mô mỡ...[Error! Reference source not found.],[Error! Reference source not found.],[Error! Reference source not found.]. Tỷ lệ bệnh ĐTĐ đang gia tăng nhanh chóng trên toàn thế giới kéo theo những hậu quả nghiêm trọng về sức khỏe và kinh tế đối với toàn xã hội. Số ngƣời mắc bệnh ĐTĐ trên toàn thế giới tăng từ 171 triệu năm 2000 lên 194 triệu năm 2003, đã tăng vọt 246 triệu năm 2006 và đƣợc dự báo tăng lên 380- 399 triệu vào năm 2025. Việt Nam nằm trong 10 quốc gia có tỷ lệ gia tăng bệnh nhân ĐTĐ cao nhất thế giới. Ƣớc tính có khoảng 53.458 ca tử vong do bệnh tiểu đƣờng vào năm 2015. Cây XR Nopal đã đƣợc Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng nhập nội từ Mêxicô vào Việt Nam từ năm 2009, đã tiến hành trồng thử nghiệm thành công chống cát bay, cát nhảy ở vùng đất khô hạn của tỉnh Ninh Thuận. Để tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu cây XR Nopal dùng làm nguồn dƣợc liệu, các chất tách từ cây có thể dùng làm thuốc hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đƣờng là vấn đề có ý nghĩa vì vậy chúng tôi tiền hành đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học hạ đường huyết và hạ cholesterol máu của một số nhóm hoạt chất chính từ cây Nopal (Opuntia spp) được nhập vào Việt Nam” 2. Mục tiêu nghiên cứu: Xác định nhóm hoạt chất hay hợp chất chính trong cây xƣơng rồng Nopal trồng tại Việt Nam có tác dụng hạ đƣờng huyết và hạ cholesterol. 3. Nội dung nghiên cứu: 3
+ Xác định các thành phần dinh dƣỡng chính, thành phần hóa học của cây Nopal nhập nội. + Thử độc tố LD 50. Xác định tác dụng hạ glucose huyết và lựa chọn đƣợc phân đoạn dịch chiết có tác dụng chiếm ƣu thế của cây Nopal trồng tại Việt Nam trên thực nghiệm. + Đánh giá tác dụng và bƣớc đầu tìm hiểu cơ chế gây hạ glucose, choleterol huyết của cao phân đoạn dịch chiết có tác dụng chiếm ƣu thế của cây Nopal trồng tại Việt Nam. + Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số chất tinh khiết từ thân cây Nopal trồng tại Ninh Thuận. Đánh giá tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập trên một mô hình thử nghiệm in vitro. 4.Bố cục của Luận án Luận án có 144 trang gồm 3 trang mở đầu, 36 trang tổng quan tài liệu, 23 trang đối tƣợng, nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu; 55 trang kết quả nghiên cứu và thảo luận, 3 trang kết luận và đề nghị, 1 trang các công trình khoa học công bố, 12 trang tài liệu tham khảo, 12 trang mục lục, chữ viết tắt, danh mục bảng, hình, trang phụ lục luận án có … bảng số liệu và … hình vẽ. 5. Điểm mới của luận án: - Xác định đƣợc đặc điểm hình thái thực vật, giải phẫu thân, rễ, tên khoa học của giống XR Nopal trồng tại Ninh Thuận-Việt Nam. - Xác định đƣợc thành phần dinh dƣỡng, định tính các nhóm chất, phân lập, xác định cấu trúc và định tên đƣợc các hợp chất phân lập đƣợc trong cây XR Nopal giống Jalpa. - Xác định đƣơc 1 giống XR có tác dụng hạ đƣờng huyết hiệu quả nhất trong 03 giống thử nghiệm. - Xác định đƣợc phân đoạn Ethylacetat chứa nhiều flavonid, có tác dụng hạ đƣờng huyết, cholesterol và khả năng hoạt hóa enzym p-AMPK và p-ACC tốt nhất. - Xác định đƣợc 01 chất đặc trƣng trong cây XR Jalpa có tác dụng hoạt hóa p-AMPK và p-ACC, ức chế FAS (tổng hợp acid béo), làm tăng sự hấp thu glucose trong tế bào, có tác dụng làm giảm đƣờng huyết và chống béo phì. Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Cây xương rồng Nopal và một số nghiên cứu về chi Opuntia 4
Loài Opuntia ficus-indica (L.) Mill thuộc chi Opuntia, họ Cactaceae, với khoảng 1.500 loài xƣơng rồng, có nguồn gốc từ Mêxicô và lan rộng khắp Trung và Nam Mỹ, Úc, Nam Phi, bao gồm cả các khu vực Địa Trung Hải [Error! Reference source not found.]. Chi Opuntia có chứa một lƣợng đáng kể các axit ascorbic, vitamin E, carotenoid, chất xơ, axit amin và các hợp chất chống oxy hóa (phenol, flavonoids, betaxanthin và betacyanin), có lợi ích cho sức khỏe nhƣ: hạ đƣờng huyết và hạ mỡ máu, và chống oxy hóa [Error! Reference source not found. ]. 1.2.Tác dụng hạ glucose, cholesterol huyết của chi Opuntia Cây XR Opuntia ficus-indica chứa hàm lƣợng chất xơ, chất nhầy cao. Uống bột XR Nopal trƣởng thành và XR Nopal non liều 50 mg / kg thể trọng có tác dụng giảm glucose máu sau ăn trên chuột bị tiểu đƣờng tƣơng ứng là 46,0 và 23,6% (p
Chuột ăn với chế độ giàu chất béo bổ sung chất chiết xuất Opuntia ficus-indica (OFI) giàu isorhamnetin glycosides, đƣợc bổ sung với liều thấp (0.3%) và liều cao (0.6%) vào thức ăn thì có trọng lƣợng cơ thể, cholesterol toàn phần, LDL và HDL, nồng độ glucose và insulin thấp hơn so với chuột chỉ dùng chế độ giàu chất béo. Chiết xuất OFI đã kích thích sự bài tiết insulin trong ống nghiệm, kết hợp với sự gia tăng vận chuyển glucose (GLUT2), tăng khả năng hấp thụ glucose, tạo thêm năng lƣợng. [89] Giống XR Milpa Alta thuộc OFI với hàm lƣợng chất xơ, nồng độ polyphenol cao và khả năng chống oxy hoá đã làm tăng quá trình oxy hóa axit béo và tổng hợp VLDL, giảm stress oxy hoá, và cải thiện tín hiệu insulin gan ở chuột Zucker béo phì. Những con chuột bị béo phì Zucker đƣợc cho ăn chế độ ăn kiêng có bổ sung 4% bột XR Nopal trong 7 tuần thì chỉ số triglicerid trong máu thấp hơn 50% so với nhóm đối chứng, ngoài ra khối u gan, dấu hiệu sinh học của tổn thƣơng tế bào gan giảm[Error! Reference source not found.]. Lợn nái ăn thức ăn thƣơng phẩm bổ sung thêm 2,0 ± 0,5 kg cây xƣơng rồng Opuntia ficus-indica có chỉ số glucose trong máu hạ tốt hơn, thời gian cai sữa dài hơn nhóm ăn thức ăn thƣơng phẩm không bổ sung cây xƣơng rồng OFI. Hiệu quả hạ đƣờng huyết của cây xƣơng rồng là do hàm lƣợng chất xơ cao, đặc biệt là pectin, gel pectin làm giảm sự hấp thụ carbohydrate. Ngoài ra, chất xơ cao làm tăng hoạt tính enzyme vi khuẩn, ảnh hƣởng hoạt tính của α-glucosidase và β-galactosidase, dẫn đến sự ức chế sự thủy phân liên kết glycosidic[Error! Reference source not found.]. Dầu hạt của quả của cây Opuntia ficus-indica L. MILL. có thành phần lipophilic chứa 83% axit béo chƣa bão hòa (56% acid linoleic và 20% axit oleic) có tác dụng bảo vệ có thể ngăn ngừa chứng đái tháo đƣờng ở chuột đƣợc gây ra bởi Alloxan và ức chế các tổn thƣơng mô ở các tế bào tụy.[28] 1.3. Tác dụng sinh học khác của chi Opuntia:  Hoạt tính kháng viêm Isorhamnetin-glucosyl-rhamnoside (IGR) chiết từ Opuntia ficus indica có khả năng ức chế sản xuất các chất trung gian gây viêm da nhƣ COX-2, yếu tố hoại tử khối u alpha TNF- và interleukin- (IL-) 1 và IL-6. IGR nhƣ là một hợp chất tự nhiên thích hợp cho phát triển thành phần chống viêm mới [Error! Reference source not found.]. 6
Lorenzo và cộng sự (2017) đã nghiên cứu cho thấy toàn bộ chất nhầy và các thành phần khối lƣợng phân tử thấp nhƣ acid lactic, D-mannitol, piscidic, eucomic và 2-hydroxy-4- (4’ -hydroxyphenyl) -butanoic axit trong Opuntia ficus-indica có tác dụng trong việc chữa vết thƣơng qua mô hình tế bào in vitro đƣợc đơn giản hóa dựa trên một lớp vỏ keratin [Error! Reference source not found.].  Hoạt tính chống ung thư Glycosid isorhamnetin tinh khiết chiết xuất từ O. ficus-indica (giống Jalpa) có tác dụng gây độc tế bào ung thƣ ruột kết ở ngƣời: HT-29 và Caco2. Những ảnh hƣởng này liên quan đến quá trình gây chết tế bào (apoptosis) thông qua cascade, một enzyme dạng protease, đóng vai trò trung tâm trong việc truyền tín hiệu gây chết tế bào [Error! Reference source not found.]. Betanin, chiết xuất từ quả O.ficus-indica, có thể ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thƣ bạch cầu K562 mãn tính ở ngƣời thông qua con đƣờng tự do apoptotic [Error! Reference source not found.]. Flavonoids, trans Taxifolin, và dihydrokaempferol đã đƣợc phân lập từ Opuntia humifusa có thể là những chất có tiềm năng để điều trị ung thƣ cổ tử cung ở ngƣời [Error! Reference source not found.].  Chống oxy hóa Glycoprotein đƣợc phân lập từ O. ficus-indica giống Saboten Makino (một loài Opuntia đƣợc sử dụng trong y học dân gian ở Triều Tiên) có tác dụng chống oxy hoá mạnh và các tính chất hypolipidemic có tác dụng bảo vệ đối với những con chuột đƣợc điều trị bằng triton WR-1339, một chất ức chế lipoprotein lipase [Error! Reference source not found.].  Bảo vệ tế bào thần kinh Các polysaccharides của Opuntia Milpa Alta (MAP) có tác dụng bảo vệ thần kinh đƣợc đánh giá ở mức độ cơ học trong mô hình invitro của tổn thƣơng thiếu máu ở não chuột. [Error! Reference source not found.].  Giảm triệu chứng của bệnh táo bón Chuột đƣợc tiêm dƣới da Loperamide (2 mg / kg) để gây táo bón. Cho chuột uống nƣớc chiết từ Opuntia humifusa với nồng độ 3% và 6% trong thời gian 25 ngày, kết quả cho thấy độ dày của ruột già cũng tăng lên ở các nhóm phụ thuộc theo liều. Những kết quả này cho thấy rằng chiết xuất của Opuntia humifusa làm giảm các triệu chứng của táo bón do loperamide gây ra [Error! Reference source not found.]. 7
 Làm chậm sự phát triển tổn thương xơ vữa động mạch và các bệnh tim mạch Các nghiên cứu in vivo trên chuột apoE-KO, tự phát triển các tổn thƣơng xơ vữa động mạch trong điều kiện ăn kiêng cơ bản, chỉ ra rằng việc bổ sung chế độ ăn uống có chứa bột thân cây O. streptacantha hoặc O.ficus- indica (10 mg/kg trong 15 tuần) làm giảm đáng kể sự phát triển của tổn thƣơng xơ vữa động mạch [Error! Reference source not found.].  Ngăn ngừa sự phát triển bất thường của chuyển hóa liên quan đến béo phì Flavonoid kaempferol hoặc isorhamnetin chiết xuất từ Opuntia có thể ngăn sự tích tụ lipid hoặc ức chế sự hình thành adipogenesis thông qua việc giảm sự điều hòa gen có adipogenic [Error! Reference source not found.]. 1.4. Những nghiên cứu hoạt tính sinh học hạ glucose huyết, hạ cholesterol từ các loài thực vật khác. Scoparia dulcis L. thƣờng đƣợc gọi là cây đậu ngọt giàu hàm lƣợng saponin, khi sử dụng ở liều 20 và 30 mg / kg có tác dụng hạ đƣờng huyết trên mô thí nghiệm bệnh ĐTĐ ở chuột [Error! Reference source not found.]. Mangifera indica kernel flour (MIKF) hay bột nhân hạt xoài tại Nigeria là một nguồn giàu các chất flavonoid và axit phenolic, quan trọng về mặt dƣợc lý. Các chất chiết xuất methanolic của nó ức chế một số enzyme chủ chốt liên quan đến bệnh lý học và biến chứng của bệnh đái tháo đƣờng týp 2 in vitro. [Error! Reference source not found.]. Theo Jang Sun-Hee và cộng sự nghiên cứu cho thấy nhân sâm có tác dụng chống bệnh đái tháo đƣờng trong mô hình bệnh tiểu đƣờng chuột gây ra bởi streptozotocin, thông qua việc chuyển saponin thành các chất chuyển hóa của vi khuẩn đƣờng ruột làm giảm 62,5% mức đƣờng huyết. Ngoài ra, các chỉ số khác nhau glycosylated máu, nồng độ insulin trong huyết thanh cũng đƣợc cải thiện đáng kể [Error! Reference source not found.]. Quế (Cinnamomum zeylanicum) Chiết xuất quế có thể là một loại thuốc thay thế hữu ích trong chế độ hàng ngày của bệnh nhân đái tháo đƣờng, cải thiện hiệu suất của bộ nhớ và giảm rối loạn chuyển hóa lipid [Error! Reference source not found.]. Cây hồ lô bá (Trigonella foenum graecum) có tác dụng hạ đƣờng huyết tốt. Sử dụng 10 % bột hạt hồ lô bá và 3% hành tây hàng ngày có sự 8
giảm đáng kể mức glucose trong máu lúc đói. Củ cải đƣờng, hành tây, bột hạt hồ lô bá tỷ lệ 43%, 35% và 54% có tác dụng giảm cholesterol máu, đặc biệt là từ các triglyceride LDLc giảm một cách đáng kể [Error! Reference source not found.]. Các thành phần đƣợc xác định là biểu hiện tác dụng chống bệnh tiểu đƣờng của cây chóc máu S.reticulata Wight bao gồm salacinol, kotalanol, ponocinol, salaprinol… Mangiferin, 16-acetate kotalagenin và oligomers proanthocyanidin khác nhau cũng đã đƣợc phân lập [Error! Reference source not found.]. Dịch chiết của cây chóc máu (S.reticulata Wight) đã làm tăng sự biểu hiện hoạt hóa AMPKα (Activated protein kinase α) và AMPKα phosphoryl hóa trong các tế bào mỡ. Những phát hiện này chứng minh rằng chiết xuất của S.reticulata Wight có tác dụng trị liệu về béo phì và rối loạn chuyển hoá lipid [Error! Reference source not found.]. Dịch chiết từ lá dây thìa canh (Gymnema sylvestre) với liều 100, 250 và 500 mg / kg thể trọng đƣợc thử nghiệm trên mô hình chuột nuôi chế độ ăn nhiều chất béo đƣợc chứng minh hiệu quả hạ đƣờng huyết do hoạt tính ức chế amylase và giảm đáng kể sự gia tăng trọng lƣợng cơ thể, nồng độ lipid huyết thanh, insulin và leptin huyết thanh, mô mỡ, viêm gan [Error! Reference source not found.]. Selenium (Se) và Polysaccharide đƣợc phân lập từ lá sen, có tác dụng chống oxy hoá và đề kháng insulin. Chuột cống mang thai trƣớc khi sinh uống liều 50 và 100 mg / kg có tác dụng giảm cân, giảm mức glucose, lƣợng insulin, giảm cholesterol trong máu [Error! Reference source not found.]. Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của một số cây thuốc tại Việt Nam đang đƣợc rất nhiều các nhà khoa học trong nƣớc quan tâm. Sử dụng hỗn hợp lá vối, lá ổi, lá sen (VOS) với liều lƣợng là 200 mg VOS/kg thể trọng và 400 mg VOS/kg thể trọng trên chuột ĐTĐ trong 8 tuần liên tục [Error! Reference source not found.]. Tác giả Phùng Thanh Hƣơng đã chứng minh cây bằng lăng nƣớc có hoạt chất chính là polyphenol và acid corosolic có tác dụng ức chế men anpha-glucosidase kiểm soát glucose máu sau ăn vì vậy dịch chiết lá bằng lăng nƣớc có tác dụng hạ glucose máu trên chuột chuột ĐTĐ [Error! Reference source not found.]. 9
Ngoài ra còn có: nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của rễ cây chóc máu Nam Bộ Salacia cochinchinensis L Celastraceae [Error! Reference source not found.], dây thìa canh (Gymnema sylvestre (ReTz.) R.Br.ex Schult )[Error! Reference source not found.], dịch ép thân cây chuối tiêu Musa balbisiana Colla [Error! Reference source not found.], dịch chiết vỏ quả hồng bì Clausena lansium (Lour.) CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu -Thân cây xƣơng rồng Nopal trƣởng thành, nhánh 20-25cm (03 giống: Jalpa, TV, PTV-01) đƣợc thu hái tại Ninh Thuận ( Vƣờn giống gốc của Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng). -Chuột nhắt trắng đực dòng Swiss, trọng lƣợng từ 18-22 g đƣợc cung cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ƣơng. -Tế bào 3T3-L1 (tế bào mô mỡ chuột) đƣợc cung cấp bởi ATCC (Rockwill, MD, Mỹ). 2.1.3.Hóa chất và thiết bị thí nghiệm 2.1.3.1. Hóa chất Streptozocin (STZ) bột pha tiêm của hãng Sigma, Glyclazid (Standa) (Pháp), Acarbose (Glucobay) (Đức), Metformin hydroclorid (Glucophage), (Đức). Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập nhƣ: ethanol (EtOH), methanol (MeOH), n-hexan (Hx), ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (DCM). Silica gel pha thƣờng (0,040 - 0,063 mm, Merck). Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm). Đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử để phát hiện vết chất. Dung môi, hóa chất dùng để định tính (EtOH 80%, nƣớc cất, Pb(CH3COO)2 30%, Pb(CH3COO)2 10%, thuốc thử ninhydrin 3%, thuốc thử Fehling A và Fehling B, thuốc thử Lugol…. Các dung môi dùng trong định lƣợng polyphenol toàn phần: (EtOH). Thuốc thử: Folin-Ciocalteau (Merck). Hóa chất Na2CO3 (Trung Quốc). Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao MeOH, Acetonitril (ACN) của hãng Merck. Acid phosphoric đặc d=1,685g/cm3 của hãng Merck. 10
Môi trƣờng DMEM và trypsin đƣợc cung cấp bởi Gibco, FBS, penicillin/streptomycin. Kháng thể p-AMPK, p-ACC, FAS, kháng thể thứ cấp chuột, kháng thể thứ cấp thỏ và β-actin (Cell signaling); D-14C(U)- glucose; MTT [3- (4,5- dimethylthiazol-2-YL) 2,5- diphenyl-tetrazolium bromid] (Sigma); dexamethasone (Sigma), 3-isobutyl-1-methylxanthin, insulin (Sigma); Các nguyên vật liệu và hoá chất khác đƣợc cung cấp bởi công ty Sigma. 2.1.3.2. Thiết bị thí nghiệm Thiết bị phục vụ chiết xuất và nghiên cứu các thành phần hóa học: Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C;Tủ sấy Memmert IN260 (MEMMERT - Đức); Máy cất quay Rotavapor R-200 (Buchi), BUCHI(Thuỵ Sỹ), Máy siêu âm Power sonic 405 (POWERSONIC - Hàn Quốc), Máy UV-vis 1800 dải đo 190nm-800nm (SHIMADZU -Nhật Bản); Máy đo độ nóng chảy Kofler micro-hotstage (Đức); Máy đo phổ khối lƣợng phun mù điện tử (ESI-MS) AGILENT 1200 series LC-MSD Ion Trap (AGILENT -Anh); Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR spectrometer với chất chuẩn nội là TMS (BRUKER(Đức), Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích Shimadzu LC10tvp, detector diod array SPD-M10Avp (SHIMADZU Nhật Bản); Thiết bị nghiên cứu hoạt tính sinh học Máy li tâm để bàn SIGMA 3K 30 (SIGMA-Đức); Máy đo pH (HORIBA F-51BW HORIBA -Nhật); Máy đo quang TriStar LB 941 Multimode Microplate Reader TRISTA (Đức); Hệ thống phát hiện và phân tích hình ảnh LICOR Odyssey® CLx LICOR (Mỹ), Máy đếm Tri-Carb 2000 (TRI- CARB -Mỹ)… 2.2. Phương pháp nghiên cứu Các nghiên cứu thực nghiệm đƣợc nghiên cứu tại khoa sinh-ĐHKHTN, khoa hóa thực vật, dƣợc lý – Viện Dƣợc liệu 2.2.1. Nghiên cứu về thực vật học: 2.2.1.1. Xác định tên khoa học Theo phƣơng pháp mô tả, so sánh hình thái, đƣợc đối chiếu bởi các khóa phân loại đến loài và thứ của chi Opuntia Mill.,thuộc họ xƣơng rồng Cactaceae trong các bộ Thực vật chí của Trung Quốc[Error! Reference source not found.]. 11
Việc thẩm định lại kết quả, xác định lại tên khoa học mẫu thu thập đƣợc tại phòng thực vật-Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật. 2.2.1.2. Nghiên cứu giải phẫu Theo phƣơng pháp nghiên cứu giải phẫu thực vật, bao gồm các bộ phận thân, rễ. Các tiêu bản giải phẫu đƣợc làm theo phƣơng pháp nhuộm kép (đỏ carmin xanh methylen)[Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.]. Quan sát dƣới kính hiểm vi soi nổi và chụp ảnh bằng máy kỹ thuật số 2.2.2. Nghiên cứu về hóa học 2.2.2.1. Đánh giá sơ bộ thành phần dinh dưỡng của cây XR Nopal trồng tại Việt Nam Vật chất khô (Phƣơng pháp trọng lƣợng), Lipid (Phƣơng pháp Soxlect), Protein (Sử dụng máy Gerhard theo phƣơng pháp Kjeldahl); Xác định vitamin A, vitamin C bằng phƣơng pháp HPLC; Xác định vitamin B1, B2, B6 bằng phƣơng pháp cực phổ xung vi phân. Phân tích K, Na dựa trên tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6196-3:2000; Xác định Zn, Fe, dựa trên tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8126:2009; Xác định P theo phƣơng pháp TCVN 1525:2000 2.2.2.2. Phương pháp chiết phân đoạn Mẫu thu về đƣợc loại bỏ phần hƣ hỏng, rửa sạch, phơi trong bóng râm cho khô, sấy ở 60oC cho đến khi mẫu có khối lƣợng không đổi, nghiền mẫu thành bột và đƣợc chiết xuất bằng ethanol (EtOH) với phƣơng pháp ngấm kiệt. Sau đó dịch chiết toàn phần EtOH đƣợc phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat [Error! Reference source not found.]. 2.2.2.3. Phương pháp định tính Định tính bằng các phản ứng hóa học sử dụng thuốc thử đặc trƣng của mỗi nhóm chất [Error! Reference source not found.],[Error! Reference source not found.]. 2.2.2.4. Phương pháp định lượng polyphenol toàn phần Phƣơng pháp định lƣợng polyphenol toàn phần [Error! Reference source not found.]: sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteau, đo quang ở bƣớc sóng 760nm, so sánh với acid gallic, sử dụng kỹ thuật đƣờng chuẩn. 2.2.2.5. Phương pháp phân lập các hợp chất: 12
a. Sắc ký lớp mỏng : Dùng để kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập đƣợc. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch. Pha tĩnh là một lớp mỏng các chất đƣợc hấp thụ trên silicagel.[Error! Reference source not found.] Sau khi chạy sắc ký xong để phát hiện chất trên bản mỏng có thể dùng thuốc thử H2SO4 10% đƣợc phun đều trên bản mỏng, sấy khô rồi hơ trên bếp điện đến khi hiện màu hoặc bằng đèn tử ngoại bƣớc song 365nm và 254nm b. Sắc ký dựa trên sự phân bố các chất giữa 2 pha: pha cố định và pha di động. Pha di động hay pha lỏng là dung môi dùng để chiết cho chảy qua cột, pha cố định hay pha tĩnh đƣợc nhồi vào một cột thủy tinh. Mẫu đƣợc đƣa vào cột, các mẫu sẽ đi qua cột với các tốc độ khác nhau, các phân tử có kích thƣớc nhỏ sẽ ngấm sâu vào mạng lƣới của chất nhồi, còn các phân tử có kích thƣớc lớn hơn sẽ chỉ thâm nhập ở mức độ nhất định, các phân tử có khối lƣợng rất lớn sẽ không đi đƣợc vào các mao quản. Kết quả là thứ tự các chất ra khỏi cột theo khối lƣợng thứ tự giảm dần [Error! Reference source not found.]. 2.2.2.6. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học a. Điểm nóng chảy (Mp) Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Dƣợc Liệu. b. Phƣơng pháp phổ khối lƣợng: Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ thƣờng đƣợc xác định bằng kỹ thuật phổ khối lƣợng. Nguyên tắc chủ yếu của kỹ thuật này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dƣới dạng bắn phá của chùm ion bên ngoài. Ngoài ra để xác định đƣợc cấu trúc hóa học của các hợp chất còn dựa vào cơ chế phân mảnh của các ion bằng phổ MS c. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR- Nuclear Magnetic Resonance):Phổ 1H-NMR; Phổ 13C-NMR; Phổ DEPT. Ngoài ra, ngƣời ta còn sử dụng nhiều kỹ thuật phổ 2 chiều rất hiện đại khác nhƣ: HMQC, HOMOCOSY, HMBC[Error! Reference source not found., Error! Reference source not found.]. 2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học 2.2.3.1. Xác định độc tính cấp 13
Tiến hành đánh giá độc tính cấp tính của DCTP của 03 giống XR Nopal thử nghiệm (Jalpa, Tai voi, PTV-01) trên chuột nhắt trắng theo đƣờng uống, liều dùng là 3g, 6g, 9g, 12g,15g,18g,21g/ kg/ ngày cho mỗi giống XR Nopal [Error! Reference source not found.], mỗi lô 10 con. Các chỉ tiêu theo dõi : Hoạt động tự nhiên, tƣ thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, phân, nƣớc tiểu.Theo dõi số lƣợng chuột chết ở mỗi lô trong vòng 72 giờ, xác định đƣợc LD50. 2.2.3.2. Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết a) Phương pháp gây tăng glucose huyết bằng STZ Chuột nhắt trắng sau khi mua về đƣợc để ổn định 3, tiêm màng bụng STZ (pha citrate pH=4,5) với liều 150 mg/kg. [Error! Reference source not found.]. b) Phương pháp gây chuột ĐTĐ type 2 Nhóm 1: nhóm ăn thƣờng (ND-normal diet) Chuột đƣợc nuôi bằng chế độ ăn bình thƣờng (thức ăn chuẩn do viện vệ sinh Dịch tễ cung cấp). Nhóm 2: nhóm nuôi béo (HFD-high fat diet) ăn thức ăn giàu chất béo trong vòng 8 tuần. Gây chuột nhắt ĐTĐ type 2 bằng cách tiêm màng bụng STZ 120 mg/kg (pha trong đệm citrate 0,01M, pH 4,3) Sau khi tiến hành tiêm STZ với liều 120 mg/kg, các con chuột tiếp tục đƣợc nuôi bằng chế độ dinh dƣỡng nhƣ ban đầu. Đo nồng độ đƣờng huyết lúc đói tại 0 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 5 ngày, 7 ngày, 10 ngày. Sau 14 ngày lấy máu định lƣợng đƣờng huyết. c) Phương pháp định lượng glucose huyết Định lƣợng đƣờng huyết bằng kỹ thuật enzyme, glucose bị oxi hóa nhờ xúc tác của các enzyme trên bề mặt của vùng phản ứng giấy thử và đọc kết quả trên máy One Touch Profile Meter của hãng Johnson&Johnson. d) Phương pháp định lượng cholesterol toàn phần, triglyceride HDLc, LDLc Định lƣợng cholesterol toàn phần theo phƣơng pháp của Deeg và Zlegenhorn và định lƣợng triglycerid huyết thanh theo phƣơng pháp của McGowan, định lƣợng HDL, LDL trên máy xét nghiệm sinh hóa máu bán tự động TC plus 80. e) Phương pháp thử tác dụng hạ glucose huyết  Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của 03 giống Nopal trên chuột gây tăng glucose huyết bằng STZ: 14
Chia chuột thí nghiệm thành 8 lô và cho uống các mẫu thử: 6 lô Cho chuột uống cao dịch chiết toàn phần của 03 giống XR Nopal (Jalpa, TV, PTV-01) với liều 500mg/kg/ ngày và 1000mg/kg/ ngày [Error! Reference source not found.]. Lô chứng bệnh lý : Chuột đã gây tăng glucose huyết, uống nƣớc. Lô uống mẫu đối chứng dƣơng: Chuột đã gây tăng glucose huyết, uống Glyclazid với liều 100 mg/kg cân nặng. Chỉ tiêu theo dõi: glucose huyết của các lô thí nghiệm. Cho chuột tất cả các lô uống mẫu thử 7 ngày liên tục. Sau ngày uống thứ 7, lấy máu đuôi chuột định lƣợng lƣợng glucose huyết thanh (G7).  Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết, cholesterol trên chuột gây ĐTĐ type 2 của các cao phân đoạn dịch chiết của giống XR Jalpa Lô thí nghiệm: Chuột đƣợc bố trí theo 6 lô thí nghiệm: Lô 1: Lô đối chứng - Chuột đã gây tăng đƣờng huyết, uống nƣớc muối sinh lý với liều 10ml/kg. Lô 2,3,4,5 Chuột đã gây ĐTĐ type 2, uống cao chiết phân đoạn OFT, OFH, OFE, OFN mức liều khi qui đổi ra dƣợc liệu là tƣơng đƣơng liều DCTP 1000mg/ kg. Lô 6: Chuột đã gây ĐTĐ type 2, uống thuốc hạ đƣờng huyết Metfomin Thí nghiệm đƣợc kéo dài 20 ngày. Đƣờng huyết chuột lúc đói đƣợc đo tại các thời điểm 0 giờ, 7 ngày, 10 ngày, 20 ngày bằng máy glucose huyết tự động. Định lƣợng cholesterol toàn phần trên máy xét nghiệm sinh hóa máu bán tự động TC plus 80. Dựa trên kết quả thí nghiệm, chọn cao chiết phân đoạn có tác dụng chiếm ƣu thế nhất để tiếp tục nghiên cứu. 2.2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng kích hoạt p-AMPK, p-ACC, ức chế FAS kích thích sự hấp thu glucose. a) Nuôi cấy và biệt hóa tế bào: Tế bào 3T3-L1 đƣợc cung cấp bởi ATCC (Rockwill, MD, Mỹ) nuôi cấy ở 37°C, 5% CO2 trong môi trƣờng DMEM. Sau khi tế bào hợp lƣu với hỗn hợp các chất gây biệt hóa (1 μM dexamethasone, 500 μM 3-isobutyl-1- methylxanthin, và 1 μg ml−1 insulin, MDI) đƣợc hòa tan vào môi trƣờng nuôi cấy tế bào DMEM ở trên trong 2 ngày (Day 2). Các tế bào từ sau 8 ngày đƣợc biệt hóa và sử dụng cho các thí nghiệm. b) Xác định độ độc tế bào Tế bào nuôi cấy trong đĩa ổn định, các mẫu thuốc thử sẽ đƣợc đƣa vào ủ trong 24 h. Tế bào sống sẽ đƣợc ủ và nhuộm màu với môi trƣờng nuôi cấy 15
tế bào có chứa MTT [3- (4,5- dimethylthiazol-2-YL) 2,5- diphenyl- tetrazolium bromid] (2 mg/ml, trong 2h). Loại bỏ môi trƣờng. Xác định tỷ lệ tế bào còn sống giữa mẫu chuẩn và mẫu thử bằng máy đo quang ở bƣớc sóng 570 nm (Máy LB941, Berthold Technologies).[Error! Reference source not found.]. Tính kết quả: Tỷ lệ % tế bào sống sót đƣợc tính theo công thức: I (%) = (ODthử/ODchứng)x100% (Trong đó: I (%) là Tỷ lệ % tế bào sống sót; OD là mật độ quang ở bƣớc sóng λ= 570 nm (ODthử: mật độ quang mẫu thử; ODchứng: mật độ quang của mẫu chứng). c) Phương pháp điện di protein Các tế bào 3T3-L1 đƣợc xử lý với dịch chiết trong 2 h, sau đó thu lại rồi rửa sạch. Các tế bào đƣợc ly giải trên băng. Dịch chiết tế bào sau đó đƣợc đun sôi và ly tâm. Nồng độ dịch chiết tế bào đƣợc xác định bằng phƣơng pháp BCA và điện di trên gel SDS – polyacrylamide 10%. Sau khi điện di, protein trong gel đƣợc chuyển sang màng nitrocellulose, sau đó đƣợc ủ với kháng thể nguyên cấp (p-AMPK, p-ACC, FAS và β-actin). Màng sau đó đƣợc ủ thêm với kháng thể thứ cấp peroxidase liên hợp (chuột hoặc thỏ). Mật độ các vết đƣợc phát hiện bằng dung dịch west femto (Thermo Scientific) và hình ảnh đƣợc phát hiện và phân tích bằng máy LICOR Odyssey® CLx (Lycor Biotechnology, Mỹ).[Error! Reference source not found.] d) Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK, ACC của các phân đoạn: Tế bào sau khi ủ với từng phân đoạn OFT, OFH, OFE, OFN với nồng độ 30μg/ml, Lô chứng: là mẫu trắng dimethylsulfoxid (DMSO), thời gian ủ là 2h, đƣợc thu protein, chạy điện di và phân tích Western blot. So sánh mức độ biểu hiện của p-AMPK, p-ACC để tìm ra cao phân đoạn dịch chiết có tác dụng hoạt hóa AMPK rõ nhất. e) Nghiên cứu đánh giá tác dụng của các chất tinh khiết trên p-AMPK, p- ACC Bƣớc 1: Xác định mức độ độc tính trên tế bào mô mỡ 3T3-L1 của 04 hợp chất tinh khiết astragalin (OF2), rutin (OF4), narciscin (OF5) và typhaneosid (OF6) đƣợc phân lập từ phân đoạn ethyl acetat. Lô thí nghiệm: Các giếng có chứa tế bào 3T3-L1 đã biệt hóa, bổ sung các chất ở nồng độ 3 μM, 10μM, 30μM, 100μM đƣợc ủ trong 24 h. Đánh giá mức độ độc tính trên tế bào mô mỡ 3T3-L1 bằng phƣơng pháp MTT tìm ra dải nồng độ an toàn để thí nghiệm tiếp. 16
Bƣớc 2: Sử dụng phƣơng pháp Western blot để đánh giá mức độ biểu hiện của p-AMPK, p-ACC : Tế bào sau khi đƣợc biệt hóa đƣợc ủ với từng hợp chất với nồng độ 10μM, thời gian ủ là 2h. So sánh mức độ biểu hiện của p-AMPK, p-ACC để tìm ra chất có tác dụng hoạt hóa AMPK rõ nhất. f) Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK kích thích sự hấp thu glucose của hợp chất typhaneosid theo nồng độ Tế bào 3T3-L1 sau khi đƣợc ủ với typhanosid ở các nồng độ 3 μM, 10 μM, 30 μM đƣợc thu và trộn đều trong dung dịch Krebs-Ringer HEPES chứa 1% BSA trong 30 phút ở máy lắc trong bồn nƣớc 37 °C, sau đó thêm D- 14C(U)-glucose và ủ 30 phút. Xác định khả năng hấp thu glucose đƣợc bằng cách: lấy 300 μl của mỗi dung dịch ở trên rồi trộn với 65 μl dầu dinonylphtalate sau đó đem ly tâm. Các phân đoạn tế bào có gắn 14C đƣợc thu và hòa tan trong dung dịch chất lỏng phát quang và đƣợc đếm bằng máy đếm Tri-Carb 2000.[Error! Reference source not found.] 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu thống kê Số liệu đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp thống kê với sự trợ giúp của phần mềm Excel 2007. Biểu diễn số liệu dƣới dạng Xtb ± SD, so sánh bằng T-test student. Để so sánh sự khác biệt giữa các thời điểm khác nhau trong cùng 1 nhóm và giữa các nhóm tại cùng thời điểm, dùng thuật toán ANOVA, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p 0,05, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi p 0,05. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nghiên cứu về thực vật học 3.1.1. Xác định tên khoa học của cây Nopal Tên khoa học chính xác là Opuntia ficus-indica (L.) Mill.,thuộc họ xƣơng rồng Cactaceae. Kết quả này đã đƣợc giám định lại bởi Ths. Bùi Hồng Quang, TS. Vũ Tiến Chính Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật với tên khoa học số hiệu mẫu T.T.H-28/1/2016, hiện đƣợc lƣu trữ tại phòng tiêu bản (HN) Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật. 3.1.2.Đặc điểm hình thái thực vật Nopal là cây bụi, mọc thẳng, một số loài có thể dạng leo. Thân cây hình trụ, nhánh nopal có các lớp biểu bì dày thích nghi với việc lƣu trữ nƣớc, có màu xanh lá cây. 17
+ Thân cây và nhánh (cành) đƣợc cấu tạo bởi các đoạn thân + Rễ cây Nopal có dạng rễ cọc, các rễ phụ phát triển mạnh với số lƣợng rễ nhiều. + Lá là các gai non của Nopal, mọc trên bề mặt nhánh cây, trong hầu hết các loại xƣơng rồng rau các lá chỉ xuất hiện lúc non (0,5-3mm) sau rồi biến mất. + Hoa có nhiều dạng 5-8 cm, hoa xuất hiện giống nhƣ một cái vƣơng miện, màu sắc đa dạng. Quả Nopal có hình trụ 3.1.3.Đặc điểm giải phẫu 3.1.3.1. Cấu tạo giải phẫu thân + Vi phẫu thân: Bần gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật xếp thẳng hàng nhau. Mô dày gồm 3-4 lớp tế bào thành dày lên ở tất cả các góc, mô mềm cấu tạo bởi những tế bào thành mỏng hình đa giác, có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai. Libe gỗ tạo thành các bó riêng biệt gồm libe, gỗ cấu tạo bởi các mạch gỗ nhỏ xen kẽ với các tế bào mô mềm gỗ. 3.1.3.2. Cấu tạo giải phẫu thân rễ + Vi phẫu thân rễ: Lớp bần, sát lớp bần có các tế bào hình chữ nhật thành mỏng là tầng phát sinh bần lục bì. Mô mềm vỏ mỏng, phía trong mô mềm vỏ là libe cấp 2, có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai. Gỗ gồm các mạch gỗ xếp thành bó, trong gỗ có là mô mềm gỗ. + Bột thân: Bột màu xanh lục, không vị. Mảnh biểu bì có lỗ khí. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai rải rác trong mô mềm. Mảnh mô mềm. Mạch xoắn và mạch mạng. + Bột rễ: Bột màu trắng ngà, không vị, mùi thơm nhẹ. Mảnh bần gồm các tế bào hình chữ nhật xếp thẳng hàng nhau. Mảnh mô mềm gồm các tế bào thành mỏng xép lộn xộn. Hạt tinh bột hình chuông, đơn lẻ. Mảnh mạch điểm và mạch xoắn rõ. Rải rác trong mô mềm là các tinh thể calci oxalat hình cầu gai. 3.2. Nghiên cứu về hóa học: 3.2.1. Đánh giá sơ bộ thành phần dinh dưỡng của 03 giống cây xương rồng Nopal nghiên cứu trồng tại Việt Nam. Bảng 3.2. Hàm lượng một số chất dinh dưỡng trong 100 gram mẫu tươi của 03 giống Nopal 1 năm tuổi trồng tại Ninh Thuận Hàm lượng các Đơn vị Jalpa (JP) Tai voi PTV chất dinh dưỡng (TV) Protein gram 0,67 0,63 1,16 Lipid gram 0,17 0,17 0,21 18
Xellulose gram 1,77 1,77 1,99 Bảng 3.3. Hàm lượng một số chất khoáng chất và vitamin trong 100 gram mẫu tươi của 03 giống Nopal 1 năm tuổi trồng tại Ninh Thuận Đơn vị: mg/100g P K Ca Na Fe Zn Mg Mn VitA VitC Vt Vt VtB6 Tên (Mcg) B1 B2 giống JP 3,0 197 71 6,14 0,53 0,003 82 11 0,62 6,23 0,19 0,60 0,027 TV 10,0 224 155 6,24 0,28 0,003 76 21 1,01 8,84 0,15 0,70 0,027 PTV 9,0 220 204 4,47 0,003 0,001 83 3,0 0,36 8,61 0,20 0,65 0,021 Kết quả nghiên cứu bƣớc đầu cho thấy cây xƣơng rồng Nopal thích nghi với điều kiện khí hậu khô và nóng tại Ninh Thuận của Việt Nam 3.2.2. Kết quả chiết các cao phân đoạn 3.3.2.1. Dịch chiết toàn phần (DCTP) từ 03 giống XR Nopal nghiên cứu 03 Mẫu XR Jalpa, Tai voi, PTV-01, với khối lƣợng 2400g bột khô/ giống, ngâm từng giống với cồn và cất loại cồn nƣớc dƣới áp suất giảm thu đƣợc cao chiết tổng với phần trăm tách chiết DCTP của các giống XR Jalpa, TV, PTV tƣơng ứng nhƣ sau: 12,44%; 12,18%; 12,08% 3.2.2.2. Cao chiết phân đoạn từ giống XR Jalpa Cao chiết tổng (DCTP) của giống XR Jalpa đƣợc thêm hỗn hợp cồn- nƣớc (1:1) chiết lần lƣợt trong các dung môi có độ phân cực tăng dần: n- hexan, ethyl acetat. Phần trăm tách chiết: cao PĐ Hexan-OFH, cao PĐ ehthyl acetat- OFE, Cao phân đoạn (PĐ) nƣớc-OFN: 0,81%; 3,78%; 9,8%; 3.2.3 Xác định các nhóm chất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất trong cây XR Jalpa. 3.2.3.1. Định tính các nhóm chất trong các cao phân đoạn cây XR Jalpa Nhóm hoạt chất có trong cây XR Jalpa là rất phong phú: polysaccharid, đƣờng khử, alcaloid, acid amin, flavonoid, phytosetrol, carotenoid, chất béo. 3.2.3.2.Định lượng polyphenol toàn phần trong các cao phân đoạn Hàm lƣợng polyphenol toàn phần trong các cao chiết OFT, OFE, OFN lần lƣợt là 5,617 ± 0,046, 8,726± 0,103 và 4,585±0,049% tính theo acid gallic. Cao chiết ethyl acetat (OFE) có hàm lƣợng polyphenol toàn phần cao nhất đạt 8,726± 0,103%. 19
3.2.3.3. Kết quả phân lập các hợp chất, trong phân đoạn có hoạt tính hạ đường huyết tốt nhất- Ethyl acetat (OFE) Phân lập đƣợc 08 hợp chất OF1, OF2, OF3, OF3.1, OF4, OF5, OF6, OF7, trong đó các hợp chất OF1, OF4, OF3, OF6 có hàm lƣợng tƣơng đối cao so với các hợp chất còn lại, tƣơng ứng đạt là 55mg, 52mg, 25mg, 22mg. 3.2.3.4. Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất trong phân đoạn có hoạt tính hạ đường huyết tốt nhất- Ethyl acetat (OFE) Bằng các phƣơng pháp sắc kí kết hợp với các phƣơng pháp phổ hiện đại đã phân lập và nhận dạng đƣợc 8 hợp chất Bảng 3.9. Bảng tên các hợp chất phân lập từ phân đoạn Ethyl acetat STT Hợp Tên hợp chất Cấu trúc các hợp chất chất phân lập 1 OF1 β-sitosterol 3-O-β-D- glucopyranosid 2 OF2 Kaempferol 3-O-β-D- glucopyranosid hay astragalin 3 OF3 Acid ferulic 4 Acid gallic OF3.1 OH 5 OF4 Quercetin 3-O--rutinosid 8 2' OH HO O 2 hay rutin 6 6' O OH O OH OO CH2 1''' O OH 1'' OH OH OH OH OCH3 6 OF5 Isorhametin 3-O-rutinosid HO 8 O 2 2' OH hay Narcissosid 6 O 6' OH O OH OO CH2 1''' O OH 1'' OH OH OH OH 20