Giải trình tự chuỗi DNA phát hiện đột biến gen p53 trong ung thư niêm mạc miệng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN P53<br /> TRONG UNG THƯ NIÊM MẠC MIỆNG<br /> Trần Thị Kim Cúc*, Nguyễn Thị Hồng*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Đột biến p53 được nhận biết trong nhiều loại bướu, thể hiện tính bất ổn bằng cách cho phép tích<br /> lũy những thay đổi về di truyền do quá trình sinh ung tạo ra.<br /> Mục tiêu: Nghiên cứu này tìm hiểu tỉ lệ và kiểu đột biến của gen p53 trong ung thư niêm mạc miệng ở<br /> người Việt Nam.<br /> Đối tượng và phương pháp: Sử dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp để phân tích vùng bảo tồn của gen<br /> p53 từ exon 5 đến exon 8 trong ung thư tế bào gai nguyên phát ở hốc miệng của 109 bệnh nhân, và tìm hiểu mối<br /> liên quan giữa đột biến gen p53 với những thói quen nguy cơ ung thư như hút thuốc, uống rượu, nhai trầu.<br /> Kết quả: Tỉ lệ đột biến gen 53 là 47,7%. Về kiểu đột biến, 62,2% là đột biến sai nghĩa; 18,9% đột biến vô<br /> nghĩa; 9,4% đột biến mất đoạn gen; 5,7% đột biến ghép nối sai; 1,9% đột biến thêm đoạn gen và 1,9% đột biến<br /> trong khung. Đa số là đột biến chuyển vị G:C>A:T (40,0%) và đột biến chuyển dạng G:C>T:A (25,5%). Tỉ lệ đột<br /> biến gen p53 ở những người có thói quen hút thuốc lá cao hơn có ý nghĩa so với ở những người không có thói<br /> quen này (pA:T transitions and G:C>T:A<br /> transversions were the predominant mutations (65,5%). p53 gene mutation significantly related to tobacco<br /> smoking habit (p< 0.05).<br /> <br /> *: Khoa RHM – Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: Trần Thị Kim Cúc<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br /> ĐT: 0908348850,<br /> <br /> Email: kimcuc0804@yahoo.com<br /> <br /> 119<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> Conclusion: This study suggested an important contributing role of tobacco to p53 gene mutation and that<br /> tobacco might induce specific patterns and spectrums of mutations in oral cancer patients.<br /> Key words: p53 gene mutations, DNA sequencing, oral cancer.<br /> liên quan đến các tác nhân môi trường. Đa số<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> đột biến xảy ra từ exon từ 5 đến exon 8 của gen<br /> Ung thư là bệnh lý do những thay đổi về<br /> p53, nằm ở vị trí đặc hiệu của gen- chính là khu<br /> mặt tế bào qua một loạt đột biến ở các gen đặc<br /> vực kết nối với DNA(9). Nghiên cứu này khảo sát<br /> hiệu, làm tăng sinh tế bào không kiểm soát<br /> sự thay đổi của gen p53 trong UTNMM ở người<br /> được. Nguyên nhân của những thay đổi này do<br /> Việt Nam, với các mục tiêu sau:<br /> tiếp xúc với một hay nhiều các tác nhân hóa học<br /> - Xác định tỉ lệ đột biến gen p53 trong<br /> hay vật lý, gây ra các lỗi trong quá trình sao<br /> UTNMM.<br /> chép hay các lỗi trong quá trình sửa chữa DNA.<br /> Đột biến ở các gen kiểm soát chu kỳ tế bào và<br /> - Xác định tỉ lệ các kiểu đột biến gen p53<br /> đường dẫn truyền tín hiệu sửa chữa DNA là<br /> trong UTNMM.<br /> những sự kiện bắt đầu và cần thiết của quá trình<br /> - Phân tích mối liên quan giữa đột biến gen<br /> sinh ung thư(5).<br /> p53 với các thói quen nguy cơ UTNMM (hút<br /> Những nghiên cứu gần đây cho thấy bất<br /> thuốc, uống rượu, nhai trầu).<br /> hoạt các gen đè nén bướu là yếu tố quan<br /> ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> trọng trong quá trình sinh ung thư nhiều<br /> bước. Có nhiều gen đè nén bướu liên quan<br /> Mẫu nghiên cứu<br /> đến các bướu ác tính khác nhau, cũng như<br /> Mẫu nghiên cứu về lâm sàng, giải phẫu<br /> liên quan đến ung thư niêm mạc miệng<br /> bệnh và sinh học phân tử gồm 109 bệnh nhân<br /> (UTNMM). Sự thay đổi gen đè nén bướu p53<br /> được chẩn đoán xác định là UTNMM và được<br /> là yếu tố di truyền được nói đến nhiều nhất<br /> điều trị tại Bệnh viện Ung bướu Tp.HCM trong<br /> trong các loại ung thư ở người. Các nghiên<br /> năm 2009 và 2010.<br /> cứu cho thấy tỉ lệ đột biến gen này thay đổi<br /> Tiêu chuẩn chọn bệnh<br /> từ 30-70% trong ung thư đầu cổ(2,4).<br /> - Có tổn thương ung thư nguyên phát ở hốc<br /> Gen p53, nằm trên nhiễm sắc thể 17, có 11<br /> miệng.<br /> exon mã hóa cho protein ở nhân tế bào có trọng<br /> lượng phân tử 53 kDa, được biết đến với chức<br /> năng điều hòa sự tăng sinh tế bào. Khi tế bào bị<br /> tổn thương DNA, protein p53 làm dừng chu kỳ<br /> tế bào ở pha G1 nhằm khởi động quá trình sửa<br /> chữa DNA, hoặc quá trình chết tế bào theo lập<br /> trình. Do có vai trò quan trọng trong điều hòa<br /> chu kỳ tế bào, gen p53 ảnh hưởng nhiều đến quá<br /> trình điều trị ung thư như hóa trị hay xạ trị(1).<br /> Phân tích các kiểu đột biến gen p53 giúp<br /> nhận biết vị trí đột biến và làm rõ hơn chức năng<br /> của protein p53 đột biến, chức năng này thường<br /> bị bất hoạt trong tế bào ung thư. Ngoài ra, các<br /> kiểu đột biến có thể thay đổi tùy thuộc vào bản<br /> chất của các yếu tố bệnh căn, và cho thấy phổ<br /> đột biến của gen p53 có thể là dấu ấn sinh học<br /> <br /> 120<br /> <br /> - Có chẩn đoán giải phẫu bệnh là carcinôm<br /> tế bào gai.<br /> - Có trả lời phỏng vấn trực tiếp về các thói<br /> quen ăn trầu, hút thuốc, uống rượu.<br /> - Có hồ sơ bệnh án đầy đủ.<br /> - Chưa được điều trị ung thư đặc hiệu.<br /> <br /> Thiết kế nghiên cứu<br /> Cắt ngang, mô tả và phân tích.<br /> <br /> Qui trình nghiên cứu<br /> - Ghi nhận qua phỏng vấn trực tiếp các dữ<br /> liệu của bệnh nhân và thói quen hút thuốc, uống<br /> rượu, nhai trầu.<br /> - Khám và đánh giá lâm sàng.<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> - Đánh giá cận lâm sàng: giải phẫu bệnh,<br /> chụp phim tia X, siêu âm, nội soi tai mũi họng,<br /> xét nghiệm máu, nước tiểu, v.v…<br /> - Chẩn đoán và điều trị ung thư (theo hồ sơ<br /> bệnh án của bệnh viện).<br /> - Mẫu mô lấy từ bệnh phẩm sinh thiết hay<br /> phẫu thuật bướu nguyên phát được cố định,<br /> vùi nến và nhuộm Hematoxylin- Eosin thường<br /> qui tại Bệnh viện ung bướu để khảo sát giải<br /> phẫu bệnh.<br /> - Tiến hành các kỹ thuật sinh học phân tử<br /> gồm ly trích DNA từ mẫu mô sinh thiết ở tổn<br /> thương hốc miệng và giải trình tự chuỗi DNA<br /> tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử- Đại học<br /> Y Dược TP. HCM.<br /> Tên mồi<br /> P53g5F2<br /> P53, 5-6R<br /> P53seq7F<br /> P53seq7F<br /> <br /> Trình tự mồi (5’3’)<br /> GGTTGCAGGAGGTGCTTACA<br /> CACTGACAACCACCCTTAAC<br /> GGCCTCCCCTGCTTGCCACA<br /> GTGCTAGGAAAGAGGCAAGG<br /> <br /> Bước 2: Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)<br /> - Do đa số đột biến gen p53 xảy ra ở exon 5<br /> đến exon 8, nên nghiên cứu này chỉ khảo sát đột<br /> biến từ exon 5 đến exon 8 của gen p53.<br /> - Dùng 4 cặp mồi để khuếch đại các exon 5,<br /> 6, 7 và 8 của gen p53 (các đoạn mồi được thiết kế<br /> bằng phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự<br /> chuẩn của gen p53 có mã số NG.017013 trong<br /> GenBank). Trình tự các nucleotid của các đoạn<br /> mồi như sau:<br /> Kích thước sản phẩm PCR (bp)<br /> 542<br /> <br /> 7-8<br /> <br /> 755<br /> <br /> Chương trình PCR<br /> 45 chu kỳ nhiệt<br /> <br /> - Một đợt thí nghiệm PCR luôn có một<br /> chứng dương đã biết cho kết quả PCR (+) và<br /> một chứng âm thay thế mẫu DNA ly trích<br /> bằng nước cất.<br /> - Kết quả PCR được đánh giá bằng cách điện<br /> di trên gel agarose 1,2% có nhuộm ethidium<br /> bromide trong khoảng 20 phút và đọc kết quả.<br /> Nếu vạch của DNA khảo sát ở cùng mức với<br /> vạch của chứng dương và có số base đọc ở thang<br /> kích thước DNA phù hợp thì kết quả PCR (+),<br /> cho biết đã khuếch đại được exon mong muốn.<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br /> Bước 1: Ly trích DNA<br /> Ly trích DNA từ mẫu mô sinh thiết một<br /> phần ở tổn thương ung thư bằng bộ ly trích<br /> Roche theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.<br /> <br /> Exon được khuếch đại<br /> 5-6<br /> <br /> - Chuẩn bị 20μl hỗn hợp cho PCR gồm có:<br /> 2μl dung dịch đệm 1X, 2μl các deoxyribo<br /> nucleotid triphosphat (dNTP), 0,15μl Takara HS<br /> Taq DNA polymerase (5 unit/μl), 1μl đoạn mồi<br /> cùng chiều, 1μl đoạn mồi ngược chiều, 12,85μl<br /> nước cất và 1μl DNA đã ly trích.<br /> 980C x 2 phút<br /> 980C x 10 giây<br /> 600C x 30 giây<br /> 720C x 2 phút<br /> 720C x 5 phút<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Bước 3: Giải trình tự các nucleotid trên chuỗi<br /> DNA và đọc kết quả<br /> Đầu tiên tinh sạch sản phẩm PCR: sử dụng<br /> bộ xét nghiệm của QIA gen (QIAquick Gel<br /> Extraction kit).<br /> Thực hiện PCR qua 25 chu kỳ nhiệt để<br /> khuếch đại đoạn trên DNA cần xác định trình tự.<br /> Thành phần phản ứng<br /> Big Dye terminator V.3.1<br /> <br /> Thể tích<br /> <br /> Primer (10µM)<br /> <br /> 0,3 l<br /> 12,7 µl<br /> <br /> 1X seq buffer<br /> Sản phẩm PCR đã tinh sạch<br /> Tổng cộng<br /> <br /> 4 l<br /> <br /> 3 l<br /> 20 l<br /> <br /> Chương trình PCR<br /> 960C x 2 phút<br /> 960C x 10 giây<br /> 500C x 5 giây<br /> 600C x 4 phút<br /> Giữ ở 40C<br /> <br /> 25 chu kỳ nhiệt<br /> <br /> Kết tủa DNA bằng ethanol<br /> - 20μl sản phẩm DNA trên được thêm 75μl<br /> ethanol 100% và 15μl5M NH4OAC. Ly tâm<br /> 14.000 vòng/phút trong 15 phút. Thêm 300μl<br /> ethanol 70%, quay ly tâm 14.000 vòng/phút<br /> <br /> 121<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> trong 10 phút. Đổ dịch nổi, lấy cặn lắng và để<br /> khô tự nhiên.<br /> - Hòa tan tủa trong 20μl dung dịch đệm<br /> Formamide.<br /> - Biến tính DNA ở 95C trong 2 phút và làm<br /> lạnh đột ngột để tách thành các chuỗi đơn. Lấy<br /> 10μl dung dịch đệm chứa DNA đưa vào giếng<br /> đặt vào máy giải trình tự.<br /> <br /> Giải trình tự và đọc kết quả.<br /> - Đoạn DNA chứa 4 exon được chia thành 2<br /> đoạn nhỏ, đoạn chứa exon 5 và 6; đoạn chứa<br /> exon 7 và 8.<br /> - Mỗi đoạn DNA này được giải trình tự hai<br /> chiều với đoạn mồi cùng chiều và đoạn mồi<br /> ngược chiều.<br /> - Trình tự các nucleotid trên chuỗi DNA<br /> được phân tích qua máy giải trình tự DNA tự<br /> động (ABI 3100 Genetic Analyser). Nếu có đột<br /> biến thì sẽ phát hiện tạị một vị trí có hai<br /> nucleotid thay vì chỉ có một nucleotid như bình<br /> thường, do mẫu DNA được định chuỗi có chứa<br /> những chuỗi bình thường và chuỗi đột biến. Kết<br /> quả cũng được đối chiếu với trình tự các<br /> nucleotid trên DNA bình thường (mã số<br /> NG.017013) để xác định chính xác các nucleotid<br /> bị đột biến.<br /> - Dữ liệu đột biến được tra cứu theo dữ liệu<br /> của IARC (R15- năm 2010).<br /> <br /> Thống kê và xử lý dữ liệu<br /> Các dữ liệu được nhập bằng phần mềm<br /> Excel và được xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0.<br /> Mối liên quan giữa các thói quen với đột biến<br /> gen p53 được xác định qua phép kiểm χ2, liên<br /> quan có ý nghĩa khi giá trị p