intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Giáo trình Sản xuất protein trong Y học: Phần 1

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:83

Thêm vào BST
Báo xấu
54
lượt xem 5
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Giáo trình Sản xuất protein trong Y học: Phần 1 bao gồm những nội dung về DNA - cấu trúc và chức năng; các kỹ thuật cơ bản trong phân tích gen. Mời các bạn tham khảo giáo trình để bổ sung thêm kiến thức về lĩnh vực này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Sản xuất protein trong Y học: Phần 1

  1. Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành Khoa Công Nghệ Sinh Học SẢN XUẤT PROTEIN TRONG Y HỌC TS. TRẦN HOÀNG DŨNG Tháng 04/2012
  2. Sản xuất protein trong y học Chương 1 DNA - CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG Những khái niệm chính  Các thông tin di truyền được chứa trong các axit nucleic.  DNA là một sợi đôi xoắn song song ngược chiều nhau.  Cặp base (A với T và G để C) giữ hai sợi xoắn lại với nhau.  Sự sao chép DNA xảy ra thông qua việc tháo xoắn của các sợi DNA và sao chép trên mỗi chuỗi.  Các nguyên lý trung tâm của sinh học phân tử: DNA phiên mã RNA dịch mã Protein  Phiên mã là việc sản xuất một bản sao RNA của một trong các sợi DNA.  Dịch mã là giải mã của một phân tử RNA để sản xuất protein. Mỗi sinh vật sở hữu các thông tin cần thiết để xây dựng và duy trì một bản sao sống của chính nó. Các khái niệm cơ bản về di truyền và kết quả cho thấy các gen có thể được truy hồi trở lại năm 1865 và các nghiên cứu của Gregor Mendel được thảo luận bởi Orel (1995). Từ những kết quả của thí nghiệm của ông với đậu Hà Lan, Mendel kết luận rằng mỗi cây đậu Hà Lan có hai alen cho mỗi gen nhưng chỉ hiển thị một kiểu hình đơn lẻ. Có lẽ thành tích xuất sắc nhất của Mendel là khả năng xác định đúng một hiện tượng phức tạp mà không có sẵn những kiến thức về các quá trình phân tử liên quan đến việc hình thành các hiện tượng đó. Sự di truyền qua tinh dịch và trứng được biết cùng một thời điểm và Ernst Haeckel ghi nhận tinh trùng bao gồm phần lớn các vật liệu từ nhân, mặc nhiên đã công nhận rằng nhân đóng vai trò về tính di truyền. 1.1. Acid nucleic là vật chất của di truyền Ý tưởng cho rằng vật chất di truyền là chất truyền từ cha mẹ sang con theo quy luật tự nhiên đã được thừa nhận như là các khái niệm về sự di truyền đã được kế thừa trước đây. Cả hai protein và axit nucleic được xem là chất có vai trò quan trọng trong vật chất di truyền. Cho đến những năm 1940, nhiều nhà khoa học nghiên cứu về protein. Có hai lý do chính cho việc này. Thứ nhất, protein có nhiều ở các tế bào, mặc dù số lượng của một protein riêng biệt thay đổi đáng kể từ các loại tế bào khác nhau, hàm lượng protein tổng thể của tế bào nhất chiếm trên 50% trọng lượng khô. Thứ hai, axit nucleic có thể dễ dàng để vận chuyển các thông tin phức tạp, cần thiết để truyền đạt những đặc điểm của tính di truyền. DNA (deoxyribonucleic acid) lần đầu tiên được xác lập vào năm 1869 bởi nhà hóa học Thụy Sĩ Johann Friedrich Miescher. Ông tách nhân từ tế bào chất của tế bào và sau đó nó được tách bởi một chất có tính axit từ các nhân mà ông gọi là nuclein. Miescher cho thấy nuclein có chứa một lượng lớn phosphorus và không có lưu huỳnh, đặc tính mà có thể phân biệt chúng với protein. Từ những gì đã được chứng minh cho ta có một cái nhìn tổng thể, ông cho rằng "nếu muốn giả định rằng một chất đơn lẻ. . . là nguyên nhân của sự thụ tinh thì chúng ta nên chắc chắn rằng tất cả các suy nghĩ đầu tiên là về nuclein. Năm 1926 dựa trên ý tưởng về DNA bao gồm bốn nhóm nucleotide khác nhau, bằng cách xác định các loại hình liên kết mà nó đã tham gia liên kết với các 1
  3. Sản xuất protein trong y học nucleotide, Levene và Simms đề xuất một cấu trúc của bốn nucleotide (Hình 1.1) để giải thích trình tự sắp xếp hóa học của nucleotide trong axit nucleic (Levene và Simms, 1926). Họ tìm thấy một nucleotide đơn của bốn loại đã được lặp đi lặp lại nhiều lần để tạo thành phân tử acid nucleic dài. Bởi vì cấu trúc của bốn nucleotide là tương đối đơn giản, axit nucleic không có khả năng làm biến đổi tính chất hóa học của các vật chất di truyền. Protein có chứa 20 acid amin khác nhau. Hình 1.1. Đề xuất của Levene Simms năm 1926 về các mô hình bốn nucleotide của cấu trúc axit nucleic. Vào thời gian đó mô hình này đã được đề xuất, người ta cho rằng acid nucleic của thực vật và động vật có thể là khác nhau và sự khác biệt giữa DNA và RNA chưa hoàn toàn được hiểu rõ. Năm 1928, Frederick Griffith tiến hành thí nghiệm bằng cách sử dụng một vài chủng vi khuẩn Streptococcus pneumoniae khác nhau (Griffith 1928). Một số các dòng sử dụng được gọi là dòng độc hại, chúng gây ra viêm phổi ở cả người và chuột. Một số dòng khác thì không gây độc và không gây bệnh. Cả hai dòng này có hình thái riêng biệt trong đó các dòng gây bệnh có một lớp vỏ polysaccharide bao quanh vi khuẩn và hình dáng bên ngoài mượt mà, tạo bề mặt nhẵn khi được nuôi cấy trên các tấm thạch. Vi khuẩn không độc thì không có lớp vỏ và tạo một vùng nhám trên cùng một mẫu. Các vi khuẩn dòng nhẵn thì nguy hiểm vì các viên đường cấu tạo từ lớp vỏ sẽ loại bỏ hệ thống miễn dịch của động vật nhiễm bệnh và do đó chúng có thể nhân rộng và gây ra bệnh viêm phổi. Các vi khuẩn gặp khó khăn khi không có các viên nang polysaccharide nên sẽ không có sự bảo vệ này, do đó chúng dễ dàng xâm nhập và phá huỷ hệ thống miễn dịch của vật chủ. Griffith biết rằng chỉ có vi khuẩn độc sống sẽ tạo ra bệnh viêm phổi khi tiêm vào chuột. Nếu giết chết vi khuẩn gây độc bởi nhiệt sau đó tiêm vào chuột, kết quả cho thấy không có bệnh viêm phổi cũng giống như vi khuẩn sống không độc, không gây bệnh khi tiêm vào chuột. Thí nghiệm quan trọng của Griffith (hình 1.2) liên quan đến việc tiêm vào chuột vi khuẩn sống không độc (avirulent) kết hợp với vi khuẩn độc xử lý nhiệt. Không có loại tế bào gây ra tử vong ở chuột khi họ tiêm, nhưng tất cả những con chuột thu được kết hợp tiêm thuốc thì sẽ bị chết. Các phân tích máu của những con chuột đã chết cho thấy một số lượng lớn các vi khuẩn độc sống khi nuôi trên các tấm thạch. Griffith đã kết luận rằng nhiệt giết chết vi khuẩn nhẵn và bằng cách nào đó chúng đóng vai trò chuyển vi khuẩn nhẵn vào vi khuẩn sống. Ông gọi hiện tượng này là hiện tượng biến nạp và cho rằng nguyên tắc biến nạp có thể là do một số thành phần của viên nang hay hợp chất polysaccharide là nguyên nhân để tổng hợp nên tác nhân gây bệnh, mặc dù ông lưu ý rằng các viên đường một mình nó không gây ra bệnh viêm phổi. 2
  4. Sản xuất protein trong y học Hình 1.2. Các tính năng chính của thí nghiệm của Griffith, kết hợp với dữ liệu của Avery, MacLeod và McCarty để xác định DNA là nguyên tắc chuyển đổi từ Streptococcus pneumoniae. Griffith lưu ý rằng tiêm vi khuẩn nhẵn sống vào chuột dẫn đến sự hình thành của bệnh viêm phổi và cuối cùng đến cái chết của chuột. Xử lý nhiệt trước khi tiêm vi khuẩn không gây ra sự hình thành của bệnh. Không độc đối với chủng vi khuẩn, mà không gây ra các bệnh riêng của chúng, có thể được chuyển đổi bằng cách tiêm kết hợp với xử lý nhiệt vi khuẩn độc hại. Avery, MacLeod và McCarty xác định DNA là nguyên tắc chuyển đổi. Như vậy tác nhân nào đó từ phế cầu khuẩn đã biến nạp và làm cho phế cầu khuẩn từ R chuyển sang S. Người ta chứng minh được rằng :DNA tách từ vi khuẩn S nếu được đưa vào vi khuẩn R thì gây nên sự biến đổi kiểu R sang S, phát hiện này khẳng định DNA là vật chất di truyền. Trong hơn 10 năm trời kể từ sau thí nghiệm của ông, Oswald Avery cùng với Macleod và McCarty đã tiến hành trở lại thí nghiệm biến nạp này nhưng dùng trong in vitro. Năm 1944, Oswald Avery, Colin MacLeod và Maclyn McCarty xuất bản tác phẩm của họ cho thấy rằng các phân tử đóng vai trò là yếu tố cơ bản chuyển đổi là DNA (Avery, MacLeod và McCarty, 1944). Họ bắt đầu bằng cách nuôi số lượng lớn tế bào Streptococcus pneumoniae nhẵn. Các tế bào được thu nhận từ các môi trường nuôi cấy và sau đó giết chết bởi nhiệt. Sau đó đồng nhất và sử dụng chất tẩy rữa, họ thu được một phần chiết được kiểm tra bằng cách tiêm vào vi khuẩn sống theo những nguyên tắc biến nạp. Protein đã được gỡ bỏ từ dịch chiết của chloroform và polysaccharides được nhiều enzyme tiêu hóa và loại bỏ. Cuối cùng, những phần kết tuả với ethanol đã tạo ra một khối lượng xơ mà vẫn giữ lại khả năng gây ra biến nạp của các tế bào vi khuẩn sù sì (avirulent). Từ 75 lít môi trường nuôi cấy của các tế bào 3
  5. Sản xuất protein trong y học vi khuẩn, sau quá trình thu được 10-25 mg từ các yếu tố hoạt động. Những thí nghiệm được thiết lập qua một nghi ngờ rằng nguyên tắc biến nạp là DNA. Khối lượng các sợi sơ được phân tích dựa trên tỷ lệ nitơ / phốt pho, được biểu hiện trùng khớp với tỷ lệ dự kiến với DNA. Để loại bỏ tất cả các chất gây ô nhiễm có thể xảy ra từ chúng khi giải phóng, họ tiến hành xử lí với nó với enzym thủy phân protein trypsin và chyomtrypsin và sau đó họ dùng phương pháp xử lí bằng cách tiêu hóa nó với một RNA enzyme tiêu hóa ribonuclease, nó sẽ bị phá hủy bất kỳ hoạt động còn lại của protein và RNA nhưng vẫn giữ lại các hoạt tính chuyển đổi. Việc xác nhận cuối cùng DNA đã được chuyển đổi bằng cách tiêu hóa dịch chiết với deoxyribonuclease, chúng sẽ bị phá hủy hoạt động chuyển đổi. Năm 1944, O.T Avery Mc Carti đã chứng minh được rằng tác nhân biến nạp là DNA. Phế cầu khuẩn bị xử lí bằng protease hoặc RNA-aza thì hoạt tính biến nạp vẫn còn: nhưng nếu phế cầu khuẩn S bị xử lí bởi DNA-aza thì hoạt tính biến nạp không còn nữa (Cơ sở và phương pháp phân tích sinh học phân tử, T.s Chu Hoàng Mậu, trang 9). Việc thứ hai chứng minh bằng chứng rằng ADN là vật liệu di truyền đã được cung cấp bởi các nghiên cứu về sự lây nhiễm của vi khuẩn Escherichia coli bởi một trong những virus phage T2 . Thường gọi đơn giản là thể thực khuẩn, virus bao gồm một lớp vỏ protein bao quanh một lõi của DNA (xem hình 1.3). Hình 1.3. Vòng đời của thể thực khuẩn T2. Trong quá trình xâm nhiễm, vi khuẩn bám vào các bề mặt của tế bào Escherichia coli. Truyền các thông tin di truyền nhưng không phải là toàn bộ nhân thể thực khuẩn được chèn vào trong vi khuẩn, nơi nó được nhân rộng. Các thể thực khuẩn được sao chép, lớp vỏ protein vẫn còn ở bề mặt của vi khuẩn. Sau khi tổng hợp các nhân thể thực khuẩn mới được sản xuất, ly giải tế bào vi khuẩn và các nhân thể thực khuẩn được giải phóng vào môi trường xung quanh. Trong những năm 1950 chúng ta ít được biết về thể thực khuẩn lây nhiễm. Thể thực khuẩn được biết là hấp thụ vào bề mặt của vi khuẩn, sau đó có một giai đoạn tiềm 4
  6. Sản xuất protein trong y học ẩn của chúng khoảng mười phút trước khi các virus lây nhiễm bắt đầu được thực hiện, cuối cùng dẫn đến ly giải tế bào và phóng thích thể thực khuẩn. Alfred Hershey và Martha Chase lý luận rằng nếu họ biết bản chất của các protein thể thực khuẩn và acid nucleic vào đầu của quá trình xâm nhiễm, họ sẽ hiểu hơn về bản chất của những bước đầu tiến trình. Hình 1.4. Hershey -Chase thử nghiệm cho thấy acid nucleic là vật chất di truyền. Hershey và Chase tăng bacteriophages T2 là vi khuẩn có khả năng truyền tải P32trong môi trường (để đánh dấu phốt pho của axit nucleic) hoặc S35(để đánh dấu lưu huỳnh của các protein trong các chuỗi bên của các axit amin methionine và cysteine chứa lưu huỳnh). Họ sử dụng phóng xạ đánh dấu bacteriophages của chúng để lây nhiễm một môi trường nuôi cấy mới của vi khuẩn không đánh dấu. Sau khi ủ bệnh ngắn, vi khuẩn đã được thu nhận bằng cách ly tâm và đưa vào máy khuấy để tách các vi khuẩn đi từ thể thực khuẩn gắn liền với bề mặt của nó. Họ thấy rằng, khi DNA đã được đánh dấu, các chất đánh dấu được chuyển vào các tế bào vi khuẩn, trong khi các protein đánh dấu vẫn được gắn phage thực khuẩn. Họ kết luận là vật chất di truyền -tức là các vật chất truyền cho con cái - là nucleic acid. Họ sử dụng đồng vị phóng xạ P32và S35 để thực hiện theo các thành phần phân tử của các thực khuẩn trong xâm nhiễm (Hình 1.4). Vì DNA có chứa phốt pho nhưng không chứa lưu huỳnh, P32 hiệu quả với DNA và bởi vì các protein có chứa chứa lưu huỳnh nhưng không phốt pho, S35 được đánh dấu lên protein. Nếu E. coli tế bào được nuôi cấy trong sự hiện diện của P32 hoặc S35 và sau đó bị nhiễm virus T2, các tổng hợp thực khuẩn mới sẽ có cả một lõi DNA được đánh dấu phóng xạ hoặc protein vỏ đánh 5
  7. Sản xuất protein trong y học dấu phóng xạ tương ứng. Những thực khuẩn có đánh dấu có thể được phân lập từ môi trường nuôi cấy bị nhiễm bệnh và được sử dụng để lây nhiễm vi khuẩn khác không được đánh dấu. Hershey và Chase đánh dấu các thực khuẩn T2 với một trong hai chất phóng xạ S35 hoặc P32 và cho phép chúng hấp thu vi khuẩn không được đánh dấu. Các tế bào này sau đó được tách ra bằng cách ly tâm. Các tế bào được tạo huyền phù và việc dừng pha trộn để tách phần bên trong của thể thực khuẩn từ vi khuẩn bị nhiễm bệnh. Những phần không chứa các vật chất di truyền, mà được nhân rộng trong các vi khuẩn chủ. Hershey và Chase thấy rằng khoảng 80% của S35 đánh dấu đã được gỡ bỏ từ các vi khuẩn trong khi chỉ khoảng 20% của P32 đánh dấu đã được gỡ bỏ. Họ kết luận rằng hầu hết các DNA thể thực khuẩn xâm nhập vào tế bào và một dư lượng có ít nhất 80% protein có chứa lưu huỳnh của thể thực khuẩn vẫn còn ở bề mặt tế bào. Điều này cho thấy cùng với lúc đó Avery, MacLeod và McCarty cung cấp bằng chứng rằng DNA là phân tử có vai trò về tính di truyền học. Hershey và Chase hơi nghi nghờ về những phát hiện của họ và sau đó họ kết luận protein không có chức năng trong nhân thể thực khuẩn và DNA có một số chức năng (Hershey và Chase, 1952). 1.2 Cấu trúc của acid nucleid Như chúng ta đã thấy trong phần trên, các vật chất di truyền là DNA hay đúng hơn axit nucleic. Trong hầu hết các sinh vật, vật chất di truyền là DNA. Tuy nhiên, một số virus sử dụng RNA (ribonucleic acid) là những khối vật chất xây dựng cho hệ gen của chúng. DNA và RNA là những phân tử cao phân tử được tạo thành từ chuỗi tuyến tính của các tiểu đơn vị nucleotide. Mỗi nucleotide có ba phần: một gốc base nitơ, 5 nguyên tử carbon, đường và một nhóm phosphate (Hình 1.5). Sự kết hợp của các base và đường được gọi là một nucleoside, trong khi các base-phosphate- đường được gọi là một nucleotide. Chúng bao gồm đường 2’-deoxyribose, các nucleotide của DNA được gọi là deoxyribonucleotides, trong khi những thành phần của RNA có chứa các đường ribose được gọi là ribonucleotides. Các base của nucleotide có thể là bao gồm một vòng purine hoặc một pyrimidine . DNA và RNA được xây dựng từ hai vòng purine và hai vòng pyrimidine có chứa nucleotide. Cácvòng purin của cả DNA và RNA là như nhau bao gồm adenine (A) và guanine (G). Các vòng pyrimidine gồm cytosine (C) cũng được tìm thấy ở cả hai loại axit nucleic, trong khi pyrimidine gồm thymine (T) được giới hạn trong DNA, nó được thay thế bởi uracil (U) trong RNA. Hệ thống đánh số cho nucleotide được sử dụng rộng rãi trong các văn bản này được thể hiện trong hình 1.5. Mỗi nguyên tử carbon và nitơ trong vòng pyrimidine của cả hai và vòng purine được đánh số tương ứng 1-6 hoặc 1-9. Các nguyên tử cacbon của vòng đường hoặc là ribose hoặc deoxyribose được đánh số từ 1 đến 5. Như vậy, 2’-deoxyribose thiếu một nhóm hydroxyl thuộc carbon 2 của vòng đường.Các nucleotide riêng biệt được kết nối với nhau trong cả DNA và RNA thông qua gốc phosphate- đường kết nối từ các nhóm hydroxyl trên carbon số 3 của một nucleotide với nhóm phosphate vào carbon số 5 trên một nucleotide khác. Xem (Hình 1.6. )Hai nucleotide liên kết với nhau được gọi là một dinucleotide, ba được gọi là trinucleotide và nhiều kết nối trong một chuỗi dài được gọi là một polynucleotide. 6
  8. Sản xuất protein trong y học Hình 1.5. Cấu trúc của các purin và pyrimidine các axit nucleic. Các base được đánh dấu bằng màu da cam và các nhóm đường được đánh dấu bằng màu xanh. Bên dưới là hệ thống đánh số được sử dụng trong văn bản này. Các nguyên tử của vòng purine được đánh số từ 1 đến 9 và các thành phần của vòng pyrimidine được đánh số từ 1 đến 6. Các nguyên tử của các đường được đánh số từ 1 đến 5. Hình 1.6. Việc liên kết của các nucleotide như adenine và guanine của một nucleotide. Các phosphate gắn với đường trên vòng của guanine được chỉ định là α, β hay γ. Trong sự hình thành của các dinucleotide, pyrophosphate (đại diện cho β và γ phosphate) là bị mất và các liên kết trong đó liên kết phosphodiester các hydroxyl 3’ 7
  9. Sản xuất protein trong y học đến phosphate về các bon 5‘nguyên tử của đường. Các phân tử DNA luôn có một phosphate 5’tự do và hydroxyl 3’. Trong những năm 1950, nhà hóa học Erwin Chargaff thực hiện thí nghiệm tìm ra cấu trúc, thành phần hóa học của axit nucleic và ông nhận ra rằng axit nucleic chứa các thành phần tỷ lệ không bằng nhau của mỗi nucleotide. Chargaff tách DNA từ một số sinh vật, cả hai sinh chất và nhân điển hình (Chargaff, Lipshitz và Green, 1952, và cộng sự Chargaff, 1951; Zamenhof, Brawerman và Chargaff, 1952). Ông thủy phân DNA vào thành phần nucleotide của nó bằng cách xử lý với axít mạnh và sau đó tách các nucleotide bằng sắc ký giấy. Thí nghiệm của ông cho thấy các tỷ lệ tương đối của 4 base không bằng nhau nhưng cũng không phải ngẫu nhiên. Số lượng adenine (A) (residues )dư lượng trong tất cả các mẫu DNA đã bằng với số thymine (T) dư lượng, trong khi số lượng guanine (G) dư lượng ngang bằng với số cytosine (C) dư lượng (Bảng 1.1). Chargaff quy định rằng đối với bất kỳ loài nào thì: A = T và G = C Tổng các purin = Tổng các pyrimidine Tỷ lệ phần trăm (C + G) không nhất thiết phải bằng tỷ lệ phần trăm (A+T). Những phát hiện này mở ra khả năng cho sự sắp xếp chính xác của các nucleotide trong một phân tử DNA, nhưng ý nghĩa cơ bản của các T = A và G = C sự tương quan giữa C đã không được đầy đủ nhận thấy cho đến khi cấu trúc ba chiều của DNA được tìm ra . Như chúng ta sẽ thấy sau này, trong DNA thì A luôn cặp với T và G luôn cặp với C. Bảng 1.1 Nguyên tắc Chargaff’s. Tỷ lệ của các loại nucleotide được tách từ DNA của các nguồn vi sinh vật khác nhau.Trong khi tỷ lệ của các vòng của purine: purine và pyrimidine: pyrimidine biến thiên rộng, tỷ lệ của purine:pyrimidine được tìm thấy là hằng số không đổi. Giữa năm 1940 và 1953 nhiều nhà khoa học quan tâm trong việc tìm kiếm cấu trúc của DNA. Nhiễu xạ tia X như là một phương pháp xác định cấu trúc protein đã trở thành một kỹ thuật xác định. Nhiễu xạ tia X liên quan đến việc bắn một tia X tại một chuỗi chính xác của các phân tử hoặc tinh thể hoặc một sợi. Khi chùm tia X va chạm 8
  10. Sản xuất protein trong y học vào một nguyên tử trong chuỗi đó chúng sẽ được nhiễu xạ và các chùm tia nhiễu xạ được phát hiện như những đốm trên phim của tia X. Phân tích các mẫu nhiễu xạ thì cho biết các thông tin về cấu trúc và hình dạng của các phân tử trong chuỗi. Đầu năm 1938 William Astbury áp dụng các kỹ thuật lên các sợi DNA. Tới năm 1947, ông đã phát hiện một chu kỳ trong DNA dài khoảng 0,34 nm. Giữa năm 1950 và 1953, Rosalind Franklin được cải tiến dữ liệu tia X từ các mẫu DNA tinh khiết cao. Công việc của bà khẳng định có tính chu kỳ và cho rằng cấu trúc của DNA bao gồm một số dạng xoắn. Franklin đã không đề xuất một mô hình cho cấu trúc của DNA. Thay vào đó, Linus Pauling và Robert Corey sử dụng dữ liệu của Franklin, cùng với điều đó của một người khác và đã đề xuất rằng DNA là một chuỗi xoắn ba với phosphate gần trung tâm của trục và các base ở bên ngoài (Pauling và Corey, 1953). 1.3 Sợi xoắn kép Franklin đã lưu ý rằng các sợi DNA có thể cho hai loại hình ảnh nhiễu xạ khác nhau và chúng phụ thuộc vào cách chuẩn bị và lưu trữ các mẫu. Điều đầu tiên (cấu trúc A) là các sợi tương đối mất nước, thứ hai (Cấu trúc B) đã được phổ biến trên một loạt các ghi nhận. Bà nhận thấy rằng sự thay đổi từ cấu trúc A đến cấu trúc B được đảo ngược, tùy thuộc vào mức độ mẫu hydrat hóa (Franklin và Gosling, 1953). Người ta cho rằng các dạng B của DNA là quan trọng trong cấu tạo sinh học. Dạng DNA (hình dạng A xoắn phải và hình dạng Z xoắn trái) chắc chắn vẫn tồn tại nhất định trong các điều kiện và có thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển của các tế bào. Ví dụ, một loại của các protein liên kết đặc biệt với Z-DNA gần đây đã được mô tả (Schwartz và cộng sự năm 2001). Ở đây chúng tôi sẽ tập trung vào các đặc tính và sự tương tác của hình dạng cấu trúc B của DNA. Năm 1953, James Watson và Francis Crick đã cố gắng để xây dựng mô hình phân tử của ADN và nhận ra rằng các cấu trúc Pauling -Corey là không chính xác, một số nguyên tử cần phải xích lại gần nhau hơn. Bằng cách kết hợp mẫu nhiễu xạ tia X của Franklin cùng với nguyên tắc Chargaff, Watson và Crick đã đề xuất mô hình xoắn kép vào năm 1953 (Watson và Crick, 1953a). Mô hình này thể hiện trong hình 1.7, nó có các tính năng chủ yếu dưới đây và một trong số đó đã được cập nhật một ít từ mô hình ban đầu trong ánh sáng của độ phân giải cao trong dữ liệu nhiễu xạ tinh thể tia X. (A) Hai chuỗi polynucleotide dài cuộn quanh một trục trung tâm, tạo thành một chuỗi xoắn kép hướng xoắn phải, điều này có nghĩa rằng các các vòng xoắn theo chiều kim đồng hồ khi nhìn từ trên xuống trục xoắn ốc. (B) Hai chuỗi được xoắn đối song song, có nghĩa là mỗi chuỗi có một hướng xoắn đặc trưng và chạy ngược chiều nhau. (C) Các base của cả hai chuỗi là những cấu trúc phẳng, nằm vuông góc với trục. Chúng được "xếp chồng lên nhau", cách nhau 0,34 nm và hướng vào bên trong của đường xoắn ốc này. (D) Base nitơ của các sợi ngược chiều nhau được liên kết với nhau bởi liên kết hydro. 9
  11. Sản xuất protein trong y học (E) Mỗi vòng xoắn hoàn chỉnh có chiều dài là 3,4 nm. Điều này có nghĩa là chỉ có hơn 10 cặp base từ mỗi sợi (10,4 bp) tạo thành một vòng hoàn chỉnh của đường xoắn ốc này. (F) Theo chiều dài của một phân tử, các khe lớn thì rộng và các khe nhỏ thì hẹp được phân biệt rõ ràng trong cùng đường xoắn ốc. (G) Kích thước đường kính của đường xoắn được tăng gấp đôi khoảng 2 nm. Các liên kết của các base nitơ ở trung tâm của đường xoắn ốc là tính năng quan trọng nhất của mô hình của Watson và Crick. Tuy nhiên, một số tính năng khác cũng rất quan trọng để hiểu được chuỗi xoắn kép. 1.3.1 Các sợi xoắn đối song song Bản chất của các sợi xoắn đối song song của hai chuỗi polynucleotide là một phần quan trọng của chuỗi xoắn kép. Do hạn chế của các góc liên kết của các cặp base và phosphate , đường, các chuỗi xoắn kép có thể không được hình thành một cách dễ dàng nếu cả hai chuỗi chạy song song cùng chiều. Một chuỗi xoắn chạy bắt đầu từ đầu 3’đến 5’ và các chuỗi khác chạy bắt đầu từ đầu 5’ đến 3’. Điều này được minh họa trong hình 1.8. Hình 1.7. Các Watson và Crick mô hình của DNA Các danh pháp đầu 5’ và 3’ là bắt nguồn từ hệ thống đánh số của vòng đường mà chúng ta đã thấy trong hình 1.5. Theo quy ước, trình tự DNA được viết theo hướng 5’ đến 3’. Điều này có nghĩa là một chuỗi DNA duy nhất bắt đầu với một nhóm phosphate tự do trên carbon 5 của một vòng deoxyribose. Nucleotide bổ sung được tham gia vào chuỗi thông qua liên kết phosphodiester, mà liên kết các nhóm hydroxyl trên nguyên tử cacbon 3 của một đường với các phosphate trên nguyên tử cacbon 5 của một đường liền kề. Chuỗi kết thúc bằng một nhóm hydroxyl tự do trên các nguyên tử cacbon 3 của đường cuối cùng. 10
  12. Sản xuất protein trong y học Hình 1.8. Các cặp base của DNA liên kết và bổ sung. Hai chuỗi xoắn này, mũi tên trong hướng 3 đến 5, được xoắn đối sog song. Các cặp base trên một sợi xoắn được bổ sung cho nhau trên sợi đối diện, một cặp base A luôn luôn cặp với T và cặp base G luôn luôn cặp với C. 1.3.2 Cặp Base và cách sắp xếp Các base của cả hai chuỗi DNA là những cấu trúc phẳng nằm gần vuông góc với trục xoắn ốc. Các base của chính nó được xếp chồng lên nhau trong mỗi chuỗi. Sắp xếp này là minh họa tốt nhất qua sự kiểm tra của một mô hình mà máy tính đưa ra để kiểm tra độ phân giải cao dữ liệu của nhiễu xạ tia X (hình 1.9). Nó có thể được lưu ý rằng không phải tất cả các cặp base là đều vuông góc với trục xoắn và một số vị trí xoắn cho thấy các cặp base của các vòng purine và pyrimidine không nằm bằng phẳng với nhau nhưng chúng xoắn đối với mỗi vị trí khác, như các cánh trong cùng một cánh quạt (Dickerson, 1983). Các liên kết của một vòng purine (A hoặc G) với một pyrimidine (T, C) trong vòng xoắn này là quan trọng đối với sự hoàn chỉnh của các đường xoắn ốc. 11
  13. Sản xuất protein trong y học Hình 1.9. Máy tính tạo ra mô hình của DNA. Cấu trúc của dạng DNA sợi B gấp đôi bắt nguồn từ nhiễu xạ tia X có độ phân giải cao của các tinh thể DNA. Nguyên tử oxy được tô màu đỏ, phosphorus là màu cam, màu trắng carbon và nitơ là màu xanh. Độ dài liên tục của vòng purine-pyrimidine ghép nối sẽ bị phá vỡ nếu xảy ra các cặp purine-purine (quá lớn) hoặc pyrimidine-pyrimidine (quá nhỏ). Các cặp pyrimidine- purine được bổ sung cho nhau và hai sợi của một phân tử ADN đơn lẻ bổ sung cho nhau. Như vậy, nếu trình tự 5’-ATGATCAGTACG-3’ xảy ra trên một sợi AND thì các sợi khác phải có trình tự 5’-CGTACTGATCAT-3’. Hai chuỗi được bổ sung cho nhau: Chúng ta sẽ thấy trong nhiều chương sau, những ý tưởng của sự phân bổ giữa hai sợi DNA là cơ sở của nhiều thí nghiệm trong kỹ thuật di truyền. Các liên kết của hai sợi DNA rất cụ thể, chính xác phù hợp giữa hai sợi DNA. Giống như những liên kết ở trên có tính ổn định cao và dễ dàng hình thành xoắn. Như chúng ta sẽ thấy sau này, hai sợi DNA mà không bổ sung cho nhau nhưng có vẫn còn ở mức bổ sung cao vẫn giữ lại khả năng tương tác với nhau. 12
  14. Sản xuất protein trong y học 1.3.3 Các thông tin có được truyền đến nhau hay không khi mà chúng ta phá vở các sợi xoắn kép ra xa nhau Làm thế nào để thông tin có thể tổ chức trong chuỗi DNA được đọc mà không cần phải làm sáng tỏ các chuỗi xoắn kép? Bản chất bất biến của liên kết giữa đường - phosphate dường như không thể bị phá vở các trình tự cơ bản DNA. Các khe dọc theo trục xoắn ốc đã cung cấp một cơ chế mà trong đó các base có thể được phân biệt với nhau. Như chúng ta có thể thấy trong hình 1.7 Hình 1.10. Sự tương tác giữa các gen ức chế-λ của vi khuẩn λ và DNA. Máy tính tạo ra mô hình của sự tương tác giữa DNA, chúng được thể hiện bằng cách sắp xếp màu như trong hình 1.9 và gen ức chế λ, có α-xoắn được thể hiện trong màu xanh lá cây và được liên kết bởi các axit amin mà không thông qua cấu trúc thứ. Hai phân tử của gen ức chế λ (một dimer) tương tác với một phân đoạn bp 17 của-DNA chuỗi xoắn kép. (B) chuỗi xoắn 5 của gen ức chế λ. Mỗi monomer gen ức chế của DNA ràng buộc miền λ có sợi xoắn 5, đánh số 1-5 từ cuối amin của protein. Đường xoắn 3 nằm trong rãnh lớn và các chuỗi bên (không hiển thị) mở rộng đến các cạnh của các rãnh lớn, tiếp xúc với các cơ sở DNA. Hình dạng xoắn 2 và 3 xoắn cuộn ràng buộc motif DNA được tìm thấy trong nhiều loại protein liên kết ADN. Sợi xoắn 3 là chuỗi xoắn nhận dạng và có hình dạng chuỗi đặc trưng trình tự ADN trong các khe lớn, trong khi xoắn 2 là chuỗi xoắn ổn định tương tác không đặc trưng với các trục chính của sợi DNA để cung cấp ổn định cho các protein tương tác DNA. DNA bao gồm các khe được xếp chủ yếu và một số khe nhỏ dọc theo trục của nó. Đây là kết quả của các liên kết glycosidic có đính kèm một cặp base với đường trong vòng của nó, chúng không nằm trực tiếp đối diện nhau qua trục xoắn ốc. Kết quả là trục chính của các chuỗi xoắn kép liên kết giữa đường- phosphate không đều nhau dọc theo trục xoắn và các khe hình thành giữa các trục chính không bằng nhau. Các khe lớn rộng (~ 0,22 nm) và nông, trong khi các khe nhỏ hẹp (~ 0,12 nm) và sâu. Các nhóm chính bao gồm chủ yếu là nitơ và oxy nguyên tử của mỗi cặp base. Ngược lại, khe nhỏ được che lấp bởi nguyên tử nitơ và oxy nói chung hoặc là các vòng purines hoặc pyrimidine. Như vậy, khả năng tương tác các rãnh lớn cho cho thấy 13
  15. Sản xuất protein trong y học nó phụ thuộc nhiều vào trình tự cơ bản của các rãnh nhỏ. Phát hiện này đã dẫn tới sự suy đoán rằng trình tự ADN cụ thể nhận ra các protein liên kết DNA bằng cách hình thành liên kết hydro chủ yếu giữa các nhóm cụ thể ở vị trí bên trong và dọc theo các đường rãnh lớn. Một trong những cách phổ biến nhất trong đó các protein có thể nhận ra các chuỗi ADN cụ thể là bằng cách chèn các protein xoắn α vào các rãnh chính của ADN. Các chuỗi xoắn α, ban đầu được mặc nhiên công nhận bởi Pauling và Corey năm 1951. Nó là một protein cấu trúc thứ cấp, trong đó một vòng xoắn phải được hình thành bởi các axit amin trên một chuỗi polypeptide (Pauling và cộng sự năm 1951). Mỗi axit amin trong chuỗi xoắn chiếm một khoảng cách 0,15 nm, và có 3,6 amino acid của các chuỗi xoắn (xem phụ lục 1). Đường kính của trục polypeptide trong một xoắn α là khoảng 0,5 nm, tuy nhiên acid amin chuỗi có kích thước xa trục xoắn ốc. Kết quả là protein xoắn α có thể để phù hợp với hầu như chính xác vào các rãnh chính DNA sợi đôi. Acid amin kích thước chuỗi đi từ xoắn α có thể hình thành liên kết hydro với các cặp base của ADN trong chính các rãnh. Các loại protein-DNA tương tác được thể hiện trong hình 1.10. 1.3.4 Liên kết hydrogen Các mô hình Watson và Crick cấu trúc DNA dự đoán rằng hai chuỗi polynucleotide được giữ với nhau bằng liên kết hydro không cộng hóa trị hơn là tương tác cộng hóa trị. Điều này đặt ra một số câu hỏi quan trọng như liên kết hydro là gì và nó đủ mạnh để duy trì tính toàn vẹn của chuỗi xoắn kép? Để giải quyết câu hỏi đầu tiên, một liên kết hydro là một sự tương tác tĩnh điện yếu giữa liên kết cộng hóa trị của nguyên tử hydro và một nguyên tử khác với một cặp điện tử không có ái lực, một đặc tính của liên kết cộng hóa trị giữa nguyên tử oxy và nitơ. Các nguyên tử hiđrô giả định tích điện dương, trong khi các cặp điện tử không có ái lực giả định tích điện âm. Các nguyên tử này tích điện trái dấu thì hút nhau bằng liên kết hóa học yếu. Nói chung, một liên kết hóa học là một lực hấp dẫn để giữ các nguyên tử với nhau. Sự hình thành ngẫu nhiên của một liên kết giữa hai nguyên tử tự do liên quan đến việc giải phóng năng lượng nội bộ của các nguyên tử không liên kết và chuyển đổi sang một hình thức năng lượng, ví dụ như nhiệt. Lực của một liên kết cụ thể được đo bằng lượng năng lượng giải phóng theo sự hình thành của liên kết. Các liên kết mạnh hơn, năng lượng nhiều hơn được giải phóng. Sự thay đổi năng lượng (  G) đi kèm với sự hình thành liên kết được sử dụng để mô tả lực của một liên kết. Giá trị của  G được tính theo phương trình sau đây:  G = −RT ln Keq Trong đó R là hằng số khí (8,314 JK-1 mol-1), T là nhiệt độ tuyệt đối và ln Keq là log tự nhiên của các hằng số cân bằng giữa các liên kết hoặc không liên kết các phân tử với nhau.Liên kết cộng hóa trị ngắn (0,095 nm) và rất mạnh, với  G giá trị trong khoảng -100 đến -500 kJ mol-1. Liên kết hydrogen là dài hơn (khoảng 0,3 nm) và là yếu hơn nhiều với giá trị  G trong phạm vi từ -10 đến-30 kJ mol-1. 14
  16. Sản xuất protein trong y học Khi tìm thấy trong các chuỗi xoắn kép, hình thức adenine hình thành 2 liên kết hyđrô với thymine, và các hình thức cytosine ba liên kết hydro với guanine (xem hình 1.8). Trong khi một liên kết hydro duy nhất giữa chính nó là rất yếu 2500 hay như vậy liên kết hydro mà giữ lại với nhau mỗi kilobase DNA cung cấp mức độ bất thường của sự ổn định để xoắn. Điều này cũng có nghĩa là, như chúng ta sẽ thấy dưới đây và trong các chương sau, có một cặp base AT là kém ổn định hơn về mặt nhiệt động lực học hơn là một cặp cơ sở GC. 1.4 Biến tính thuận nghịch của DNA Mạch đôi DNA là một phân tử rất bền. Trong một mẫu mất nước, nó có thể tồn tại gần như nguyên vẹn trong hàng ngàn năm. Những đoạn DNA đã được phân lập từ xác ướp Ai Cập cách đây khoảng 3.000 năm. Trong những mẫu này, chuỗi xoắn kép vẫn còn nguyên vẹn, nhưng DNA đã bị đứt gãy. Hiện tại một chuổi gồm hàng triệu nucleotide được ghép lại kề nhau thì tạo được một đoạn DNA ngắn, dài khoảng 500- 1000 (bp), với một số mối liên kết đồng hóa trị tạo thành khung phosphodiester bị gãy vụn. Tác dụng chủ yếu của liên kết không cộng hóa trị là giữ chặt hai sợi xoắn kép, đồng thời nó cũng làm cho sợi đôi DNA có thể bị tách ra (biến tính) đơn giản bằng cách nung nóng. Nhiệt năng được cung cấp cho một đoạn DNA bằng cách nung nóng sẽ phá vỡ liên kết hydro, nhưng sẽ không ảnh hưởng đến các liên kết đồng hóa trị mà giữ mỗi chuỗi với nhau (Lin và Chargaff, 1966). Việc tách hai sợi DNA trong một cấu trúc xoắn được kèm theo những thay đổi về tính chất vật lý của DNA. Một trong những thay đổi này là sự hập thụ tia UV của DNA. DNA hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm do sự hiện diện của các liên kết đôi và liên kết đơn xen kẽ trong các bases DNA (hình 1,5). Mỗi một bases của bốn loại nucleotid có phổ hấp thụ khác nhau không nhiều, và quang phổ hấp thụ tổng thể của DNA là trung bình cộng của chúng. Một dung dịch DNA tinh khiết được nhìn thấy trong suốt bằng mắt, và sự hấp thu trở nên không thể đo được đến khoảng 320 nm. Giảm bước sóng dần xuống thì có một đỉnh hấp thụ vào khoảng 260 nm, tiếp theo được giảm xuống giữa 220 và 230, và sau đó dung dịch trở nên mờ đi về bản chất trong tia cực tím. Một dung dịch sợi đôi, DNA tự nhiên,với nồng độ là 0,05 mg/ml, có độ hấp thụ (hoặc mật độ quang học, OD) khoảng 1,0 at ở đỉnh cao 260nm. Khi một chuỗi xoắn DNA được biến tính để trở thành sợi đơn duy nhất, ví dụ bằng cách nung nóng, tăng hấp thụ. Cùng một nồng độ 0,05 mg/ml dung dịch sợi đôi DNA mà chúng tôi sử dụng trên sẽ có một mức hấp thụ là 1,5 khi ở dạng sợi đơn. Đây là số liệu hấp thụ thường được thể hiện dưới dạng hiển thị dưới đây: 1.0 A260nm sợi đôi DNA = 50 μg/mL 1.0 A260nm sợi đơn DNA = 33 μg/mL Sự gia tăng hấp thụ như sợi DNA kép trở thành sợi đơn, gọi là hiệu ứng hyperchromic (Thomas, 1993), cho thấy sự tương tác giữa các điện tử lưỡng cực trong việc xếp chồng các bases sợi đôi xoắn kép và được trình bày sơ lược trong hình 1.11. Việc xếp chồng của các cặp bases trong sợi đôi DNA có tác dụng làm giảm sự hấp thu của riêng nucleotide do sự tương tác cạnh tranh của các cặp bases liền kề trong ngăn 15
  17. Sản xuất protein trong y học xếp. Ở dạng sợi đơn, không có cạnh tranh như vậy xảy ra và kết quả là DNA sợi đơn hấp thụ ánh sáng với mức độ lớn hơn so với sợ đôi của nó. Hình 1.11. Ảnh hưởng của việc nung nóng sợi đôi DNA. Như là một phân tử DNA sợi kép được đốt nóng trên nhiệt độ môi trường xung quanh, các liên kết hydro không cộng hóa trị giữ hai sợi với nhau bắt đầu bị phá vỡ. Điều này được đi kèm với sự gia tăng hấp thụ ở 260 nm. Ở nhiệt độ cao trên 90 0C hai sợi DNA sẽ hoàn toàn tách biệt nhau. Quá trình này có thể thuận nghịch. Nếu nhiệt độ giảm tương đối chậm, hai sợi DNA bổ sung sẽ sửa đổi để tạo ra một phân tử DNA sợi kép kết hợp một cách chính xác. Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ mà tại đó một nửa số sợi được tách Khi một mẫu DNA được đun nóng, cấu trúc xoắn bắt đầu tách ra, trong một quá trình đôi khi được gọi là nóng chảy. Cặp bases A-T chỉ có hai liên kết hyđrô giữ chúng lại với nhau, các vùng DNA với mật độ A và T cao sẽ tách ra trước. Khi nhiệt độ tiếp tục tăng, và tăng cao liên tục thì DNA sẽ mang tích chất của một sợi đơn tự nhiên, cho đến khi hai sợi tách ra hoàn toàn. Nhiệt độ mà tại đó một nửa là DNA sợi đơn được gọi là nhiệt độ nóng chảy (Tm). Nhiệt độ nóng chảy của toàn bộ phân tử DNA thì không giống nhau, và được quyết định dựa trên chiều dài của DNA, và tỉ lệ các cặp bases G- C và A-T. Thông thường những phân tử DNA ngắn có giá trị Tm thấp, như bao gồm tỉ lệ cao của các cặp bases A-T. Nhiệt độ nóng chảy của phân tử DNA dài được tính toán dựa theo phương trình: Tm = 16.5(log[Na+]) + 0.41(%GC) + 81.50C Ở đây [Na+] là nồng độ của các ion natri trong các dung dịch DNA và (% GC) là tỷ lệ phần trăm của G-C còn lại trong mạch đôi. Vì vậy, đối với một phân tử DNA có chứa 40% GC còn lại (điển hình cho một bộ gen động vật có vú) trong một dung dịch NaCl có nồng độ 50 mM NaCl, nhiệt độ nóng chảy là 76,40C. Như chúng ta sẽ thấy trong chương sau, các phân tử DNA ngắn (15-30 bases) thường được sử dụng trong 16
  18. Sản xuất protein trong y học các thí nghiệm kỹ thuật di truyền. Vì những trình tự bổ sung ngắn, phương trình trên không còn đúng nữa, và theo dự toán (đôi khi được gọi là quy tắc Wallace) được sử dụng để xác định Tm (Wallace và cộng sự năm 1979.,): Tm = 2(AT) + 4(GC) Trong đó, cứ mỗi cặp bases A-T ở cấu trúc mạch kép đóng góp 20C ổn định của sợi đôi xoắn kép, trong khi mỗi cặp G-C đóng góp 40C ổn định. Do đó, một oligonucleotide của 20 bases của sợi đơn DNA có chứa năm chất thừa, còn lại 6 T, 3 C và 6 G sẽ có một nhiệt độ ủ bổ sung vào chuỗi ADN xấp xỉ 2 (11) + 4 (9) = 58 0C. Tầm quan trọng của nhiệt độ ủ sẽ trở nên rõ ràng khi chúng ta nhìn vào phản ứng dây chuyền polymerase (PCR) và lai tạo acid nucleic trong các chương sau. Việc làm nóng các chuỗi DNA xoắn kép để tạo ra sợi đơn là cả một quá trình ngược. DNA sợi đơn được thực hiện bằng cách đun nóng duplex sẽ thay đổi khi nhiệt độ giảm. Khi nhiệt độ giảm xuống, năng lượng nhiệt đã được sử dụng để phá vỡ các liên kết hydro giữa các sợi bị giảm theo, và va chạm ngẫu nhiên giữa các sợi sẽ giúp các sợi gắn lại theo nguyên tắc bổ sung. Nhiệt năng cung cấp giảm tương đối chậm (1- 20C / giây), sự tạo thành mạch kép sẽ hoàn tất. Hai sợi đơn phân tử DNA bổ sung sẽ đến với nhau và sửa đổi chính xác mạch kép (duplex) ban đầu trước khi mẫu được đun nóng. Nếu nhiệt độ giảm xuống nhanh chóng, ví dụ như nhúng chìm một mẫu DNA tại 940C trực tiếp vào nước đá, sự điều chỉnh các cặp bases sẽ không xảy ra và các DNA sẽ được giữ lại ở dạng một đơn tương đối. 1.5 Cấu trúc của DNA trong các tế bào Các loại axit nucleic được sử dụng để hình thành hệ gen của sinh vật phụ thuộc vào chính sinh vật đó. Ví dụ, virus có bộ gen gồm hai sợi DNA kép, sợi DNA đơn hoặc RNA, tùy thuộc vào loại virus. Nhiễm sắc thể của hầu hết các sinh vật nhân chuẩn bao gồm các sợi đôi DNA. Các bộ gen của các sinh vật prokaryote thường bao gồm một phân tử DNA vòng tròn. Nghĩa là, thay vì phải có đầu 5’ tự do và đầu kết thúc 3’, các đầu được nối với nhau để tạo thành một vòng liên tục của chuỗi xoắn kép ADN. Một số nhiễm sắc thể bổ sung phân tử DNA, gọi là plasmid, được tìm thấy trong các tế bào prokaryote. Như chúng ta sẽ thấy trong chương 3, hiểu biết như thế nào về sự phân chia các tế bào với những plasmids có vai trò hoạt động then chốt trong sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền tiên tiến. Phân tử DNA plasmid thường đóng vòng của sợi đơn hay sợi đôi DNA.Khi nhìn vào cấu trúc của DNA được trình bày trong hình 1.7, nó rất dễ nhằm lẫn là chuỗi xoắn kép, đúng hơn là một chất rắn thiếu linh hoạt hơn. Tuy nhiên, không chỉ đơn giảm là vậy. Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử của các phân tử DNA (hình 1.12) cho thấy DNA có dạng chuỗi nhiều hơn dạng que, và bao xung quanh chính nó để tạo thành một loạt các cấu trúc bất thường. Bên trong một tế bào nhân chuẩn, DNA được liên kết với một loạt các protein. Ví dụ, protein cần thiết cho nhân bản của nó, sao chép nó vào RNA và bao bọc của nó trong tế bào. Nhiều protein cuốn quanh DNA của chính nó, hoặc bằng cách nhốt hoặc bẻ cong phân tử DNA. Đối với các phân tử DNA thẳng ngắn, loại hạn chế này không phải là một vấn đề nghiêm trọng. Điểm stress được đặt trong một phần của một phân tử DNA, ví dụ, chuỗi xoắn kép có thể được thuyên giảm bởi sự tháo xoắn một phần khác của DNA. 17
  19. Sản xuất protein trong y học Hình 1.12. Hình ảnh của sợi DNA kép được tìm ra bởi kính hiển vi điện tử. DNA vòng phân lập từ polyoma virus cho thấy nhiều crossings của sợi DNA đôi, chỉ ra rằng DNA là xoắn cực đại. Sao chép từ Vinograd và cộng sự (1965) Đầu kết thúc tự do của đoạn DNA dài cho phép quay tương đối tự do quanh sợi DNA. Đối với các phân tử DNA dạng vòng. Tuy những stress có thể rất khó để chứng minh. Khi những đầu tận cùng của DNA không tự do, nó không thể lơi lỏng ra và chống lại sự xoắn tại một nơi nào đó trong phân tử. Kết quả của các phân tử DNA xoắn trong sự hình thành của DNA xoắn cực đại (Hình 1,13). Năm 1965 Jerome Vinograd và các đồng nghiệp cho rằng các phân tử DNA vòng kín có thể chấp nhận một hình thức xoắn tròn '(Vinograd và cộng sự năm 1965.,). Như một hình thức sẽ có kết quả nếu, trước khi tham gia kết thúc của một sợi đôi DNA dài thành một vòng tròn kép kín, một đầu được xoắn tương đối khác để mở đầu cho một số khuynh hướng trong phân tử. Như cuộn xoắn DNA của chính nó được gọi là supercoil. Supercoil chỉ có thể được hình thành hoặc phá vỡ từ một phân tử DNA vòng tròn kín bằng cách phá vỡ ít nhất một trong những khung xương phosphodiester. Hình 1.13. Sự hình thành của DNA xoắn cực đại. Một phân tử DNA vòng không chứa supercoil được hiển thị. Hai nửa của phân tử này đã được đánh dấu màu đỏ và màu xanh để giúp dễ phân biệt. Một lần xoắn trong phân tử sẽ dẫn đến việc hình thành một cực dương (+) và supercoils cực âm(-). Quá trình này không dẫn đến một thay đổi số lượng kết nối. Tuy nhiên, khung xương DNA bị 18
  20. Sản xuất protein trong y học phá vỡ và sau đó được đóng kín lại sau khi một đoạn của DNA đã bị rạn nứt, sau đó là số liên kết được giảm thành 2. Phân tử bây giờ là không còn xoắn cực đại. Mức xoắn cực đại trong một phân tử DNA đặc trưng có thể được mô tả bởi số lượng kết nối của nó (Lc). Con số này tương ứng với số vòng đôi xoắn trong phân tử tuyến tính ban đầu. Quá trình đưa sự xoắn cực đại vào một phân tử DNA làm giảm hoặc tăng số vòng xoắn ốc bị mắc kẹt khi vòng tròn được hình thành, và kết quả trong những thay đổi trong các số liên kết với các loài có vòng khép kín cuối cùng. Sự khác biệt liên kết (Lc) chỉ thị của các mức độ của cấu trúc xoắn cực đại trong một phân tử cần quan tâm (Hình 1,13). Các độc giả quan tâm cần tham khảo các tài liệu phổ biến cho một mô tả đầy đủ hơn của DNA cấu trúc liên kết và các vấn đề liên kết của nó (Bates và Maxwell, 1993). Vòng DNA khép kín được phân lập từ tế bào prokaryote thì không có cấu trúc xoắn cực đại. Nghĩa là, DNA tương đối không được tốt so với trạng thái tuyến tính của nó. Mặc dù tế bào Eukaryotic có chứa các phân tử DNA tuyến tính, độ dài của DNA trong nhiễm sắc thể có nghĩa là những điểm hạn chế trong một phần của phân tử DNA không thể dễ dàng làm giảm bằng cách chuyển sự căng thẳng đến một trong những đoạn kết thúc. Tương tự thích hợp ở đây là để suy nghĩ về cách bạn sẽ mở gu t một ô ng nươ c vườn xoắn. Bạn sẽ tháo xoắn bằng cách chuyển xoắn đến hết đường ống. Cuối cùng, sự quay của ống chính nó sẽ dẫn đến việc giải phóng cho nút thắt này. Đây là loại hành động để tháo một xoắn hoặc xoắn trong một phân tử DNA tuyến tính sẽ tương đối đơn giản nếu DNA bị ngắn. Chiều dài phân tử DNA nhiễm sắc thể, tuy nhiên, gặp một số khó khăn mà làm cho loại hình này tách ra hạn chế không thực tế. Chiều dài của DNA có liên quan sẽ làm cho nó khó khăn để di chuyển xoắn từ giữa DNA để kết thúc, và sự kết hợp của các DNA với các protein sẽ tạo nên một rào cản đối với loại hình chuyển động này. Trở lại với ô ng nươ c, một cách khác để loại bỏ các nút thắt (mặc dù ít thực tế hơn trong vườn) các đường ống sẽ được cắt để tạo ra kết thúc mới gần các đoạn của đoạn xoắn. Các đường ống sau đó có thể là không xoắn tại địa vị trí và chuẩn bị mẫu để loại bỏ các xoắn và cải cách các đường ống. Đó là trong thời trang còn đối với việc giải quyết các tế bào với các chủng trong DNA. Họ có các enzym, được gọi là topoisomerases DNA, làm cho các vết cắt trong các phân tử DNA đơn hoặc sợi đôi phá vỡ khung phosphodiester để cho phép các vị trí và sự tháo xoắn của chuỗi DNA. Các enzyme topoisomerase sau đó đánh dấu khung xương DNA để cải cách các phân tử DNA. 1.6. Thể nhân eukaryote Mỗi tế bào trong cơ thể chúng ta chứa một lượng lớn DNA. Những nhiễm sắc thể khác nhau của bộ gen người chứa khoảng 3.2 x 109 cặp base của DNA. Vì chúng ta là những sinh vật lưỡng bội, có hai bộ nhiễm sắc thể, tổng số lượng DNA lớn nhất trong toàn bộ tế bào của chúng ta là 6.4 x 109 cặp base. Tại 0.33 nm cặp base (hình 1.7), tương ứng với toàn bộ chiều dài ở trên khoảng 2.1 m. Kết hợp của các protein bên ngoài quấn quanh DNA tạo nhân. Trong kỳ giảm phân, các vật liệu di truyền (cùng với các protein liên kết) tương đối duỗi thẳng và phân tán khắp trong nhân giống như 19
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2