zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Y Tế - Sức Khoẻ

» Y khoa - Dược

Giáo trình Sản xuất protein trong Y học: Phần 2

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:168

Báo xấu

54
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tiếp nối phần 1, phần 2 của giáo trình Sản xuất protein trong Y học trình bày về vectors; tạo dòng gen; xác định gen; tạo đột biến; sản xuất và tinh sạch protein; phân tích hậu genome. Giáo trình phục vụ cho các bạn chuyên ngành Y học và những bạn quan tâm tới lĩnh vực này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Sản xuất protein trong Y học: Phần 2

Sản xuất protein trong y học CHƯƠNG 3 VECTORS  Vectơ là những phân tử DNA tái tổ hợp mà có thể được sử dụng để mang những đoạn DNA ngoại lai.  Các đoạn DNA được tạo dòng trong vectơ có thể đạt được với số lượng đủ lớn cho các thao tác trong phòng thí nghiệm.  Các vecto dựa vào trình tự DNA đã được sửa đổi và kết hợp để thực hiện những chức năng khác nhau.  Việc lựa chọn các vecto dựa vào kích thước phân tử DNA được chèn vào nó.  Các Vecto đã được khai thác cho nhiều mục đích khác nhau: sản xuất sợi đơn DNA, sự biểu hiện cấp độ cao của các gen mã hóa protein, và việc sản xuất RNA. Phần lớn các thí nghiệm nhân dòng vô tính phân tử sử dụng vi khuẩn E coli cho nhân dòng DNA vô tính. Thậm chí nơi được đưa các đoạn DNA vô tính vào là tế bào eukaryote. Các cấu trúc DNA hầu như luôn luôn được sản xuất trong E.coli trước rồi sau đó mới đưa vào vật chủ cuối cùng. Việc nhân dòng vô tính có thể khả thi với những ưu điểm của E.coli nên nó được sử dụng rộng rãi trong kĩ thuật di truyền. E.coli, được đặt tên từ nhà vật lý học người Đức Theodor Escherich (1857–1911) là vi khuẩn gram âm, hình que di chuyển bằng cách quay nhanh lông roi. Có nhiều trong miệng và ruột người giúp bảo vệ vùng ruột khỏi các vi khuẩn truyền bệnh, giúp tiêu hóa và sản xuất một lượng nhỏ vitamin B12 và K. Như là một sinh vật sử dụng trong phòng thí nghiệm, E.coli có những ưu điểm sau: Dễ dàng tăng trưởng trong môi trường đơn giản, ít tốn kém. Là sinh vật có khả năng nhân đôi nhanh chóng khoảng 20-30 phút trong phase log. Bộ máy di truyền học của nó đã được hiểu rõ. Sử dụng E.coli trong phòng thí nghiệm thường an toàn và ngăn chặn đột biến là cho chúng không thoát ra được môi trường phòng thí nghiệm. Có một bộ gen đã được xắp sếp và lập chuỗi. 83
Sản xuất protein trong y học Các bản sao nhiễm sắc thể phụ của DNA (các Plasmid và thể thực khuẩn DNA) có thể được lợi dụng để mang các DNA ngoại lai. Các tế bào E.coli hầu hết là sinh sản vô tính nhưng để tăng tính đa dạng và tăng tính truyền đạt thông tin gen, chúng có các cơ cấu để chuyển các vật chất di truyền từ một vi khuẩn đến loài khác. Trở lại giữa thập niên 1940 các tế bào vi khuẩn được cho là có khả năng trao đổi vật chất di truyền với loài bán giới tính. Thí nghiệm của Lederberg and Tatum đã mô tả rõ ràng sự vận chuyển thông tin di truyền thông qua sự tiếp hợp vi khuẩn. Khả năng để thực hiện được sự vận chuyển này là từ một bộ gen được gọi là F. Những gen này tồn tại trong mảnh vòng của DNA mà được sao chép lại một cách độc lập từ nhiễm sắc thể vi khuẩn, hoặc chúng có thể được hợp nhất vào trong nhiễm sắc thể. Vi khuẩn mang những gen này ( thường là những vi khuẩn đực) dùng tua để bám vào một vi khuẩn gần nó, 2 tế bào được kéo lại gần nhau, và DNA được chuyển từ vi khuẩn này đến vi khuẩn kia. Có 3 biểu hiển của nhân tố di truyền: .F hay Fepisome là phân tử sợi đôi DNA tròn, lớn mà chỉ mang những gen di truyền, được giữ trong vi khuẩn như là một sợi nhiễm sắc thể phụ plasmid. .Hfr: thành tố F đã được hợp nhất vào trong bộ gen E.coli. Khi sự tiếp hợp xảy ra, các gen F di chuyển qua tua kéo theo phần còn lại của gen sau chúng. Cuối cùng tua bị đứt, vì thế bộ gen không được chuyển hoàn toàn. Bộ gen vi khuẩn có thể được đo trong nhiều phút từ khi bắt đầu chuyển với một lược thời gian cần cho từng gen riêng biệt để được chuyển từ vi khuẩn này đến vi khuẩn kia cho biết được bao lâu kể từ khi bắt đầu sao chép. .F’ : đây là phân tử sợi đôi DNA mang các gen di truyền và một số loại gen khác. Những gen này được vận chuyển với hiệu suất rất cao bởi vì độ dài của sợi DNA được chuyển khá ngắn đủ để nó có thể di chuyển dọc theo khúc nối giữa 2 tế bào vi khuẩn trước khi tua bị đứt. Khả năng của F’ episome để tái tổ hợp và được giữ như là một thực thể tách biệt với các nhiễm sắc thể vi khuẩn làm nó lý tưởng để mang các trình tự DNA ngoại lai. Tuy nhiên kích thước của F’ episome là ngăn cản sự phân tích và thao tác trên nó và thuộc tính gen chuyển của nó có thể làm cho không ổn định. Về tổng quan các DNA ngoại lai cần được mang trong vecto để bảo đảm sự truyền và tái tổ hợp trong tế bào vật chủ. Vecto được mô tả tốt nhất như là các trình tự DNA tự tái tổ hợp mà có thể được dùng để mang các DNA ngoại lai. Các vecto có nền tảng dựa trên các chuỗi DNA được tìm thấy có thể được tái tổ hợp dưới những hình thức khác nhau. Hầu hết các vecto được sử dụng dựa vào cả plasmid và thực khuẩn λ. Tổng quan, các vecto được xem như các môdun riêng biệt mà cung cấp các điều kiện cơ bản thiết yếu cho việc nhân dòng vô tính phân tử hiệu suất cao. Các vecto được sử dụng trong tái tổ hợp DNA thường được quy cho là các vecto dòng vô tính, trong khi nếu nó được sử dụng cho biểu hiện gen được mang trong DNA dòng vô tính, nó được gọi là vecto biểu hiện. Các vecto phải mang một trong các đặc điểm sau đây để làm cho nó trở nên hữu dụng trong nhân dòng vô tính phân tử: 84
Sản xuất protein trong y học  Có khả năng tự sao chép  Có tính chọn lọc để nhận diện những tế bào đã biến đổi với những tế bào chưa biến đổi. Thêm vào đó hầu hết các vecto đều chứa những vùng enzyme nhận diện giới hạn để cho các đoạn DNA có thể được nhân dòng vô tính vào trong vecto một cách dễ dàng. Một mạng lưới lớn những loại vecto được sử dụng ngày nay, với các tính chất chuyên biệt cao và được thiết kế ra để thực hiện một chức năng đặc trưng. Trong chương này chúng ta sẽ bàn về một vài điểm tổng quan của việc thiết kế một vecto, nhưng sẽ tập trung vào các vecto dùng trong các thí nghiệm dòng vô tính. 3.1 PLASMID Plasmid thường được tìm thấy trong các đoạn DNA thuộc nhiễm sắc thể phụ mà thế hệ fromone được thừa hưởng ổn định từ một vùng nhiễm sắc thể phụ khác. Plasmid được phân tán rộng rãi trong prokaryote khoảng 1500bp đến hơn 300kbp. Hầu hết plasmid hiện diện như là các phân tử sợi đôi DNA vòng kín và thường có một kiểu hình riêng biệt trên tế bào vi khuẩn, nơi mà chúng được sao chép lại. Đó là vì plasmid thường mang gen mã hóa để chống lại các tác nhân kháng sinh và kim loại nặng, hoặc để sản xuất nguồn DNA hạn chế và các enzyme sửa chữa, những thứ mà vi khuẩn khi bình thường thì không có được. Sự sao chép plasmid thường được ghép đôi với tế bào chủ nơi mà chúng được giữ lại, cùng với sự sao chép plasmid là sự sao chép lại bộ gen của tế bào vật chủ. Plasmid thường được mô tả như dư dả (relaxed) hoặc khan hiếm (stringent) là dựa vào lượng bản sao của plasmid được giữ trong tế bào, plasmid dư tức nhiều bản sao được giữ lại trong một tế bào(10-200), trong khi plasmid khan hiếm khi chỉ hiện diện 1 hoặc 2 bản sao trong một tế bào.Nền tảng của sự khác nhau này là do cơ cấu khác nhau được thực hiện bởi plasmid để tự nhân đôi. Nói chung,plasmid dư thừa sử dụng vật chủ có nguồn gốc từ protein, trong khi plasmid khan hiếm mã hóa các nhân tố protein cần thiết cho sự nhân đôi của chúng. Hầu hết các plasmid được sử dụng ngày nay dựa trên nguồn gốc sự tự nhân đôi được tìm thấy trong plasmid E.coli ColE1 hoặc họ hàng gần của nó là pMB1. ColE1 là phân tử DNA vòng đóng dài 6646bp mã hóa cho tác nhân kháng sinh của vi khuẩn, 85
Sản xuất protein trong y học colicin E1 và các gen đề kháng mà giúp vi khuẩn vật chủ thoát khỏi ảnh hưởng của tác nhân kháng sinh. Colicin E1 là protein vận chuyển trên màng gây nên sự khử cực gây chết màng của vi khuẩn (Konisky và Tokuda, 1979). Gen kháng thuốc mã hóa cho protein ngăn cản hoạt động của Colicin bằng cách kiềm chế khả năng hình thành kênh xuyên màng vi khuẩn (Zhang và Cramer, 1993). Vi khuẩn có chứa pladmid ColE1 có thể khác biệt so với những vi khuẩn không chứa plasmid này bởi chúng có khả năng phát triển trong một dĩa có chứa colicin E1. Tuy nhiên việc bảo vệ cho quá trình phát triển này là khá khó khăn và đã lâu kể từ khi các kĩ thuật bảo vệ thuốc kháng sinh không còn được sử dụng nữa. Plasmid ColE1 được sao chép theo kiểu độc lập sử dụng DNA polymerase được cung cấp từ tế bào vật chủ. Không giống như nguồn gốc sao chép thuộc vi khuẩn, sự sao sao chép của ColE1 chỉ diễn ra theo một chiều. Plasmid không mã hóa cho protein khởi sướng quá trình sao chép nhưng lại mã hóa cho các phân tử RNA không dịch mã, các RNA này có liên quan đến sự khởi sướng quá trình sao chép cũng như một protein đóng vai trò điều hòa các phân tử RNA. Nguồn nhân đôi DNA của ColE1 là một vùng của DNA mà 2 phân tử RNA (RNAI và RNA II) được phiên mã từ nguồn khởi xướng của chúng (hình 3.2). RNA II được bổ sung vào gốc sao chép ColE1 và gắn vào nó hình thành nên dạng lai DNA-RNA (Cesarenivà cộng sự, 1991). Phân tử gắn RNA II được tách ra từ gốc, bởi enzyme mã hóa vật chủ RNase H và đáp ứng như một đoạn mồi nơi mà sự sao chép DNA xảy ra. Trong quá trình bắt cặp base, RNAII chỉ có thể gắn lên 1 sợi DNA, và kể từ đây sự sao chép DNA là đơn hướng. Hình 3.2: Plasmid ColE1 và gốc sao chép. Plasmid ColE1 là một sợi đôi DNA vòng kín, dài 6646bp. Nó mã hóa cho tác nhân kháng sinh trong vi khuẩn colicin E1 và protein miễn dịch giúp ngăn các ảnh hưởng từ chất độc trong các tác nhân kháng khuẩn có trong plasmid. Sự sao chép DNA chỉ xảy ra theo 1 hướng như được chỉ ra từ mũi tên ori. Hai phân tử RNA chưa phiên mã, gọi là RNAI và RNAII, và sản phẩm protein của gen rop điều khiển quá trình sao chép. Mũi tên trên các gen cho thấy chiều hướng phiên mã. 86
Sản xuất protein trong y học Điều khiển quá trình sao chép được thực hiện bởi một phân tử RNA chưa phiên mã khác. RNAI được bổ xung vào gốc 5’ của RNAII và dạng RNA kép giữa RNAI và RNAII không thể thực hiện như là một đoạn mồi cho sao chép. RNAI có tồn tại tương đối ngắn, do đó plasmid ColE1 được giữ ở mức 15-20 bản sao trong một tế bào. Sự tương tác giữa RNAI và RNAII được giữ ổn định bởi protein ROP(Helmer-Citterichvà cộng sự, 1988). Cơ cấu sao chép DNA thực hiện bởi ColE1 có một số vai trò quan trọng, 2 plasmid với cùng một gốc sao chép không thể cùng tồn tại trong một tế bào. RNAI của gốc plasmid ngăn cản RNAII của plasmid đi vào để khỏi hình thành đoạn mồi, đây không gọi là sao chép. Điều này quan trọng trong các thí nghiệm nhân dòng vô tính khi mà một tập hợp các plasmid được hòa trộn, điều mà tạo ra các phản ứng thắt nút, được chuyển vào trong vi khuẩn. Các cá thể chuyển theo phương pháp chỉ mang một plasmid đơn mà không phải là một tập hợp. Các Plasmid với các gốc sao chép khác nhau không thể cùng tồn tại trong một tế bào. MỘt hệ quả của cơ cấu sao chép ColE1 là sự tổng hợp DNA mới không cần khởi sướng sự sao chép DNA. Sự hiện diện các yếu tố kháng sinh mà ngăn cản sự tổng hợp protein, sự sao chép DNA nhiễm sắc thể bị ngừng lại nhưng với plasmid nền tảng ColE1 vẫn tiếp tục được sao chép và tích lũy với nồng độ cao (1000–2000 bản sao một tế bào) (Clewell, 1972). 3.1.1. pBR322 ColE1 và tương ứng với nó là pMB1, hữu dụng trong nhân dòng vô tính vecto nhưng chúng lại có một số bất lợi. Đầu tiên, khó khăn trong việc nhận diện plasmid tái tổ hợp làm chúng không được sử rộng rãi. Cần một plasmid có thể được sao chép giống với cách của ColE1, nhưng phải trong plasmid nào dễ nhận diện. Plasmid pBR322 lần đầu tiên được sử dụng như là một vecto plasmid, là một plasmid nhỏ (4363bp) được cấu thành từ các plasmid trong tự nhiên và các đoạn DNA khác (Bolivar và cộng sự, 1977). pBR322 mang những thành phần sau đây.  Gốc sao chép : pBR322 mang gốc sao chép ColE1 và gen rop để bảo đảm một lượng bản sao plasmid hợp lý ( 15-20 một tế bào) có thể tăng lên 200 vòng nhờ sự khuyếch đại chloramphenicol. Gen kháng kháng sinh: pBR322 mang 2 gen mà có thể được sử dụng như là các tín hiệu chọn lọc. Gen kháng ampicilin được nhân dòng vô tính vào trong plasmid nhờ 87
Sản xuất protein trong y học gen nhảy Tn3. Gen kháng tetracyline được nhân dòng vô tính từ plasmid pSC101 (Bernardi và Bernardi, 1984). Vùng nhân dòng vô tính: plasmid mang các vùng nhận diện enzyme giới hạn.một vài trong số này có trong cac gen kháng kháng sinh. Ví dụ như vùng cho PstI, PvuI và SacI được tìm thấy trong gen kháng ampicilin hoặc vùng cho amHI và HindIII trong gen kháng tetracylin. Các gen kháng kháng sinh trong pBR322 cho phép chọn lọc trực tiếp các chất tái tổ hợp trong một chu trình được gọi là bất hoạt vùng gắn (insertional inactivation). Ví dụ, nếu chúng ta muốn nhân dòng vô tính một đoạn DNA vào trong vùng BamHI của pBR322, sau đó DNA gắn sẽ làm ngắt quãng vai trò của gen KHÁNG chống tetracilin, nhưng vai trò của gen chống ampicilin vẫn không bị thay đổi. Các tế bào đã biến đổi được nuôi trên một đĩa thí nghiệm mang ampicilin để diệt hết tất cả các tế không mang plasmid. Sau đó được cho phát triển tiếp trên mội trường có cả ampicilin và tetracilin. Những tế bào có thể phát triển khi có ampicilin nhưng lại chết dưới sự chọn lọc của tetracilin sẽ mang plasmid có DNA gắn vào. Nói cách khác, sự thêm vào các đoạn DNA ngoại lai vào các gen kháng kháng sinh làm bất hoạt gen và dẫn tới tính nhạy cảm với yếu tố kháng sinh. Hình 3.4 Sự lồng vào yếu tố gây bất hoạt của gen kháng kháng sinh trong pBR322. Nếu đoạn DNA được lồng vào vùng nhận diện enzyme giới hạn BamHI bên trong gen tetracyline, gây ra bởi plasmid tái tổ hợp khi được chuyển vào trong vi khuẩn sẽ vẫn 88
Sản xuất protein trong y học đem lại sự sống trên môi trường chứa ampiciline nhưng sẽ không thể xúc tiến được sự phát triển trong môi trường chứa tetracilin. Gen kháng Tetracilin sẽ bất hoạt về mặt chức năng khi có mặt DNA gắn. 3.1.2 pUC plasmid PBR322 là một đột phá trong lĩnh vực sinh học phân tử như là một plasmid lần đầu tiên được sử dụng trong nhân dòng vô tính phân tử nhưng tiêu tốn thời gian và dể gặp lỗi. Vào 1982 một chuỗi plasmid được phát triển cho phép nhận diện tế bào mang DNA ngoại lai trong bước sàng lọc đơn là plasmid pUC (Vieira và Messing, 1982). Nó có 3 đặc tính quan trong khi so với pBR322  Lượng bản sao lớn – đột biến trong gốc sao chép sản xuất ra 500-600 bản sao của plasmid trong một tế bào mà không cần dùng tác nhân khuyếch đại chloroamphenicol.  Sàng lọc xanh- trắng – Sàng lọc theo kiểu này là một dạng đặc biệt của hoạt hóa vùng gắn.  Nhiều vùng nhân dòng vô tính. Đây là một loại DNA nhân tạo mà chứa trình tự của nhiều vùng nhận diện enzyme giới hạn. Nó được gắn vào một phần của vecto mã hóa β-galactosidase α-peptide theo chiều hướng để không ảnh hưởng đến chức năng và biểu hiện của nó. Tuy nhiên việc gắn DNA ngoại lai vào hầu như luôn luôn làm phá vỡ hoạt động của α-peptide. Do đó các cụm tái tổ hợp vẫn còn màu trắng trong khi cụm không tái tổ hợp lại chuyển xanh. Hình 3.5- pUC plasmid Ưu điểm của pUC plasmid so với pBR322 là đoạn DNA ngoại lai có thể được nhân dòng vào nhiều vùng nhận diện enzyme giới hạn khác nhau và các chất tái tổ hợp nhanh chóng được sàng lọc. Thêm vào đó gốc α-bổ trợ chỉ cần một gen nhỏ để mang trên plasmid. DNA mã hóa α-peptide trong chuỗi pUC trong các vecto thì nhỏ hơn 400bp. Nếu như toàn bộ khung đọc mở LacZ được cần đến, trên 3500bp sẽ được giữ lại trong những vecto này. Nói chung, sự ổn định của nhiều vecto plasmid giảm trong 89
Sản xuất protein trong y học khi chiều dài của chúng tăng. Kết quả trong giới hạn chiều dài DNA là có thể được nhân dòng vô tính vào trong một plasmid riêng biệt. Ví dụ, khả năng tế bào vi khuẩn vẫn còn plasmid pUC tái tổ hợp giảm mạnh khi kích thước của chúng đạt đến 15kbp. 3.2 Lựa chọn chỉ thị (Dấu chuẩn chọn lọc) Một đặc điểm cơ bản của các plasmid là chúng tạo điều kiện cho vector được dễ dàng phát hiện. Các plasmid như vậy được sử dụng thường xuyên như các vector trong thí nghiệm tạo dòng. Nhiều loại plasmid được tìm thấy trong tự nhiên trong các vi khuẩn và trong một số nấm men. Việc lựa chọn đánh dấu thường phụ thuộc vào các tế bào vật chủ được chuyển. Một số dấu hiệu chỉ có chức năng với các sinh vật nhân sơ, trong khi những một số khác có một tác động rộng hơn. Một số dấu hiệu thường được sử dụng lựa chọn được liệt kê dưới đây, cùng với cơ chế hoạt động của chúng.  Ampicillin – gắn vào và ức chế một số enzym trong màng tế bào vi khuẩn có liên quan đến sự tổng hợp của các thành tế bào Gram âm. Do đó, tế bào không nhân bản trong trường hợp có sự hiện diện của ampicillin. Các gene kháng ampicillin (AMPR hoặc bla) mã hóa cho các enzyme β-lactamase được tổng vào khe quanh tế bào chất của vi khuẩn, nơi mà nó xúc tác thủy phân của vòng β-lactam của ampicillin. Do đó, các sản phẩm của gen AMPR làm mất hiệu lực chất kháng sinh. Theo thời gian ampicillin trong môi trường nuôi cấy trên đĩa petri có thể bị mất hiệu lực khá rõ bởi β-lactamase. Khi điều này xảy ra, sức ép chọn lọc để duy trì các plasmid sẽ không còn nữa và quần thể tế bào có thể phát sinh mà không có plasmid.  Tetracycline – kết hợp với một protein tiểu đơn vị 30S của ribosom để ức chế sự di chuyển ribosome dọc theo mRNA và do đó cản trở quá trình dịch mã tổng hợp protein. Các gen kháng tetracycline (TETR) được mã hóa bởi 399 amino acid ở bên ngoài màng liên quan đến protein của tế bào Gram âm và ngăn chặn các kháng sinh xâm nhập vào tế bào. Như vậy, gene kháng thuốc không làm mất hiệu lực của kháng sinh. Sức ép chọn lọc sẽ được duy trì trong suốt quá trình nuôi cấy tế bào để giữ cho các plasmid có chứa gene kháng thuốc.  Chloramphenicol – kết hợp với các tiểu đơn vị 50S ribosome để ức chế sự tổng hợp protein. Các chloroamphenicol acetyltransferase (CAT) được mã hóa bởi gen kháng chloramphenicol (CMR). Các protein CAT là bốn (tetrameric) bào thể protein, trong sự hiện diện của acetyl coenzyme A, xúc tác hình thành các chất dẫn xuất hydroxyl acetoxy của chloramphenicol nó không thể liên kết với các ribosome. Như với ampicillin, các sản phẩm gen CMR làm mất hiệu lực của chất kháng sinh.  Kanamycin và neomycin – kết hợp với các thành phần ribosome và hạn chế tổng hợp protein. Các protein được tổng hợp bởi mã hóa gene KANR được tổng hợp ở khe quanh tế bào chất và cản trở việc vận chuyển các chất kháng sinh vào trong tế bào. Giống như các gene kháng tetracycline, gene KANR không làm mất hiệu lực các chất kháng sinh.  Bleomycin và zeocin – các kháng sinh glycopeptide liên kết với DNA và ức chế DNA và sự tổng hợp RNA. Chúng tác động chống lại hầu hết các vi khuẩn (bao gồm cả E. Coli), vi sinh vật có nhân điển hình (ví dụ như nấm men), các tế bào thực vật và 90
Sản xuất protein trong y học tế bào động vật. Các gene Sh ble từ vi khuẩn Streptoalloteichus hindustanus mã hóa một protein nhỏ có đề kháng đối với zeocin bằng cách gắn vào các chất kháng sinh (Gatignol, Durand và Tiraby, 1988).  Hygromycin B - ức chế bằng cách can thiệp dịch chuyển vị ribosome. Kháng sinh tác động chống lại cả hai sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn. Các gen kháng (HYGR, mã hóa hygromycin-B-phosphotransferase) bất hoạt các kháng sinh bởi sự phosphoryl hóa. Mặc dù vectơ plasmid được sử dụng cực kỳ rộng rãi sử dụng trong nhiều ứng dụng của việc tạo dòng và đã được thiết kế với mục đích tạo ra nhiều chức năng hơn. Những chức năng trong số này sẽ được thảo luận trong chương sau của cuốn sách này, nhưng ở đây tôi sẽ liệt kê một số ví dụ để cung cấp cho người đọc một chức năng chính trong sự đa dạng của việc sử dụng plasmid.  Tách dòng - hầu hết các thao tác thực hiện trên DNA trong phòng thí nghiệm đều lựa chọn có mang plasmid. Dễ dàng thao tác sử dụng và lưu trữ của plasmid nên thường được sử dụng trong các thí nghiệm về DNA tái tổ hợp.  Vector con thoi - những plasmid không chỉ chứa toàn bộ thông tin gốc nhân bản và lựa chọn đánh dấu cho E. coli, những trình tự cũng có chức năng tương tự để duy trì truyền lại ở các tế bào vật chủ khác. Ví dụ, plasmid cho nhân bản và biểu hiện của gen ở nấm men Saccharomyces cerevisiae có chứa toàn bộ thông tin nhân bản và đánh dấu lựa chọn cho cả E. coli và nấm men. Hầu hết các các thao tác DNA sẽ được thực hiện bằng cách sử dụng E. coli là tế bào chủ trước khi chuyển thành DNA cuối cùng được tạo ra vào trong nấm men.  Tạo ra RNA - nhiều plasmid đã được thiết kế để nhân bản đoạn DNA ngoại và nó có thể phiên mã thành RNA. Như vậy plasmid bao gồm các vùng khởi động (promoter ) cho một RNA polymerase, ví dụ: Ở bacteriophages có T3, T7 hoặc SP6, Giả sử RNA có thể được thực hiện trong ống nghiệm bằng cách sử dụng RNA polymerase tinh khiết và DNA plasmid. Các RNA được thực hiện bằng phương pháp này thường được sử dụng như thăm dò lai trong Northern blotting.  Sản xuất Protein - nhiều plasmid chứa trình tự khởi đầu (promoter) để biểu hiện các gen ngoại mà chúng có. Biểu hiện thường được thực hiện trong E. coli, nhưng bằng cách sử dụng các đoạn khởi động (promoter) phù hợp, protein biểu hiện có thể được định hướng hầu như bất kỳ trong cơ thể nào. Sản xuất protein ở mức độ cao có thể được điều khiển từ một promoter mạnh, trong khi sản xuất ở mức thấp có thể sẽ là từ các promoter yếu hơn. Mức độ sản xuất protein cũng có thể được điều khiển bằng cách thay đổi số lượng bản sao của plasmid này. Trong kỹ thuật di truyền, các plasmid gặp trong tự nhiên thường được sửa đổi nhiều để tạo ra các vector có các đặc điểm mong muốn. Ví dụ, nếu bạn đã nhân bản vô tính một gen, bạn có thể muốn biểu hiện các sản phẩm của gene ở mức cao trong E. coli, trong khi cũng thể biểu hiện protein trong môi trường nuôi cấy tế bào động vật có vú và sản xuất một protein mới dựa trên protein đã biểu hiện mà kháng thể đơn dòng có sẵn để dùng. Các hệ thống nên được thiết kể để vận chuyển vào các đoạn 91
Sản xuất protein trong y học ADN giữa các vector mà không cần phải sử dụng enzyme giới hạn. Một trong những hệ thống được phác thảo (hình 3.7). Hình 3.7. Gene xáo trộn giữa các plasmid bằng cách tái tổ hợp. Các gen được chuyển giao từ các plasmid cho đến plasmid nhận tại địa điểm LoxP sử dụng enzyme Cre recombinase. Ở đây, các đoạn DNA mã hóa gene mục tiêu được chuyển từ một plasmid khác do tác động của các enzyme Cre recombinase. Cre nặng 38 kDa protein recombinase từ các vi khuẩn P1 (Sternberg và cộng sự, 1981). Nó làm trung gian để điều chỉnh giữa sự tái tổ hợp và trong các trình tự DNA tại các điểm cụ thể gọi là các điểm loxP ( Abremski và Hoess, 1984 ). Các điểm này bao gồm một cặp 13 bp ngược lặp đi lặp lại cách nhau bởi một vùng đệm 8 bp. Vùng đệm 8 bp trong điểm loxP được định hướng rằng sự tái tổ hợp xảy ra theo một chiều hướng chính xác và định hướng trước. Plasmid cho chứa hai điểm loxP và hai điểm đó kẹp giữa hai đầu của gene mục tiêu. Plasmid nhận chứa một điểm loxP và các yếu tố mà các gen mục tiêu sẽ trở thành hợp nhất. Các gen mục tiêu khi chuyển sẽ liên kết với các yếu tố biểu hiện cụ 92
Sản xuất protein trong y học thể mà các vector nhận đã được thiết kế. Hơn nữa, nếu các trình tự mã hóa cho các gen quan trọng nằm trong khung ngược dòng với các điểm loxP ở vector cho nó sẽ tự động được nằm trong khung với tất cả các chuỗi axit amin đã thiết kế ở vector nhận. Một plasmid cho được thay thế và hệ thống chấp nhận plasmid đó là dựa vào một điểm đặc biệt các phản ứng tái tổ hợp trung gian bởi thể thực khuẩn λ (Karimi, Inze và Depicker, 2002). Trong trường hợp này, các đoạn DNA tái tổ hợp hai bên các điểm ( att ) có thể được chuyển vào vector tái tổ hợp có chứa các điểm tương thích ( att × attP hoặc attL × attr ) trong một phản ứng trung gian bởi các protein tái tổ hợp λ. Tính linh hoạt của plasmid đã dẫn đến chúng được sử dụng rộng rãi như là các vectơ cho các thí nghiệm về thao tác trên gene. Tuy nhiên nó cũng có một số hạn chế đáng kể. Thứ nhất, hiệu quả mà plasmid được chuyển đến một tế bào vi khuẩn là rất thấp. Phân tử DNA plasmid được đưa vào tế bào vi khuẩn phải được tế bào chấp nhận ( xem Chương 2 ), nhưng điều này không phải lúc nào cũng được đáp ứng. Plasmid được chuyển vào tế bào E. coli được cho là có mức độ thích nghi tốt nhất 1 × 109 tế bào chuyển đổi có thể được tạo ra mội microgram phân tử DNA plasmid. Đối với một plasmid điển hình, 1 μg đại diện cho khoảng 1,5 × 1011 phân tử. Điều này có nghĩa là các tế bào thu được ít hơn 1 % các phân tử DNA có sẵn. Thứ hai, năng suất của các plasmid để chuyển các đoạn lớn của DNA ngoại lai là rất hạn chế (Bảng 3.1). Hầu hết các plasmid trở nên không ổn định nếu kích thước của chúng vượt quá khoảng 15 kbp.Trong nhiều trường hợp, điều đó không thành vấn đề, nhưng trong một số ứng dụng, điều quan trọng là phải tăng kích thước của các đoạn lên tối đa trước khi tác dòng. Cần có các vector có khả năng tiếp nhận các đoạn DNA lớn. Các loại vector có như vậy được phát triển để khắc phục những khó khăn này. 3.3 λ Vectors Vào đầu năm 1950, Andre lwoff đã miêu tả một đặc tính kì lạ của Escherichia coli. Khi ông soi sáng một chút sự căng của những tế bào E.coli với một lượng ánh sáng cực tím vừa phải, vi khuẩn dừng hẳn sự phát triển và, sau đó khoảng 90 phút, vi khuẩn dung giải và phóng thích ra nhiều mẫu virut, gọi là λ , bên trong môi trường trung gian (Figue 3.8) Những virut, nhiều khi được gọi là thể ăn vi khuẩn hoặc đơn giản là thể thực khuẩn, có thể gây nhiễm tới các tế bào E. coli khác mà trước đây không gây nhiễm bởi những thể thực khuẩn λ. Không chỉ tất cả những tế bào vi khuẩn chịu sự biến đổi phân hủy này khi bức xạ bằng con đường này. Tuy nhiên, vi khuẩn đầu tiên tiêu diệt thễ ăn khuẩn A, nhưng không thể phân hủy, là đặc điểm khác thường.Chống lại sự lây nhiễm bởi thể ăn khuẩn A, những tế bào E. coli sẽ chịu đưng một trong 2 cách thức sau. Hoặc tế bào thủy phân và tổng hợp nên nhiều mảnh thể ăn khuẩn mới sẽ phóng thích vào trong xung quanh khoảng giữa, hoặc, một sự lựa chọn nữa , thể ăn khuẩn có thể thay đổi đột ngột vào trong Dormant lifestyle mà thể ăn khuẩn DNA trở nên hợp nhất trong nhiễm sắc thể E coli bên trong nguyên nhân này là sự phân giải lifestyle được tiếp tục. 93
Sản xuất protein trong y học Chu trình sống của thể ăn khuẩn λ được diễn tả trên biểu đồ hình 3.9. Thực ra nó là vi khuẩn phân giải mà nó tỏ ra phân hủy nhanh chóng để chống lại bức xạ cực tím. Trong phòng thí nghiệm, thể ăn khuẩn λ phát triển và tái tạo được kiểm tra trên đĩa petri (hình 3.10). 94
Sản xuất protein trong y học Thể ăn khuẩn được pha trộn với những tế bào E. coli xem là 1 dung dịch mềm dẻo agar được gọi là top agar hỗn hợp được rót trên bề mặt dinh dương agar một lớp mỏng và được ủ cho vi khuẩn phát triển. λ phát triển là nguyên nhân của cái chết (sự phân giải) của những tế bào E.coli xung quanh vị trí tiêm nhiễm lúc ban đầu. Trong những vị trí được theo dõi trên đĩa có một chút hỗn độn những màng trong vải batit vi khuẩn. DNA λ có thể được lọc từ những mẫu thể ăn khuẩn bao gồm có những màng này. Di truyền học và phân tử sinh vật học ở cấp độ phân tử của thể thực khuẩn λ vừa được nghiên cứu rộng khắp – xa hơn là cung cấp thông tin về λ , độc giả được hướng dẫn bởi văn bản hết sức hoàn hảo bởi Mark Ptashne (Ptashne, 1992). DNA bao gồm thể ăn khuẩn là 1 phân tử sợi đôi thẳng với kích thước 48502 bp, đầu 5- và 3- kết thúc của λ hệ gene có 12 cặp base mà sợi đôi được gọi là cố kết hay cos kết thúc. Những chuỗi này bổ sung và có thể được thấu với một vài thứ khác tới dạng 1 phân tử sợi đôi mạch vòng (hình 3.11). Chức năng liên quan tới gene của λ thường được tập hợp lại với nhau tạo nên hệ gene λ loại trừ 2 gene điều hòa dương N và Q, những gene bên trên phía bên tay trái của bản đồ gene quy ước mã hóa cho protein đầu và cuối của mảnh thể ăn khuẩn. 95
Sản xuất protein trong y học Theo sau nó là những gene mà sản phẩm protein liên quan với sự tái tổ hợp và quá trình hoạt hóa thực khuẩn của nhiễm sắc thể thể ăn khuẩn được chèn vào bên trong nhiễm sắc thể chủ và được tái tạo ổn định như là tiền thể ăn khẩn. Phía bên tay phải của bản đồ gene có liên quan đến sự điều chỉnh bản sao và tiền ăn khuẩn nhiễm vào cho tới lần thứ 2 ( N, cro,cl), theo cùng là những gene cho sự tổng hợp DNA, chức năng điều chỉnh chậm trễ (Q) và sự phân hủy của những tế bào chủ. Sự hiểu biết khá lớn của chúng ta về thể thực khuẩn λ và những con đường mà nó phân hủy và phân giải chu trình sống được điều khiển vừa được tạo nên λ một vector lý tưởng để mang những mảnh DNA ngoại bào. Lợi thế chủ yếu của λ căn cứ vào những vector ngoài bào plasmid có khả năng mà thể ăn khuẩn có thể xâm nhiễm vào tế bào E.coli. Khi chúng ta thực sự có 1 buổi thảo luận, sự biến nạp DNA plasmid vào trong vi khuẩn là 1 quy trình không có hiểu quả, sự xâm nhiễm λ là một con đường có hiệu quả để đưa DNA vào trong tế bào vi khuẩn. Để nghiên cứu làm thế nào mà λ có thể được lợi dụng như là một vector, thật là quan trọng để có 1 hiểu biết cơ bản về chính thể ăn khuẩn. Thể ăn khuẩn λ lây nhiễm và phân giải xảy ra được định rõ trong trong từng buớc. sự lây nhiễm xảy ra như là kết quả của sự hút bám của mảnh thể ăn khuẩn λ tới tế bào vi khuẩn bằng việc kết hợp với receptor maltose. Bộ gen DNA của λ được tiêm nhiễm vào trong tế bào và hầu như gửi thông tin ngay lập tức. ngay tại điểm này nó có thể xâm nhập bằng 1 trong 2 con đường.  Con đường Lýogenic. DNA thể ăn khuẩn trở thành hợp nhất với hệ gen vi khuẩn tái tổ hợp via tương đồng giữa attP và khu vực hệ gene attB vi khuẩn) và tái tạo cùng với DNA của vi khuẩn. di chứng DNA tiền thực khuẩn kết hợp cho tới khi nó gây ra việc xâm nhập bằng con đường phân giải 96
Sản xuất protein trong y học  Con đường phân giải. Số lượng to lớn của những mảnh thể ăn khuẩn (protein và DNA) xảy ra mà cuối cùng dẫn đến sự phân giải tế bào. Sự giả quyết khi sự phân giải hay phân huỷ xảy ra là kết quả của hoạt động của protein cII, Hoạt tính của CII thì phụ thuộc vào bản sao của chất ức chế cI. Và một vài gene phụ thuộc vào sự hoà hợp với DNA thể ăn khuẩn bên trong nhiễm sắc thể E.coli. hoạt tính cII là kết quả sự chấp nhận con đường phân giải , trong khi cII không hoạt tính kết quả trong con đường phân huỷ cũng được kéo theo. Protein cII thì tương đối không bền và dễ bị ảnh huởng tới sự phân tách và phá huỷ của protease vi khuẩn. Những điều kiện của môi truòng ảnh huởng tới hoạt tính của những protease này. Khi phát triển ở mức trung lớn, ví dụ , proteases có hoạt động chung , giống như cII bị suy biến và λ phân giải xảy ra. Dưói những điều kiện của E.coli starvation , protease ít thiết thực và cho nên λ sẽ có nhiều sự phân giản thường xuyên hơn Cách hoạt động này rất có ý nghĩa cho tế bào thiếu đới này sẽ ít cấu thành thiệt suy yếu để tạo nên những mảnh thể ăn khuẩn mới. Con đường phân huỷ được mô tả bởi 1 chuỗi những bản sao xảy ra mà sản xuất sự khác biệt của nhưng protein mà phụ thuộc vào sự tái tạo ra DNA thể ăn khuẩn và sản phẩm của những mảnh thể ăn khuẩn mới.  Bản sao sớm bản sao của gene N và cro xuất hiện. bản sao này được đưa ra để ngăn cản bởi sản phẩm của gene cI và trong 1 quá trình phân giải sự ngăn cản này là cơ bản của sự miễn dịch lần hai  Bản sao chậm trễ sớm. bản sao protein N kêt shợp với RNA polymerase vi khuẩn và đẩy mạnh bản sao của gene thể ăn khuẩn cuộn tròn vào trong bản sao DNA  Sự tái tạo. sự tái tạo lớn tiến đến 1 đơn khởi nguyên của khu vực tái tạo. sự tái tạo chậm trễ dẫn đến via 1 chu trình lăn cuôn tới sản xuất long concatamer của DNA thể ăn khuẩn mà nó kết hợp với những thể ăn khuẩn khác tại những vị trí cos  Bản sao trễ. Sản phẩm protein của gene cro che lấp đi mức độ quan trọng và sau đó dừng lại ở bản sao sớm. sản phẩm của gene Q hoạt hoá bản sao, đưa đến kêt quả sản phwmr protein cần đến cho đầu và đuôi của mảnh thể ăn khẩun truởng thành, và những thể ăn khuẩn đó phụ thựôc vào sự phân huỷ tế bào vi khuẩn Cuối cùng, tập hợp thể ăn khuẩn mang đến khi 1 đơn vị chiều dài của DNA được mang vào tập hợp đầu bởi sự phân tách concatameric DNA tại vị trí cos. Đuôi thì được thêm vào và những mảnh truởng thành thể ăn khuẩn được hoàn tất. Cùng với sự phân huỷ tế bào , khoảng 100 mảnh thể ane khuẩn tổng hợp mới được phóng thích từ 1 tế bào lây nhiễm đơn vi khuẩn.. Wild-type λ DNA bao gồm một vài vị trí nhận ra enzyme hạn chế khác thường bên trong những mảnh DNA ngoại lai có thể được nhân vô tính, và do vậy mà nó không hoàn toàn thích hợp như là 1 vector để mang nhiều chuỗi. thêm vào đó, sự gắn kết của DNA vào trong λ thể ăn khuẩn có kích cỡ giới hạn.. Khả năng gắn kết sẽ chỉ mang đến với những mảnh DNA tương ứng giữa 78 và 105 % so với kích thuớc của hệ gene wild – type ( 37 – 51 kbp). Những giới hạn đạt ra hạn chế gay gắt với số lượng DNA mà có thể n\tạo dòng trong hệ gene thể ăn 97
Sản xuất protein trong y học khuẩn. Hai luận điểm quan trọng, tuy nhiên, giả thiết đưa ra mà λ có thể phù hợp như là vector tạo dòng. Đầu tiên nó được xác định sản phẩm gene phụ thuộc vào sự tái tổ hợp có thể bị loại bỏ bởi hệ gene λ và phân huỷ chu trình sống có thể vẫn đựoc hoàn thiện và những mảng có hình thái, DNA còn lại, thường nhắc đến như ở bên tay trái hay tai phải của hệ gene λ , khả năng có điều kiện tất cả chức năng tất yếu cho cong đưòng phân huỷ mang tới. Điều thứ hai, tất nhiên mang lại những enzyme giới hạn bởi những vị trí được nhận ra có thẻ được được loại trừ mà không có chức năng gene quá ít, mà cho phép sự phát triển của vector với vị trí duy nhất cho sự găn vào của DNA ngoại bào. 1 vector có thể theo cách đó được xây dựng mà nó thiếu những gene phụ thuộc vào sự tái tổ hợp, và vì vậy mà có thể chỉ nhập vào chu trình phân giải, nhưng có khả năng mang nhiều DNA lớn ngoại bào thêm vào. Hai buớc cơ bản của vector vừa được phát triển: Vector thêm vào – DNA được thêm vào trong 1 enzyme giới hạn nhận biết vị trí cắt Vector thay thế - DNA ngoại bào thay thế cho những mảnh DNA (mảnh nhồi) của vector Sự thuận lợi của vector thay thế mà nó có khả năng mang nhưng đoạn DNA lớn. ví dụ, λEMBL4 có 1 vector 42 kbp mà nó bao gồm có 14 kbp DNA đệm giữa bên tay trái và phải của λ. Sự gắn chặt chỉ của nhửng chủng λ sẽ tạo ra 1 hệ gene λ 28kbp. Cái đó quá nhỏ để xếp vào trong 1 mảnh λ . sự thêmvào DNA ngoại bào giữa 2 chủng λ tuy nhiên hệ gene đạt tới kích cỡ gói gọn. Giới hạn kích thuớc gói gọn là cách thức 98
Sản xuất protein trong y học mà λEMBL4 có khả năng lưu giữ những mảnh DNA ngoại lai khoảng chùng kích thuớc 23kbp ( hình 3.12) Giới hạn kích thước của gói λ như vậy cung cấp 1 bộ máy chắc chắn để DNA ngoại bào được thêm vào giữa chủng λ tới dạng tái tổ hợp. Một vài kế hoạch cơ bản khác để tìm ra để nhận dạng những thể ăn khuẩn λ tái tổ hợp.. Sự khử của gene cI. Một vài vector thể ăn khuẩn λ ( e.g λgt 11) có duy nhất enzyme cắt giới hạn nhận dạng những vị trí cắt chứa đựng vị trí gene cI. Những thể ăn khuẩn mà gene cI phá vỡ bởi sự thêm vào DNA ngoại lai có 1 thay đổi hình thái, mà những mãng tạo ra xuất hiện “ clear” khi kháng lại sự hỗn độn. tấm chắn của loại này là kĩ thật khó và phụ thuộc vào khả năng kết nối kỉ năng trên từng phần của nguời quan sát. Tấm chắn blue – white. Những vector ăn khuẩn λ ( e.g. λZAP) được xây dựng để chứa đựng gen lacZ giống hệt nhau của the α-fragment và β -galactosidase. Tấm chắn cho những thể ăn khuẩn tái tổ hợp có thể sau đó được hình thành trong tế bào E coli Nhanh chóng từ the ω-fragment của β –galactosidase trong 1 con đường giống nhau tạo nên tấm chắn tái tổ hợp trong pUC base plasmid. Một lựa chọn là hệ gene λ được tạo ra, vấn đề là làm thế nào để đưa DNA vào trong vi khuẩn mà nó có thể tái tạo lại trong E. coli ( hình 3.13), bình thưòng gói gọn trong vivo của λ DNA bao gồm đầu tiên làm pre-head. Một đơn vị chiều dài của DNA λ sau khi được thêm vào bên trong pre- head , với đơn vị chiều dài chuẩn bị bởi sự phân chia của hệ gene λ concatamerized tại những vị trí xung quanh. Một protein capsid thứ yếu D sau khi thêm vào trong pre – head để hoàn thiện đầu chín, và những sản phẩm của những hệ gene khác đáp ứng như là 99
Sản xuất protein trong y học protein chính yếu, bảo đảm sự liên kết của những đuôi đã hàn thành với dầu hoàn thành. Gói gọn λ của hệ gene tái tổ hợp có để xảy ra trong in vitro bằng cách lợi dụng 2 đoạn E.coli mà chống lại λ phân giải kìm hãm những điểm khiếm khuyết khác nhau gói gọn trong cô đưòng này. Một điểm khuyết trong sản xuất protein E, kết quả từ một sự thay đổi t\bên trong gene E, ngăn cản pre-head thành dạng thẳng BHB2688. một sự thay đổi trong gene D cản trở sự thay đổi của pre-head, với DNA kết thúc, bên trong dầu hoàn thiện trong strain BHB2690. thành phần của BHB2699/BHB2690 dung giải nhỏ nhất, tuy nhiên, hoàn thành một vài thứ thiếu hụt khác nhau và cung cấp tất cả những sản phẩm gói gọn chính xác ( hình 3.13 ). Do đó, hệ gene λ tái tổ hợp có thể đựoc tạo nên bằng in vitro và gói gọn trong mảnh thể ăn khuẩn bình thường truớc khi tái sinh và nhân lên trong tế bào Ecoli. 3.4. Các vector cosmid Chỉ những đoạn DNA phù hợp cho in vitro mới được chuyển vào thể thực khuẩn λ tại 2 điểm cos trong chuỗi trình tự ở khoảng 37 – 51 kbp. Vector cosmid đã được phát triển nhờ quan điểm này, và nó giống plasmid ở chỗ được đưa vào trong thể thực khuẩn λ ở điểm cos (Collins and Bruning, 1978). Hình 3.14 cho thấy toàn bộ cấu trúc của một vector cosmid và một hệ thống tạo dòng vô tính để chuyển DNA ngoại lai. Cũng như plasmid, cosmid gồm một bản sao và một marker lựa chọn. Cosmid cũng chỉ có duy nhất một enzyme giới hạn để nhận biết điểm để chèn các đoạn DNA vào. Sau khi phản ứng chuyển vừa xảy ra, thể λ mới sẽ được đưa vào tế bào E.coli. DNA được chuyển vào cũng giống như các λ DNA bình thường và nó sẽ truyền đạt thông tin bổ sung cho các điểm cos. Sẽ có hiện tượng thiếu hụt các chuỗi λ có nghĩa, tuy nhiên, những đoạn λ chuyển sẽ không chuyển sang giai đoạn này. Thông tin trong DNA sẽ được bảo vệ trong tế bào E.coli. Do vậy sự chọn lọc các thể biến dị sẽ dựa trên cơ sở của sự kháng thuốc kháng sinh và khuẩn lạc của vi khuẩn sẽ có dạng chứa các cosmid tái tổ hợp. Khi tiền thể thực khuẩn λ có thể chèn vào khoảng 37 – 51kbp, và hầu hết cosmid có kích thước khoảng 5kbp thì đoạn DNA ở khoảng 37 – 41 kbp có thể được tạo dòng thành những vector. Đây là một tính chất quan trọng so với việc tạo dòng từ chính các vector λ Cosmid, giống plasmid, rất bền vững, tuy nhiên phải chèn vào một đoạn DNA lớn điều này có ý nghĩa trong việc bảo vệ vector trong tế bào vi khuẩn. Các chuỗi DNA lặp lại thường gặp ở các DNA của sinh vật eukaryote, và sự tái cấu trúc của DNA có thể dẫn đến sự tổ hợp lại các trình tự lặp lại của DNA chèn vào cosmid. Khó khăn chính khi làm việc với cosmid là những sản phẩm tuyến tính, chuyển đoạn DNA vào cosmid và chèn nhiều vị trí cùng lúc. Hai vấn đề cơ bản đặt ra: Các phản ứng chuyển vào cosmid và chèn DNA, giống như những gì đã trình bày trong hình 3.14, sẽ tạo ra những phân tử DNA vòng không có khả năng tham gia vào phản ứng “bao gói” in vitro. Có nhiều hơn một phân tử DNA được lồng vào sẽ gắn vào giữa đoạn DNA cosmid. Điều này khiến cho cấu trúc DNA được lồng vào có vẻ sai khác. 100
Sản xuất protein trong y học Những khó khăn này có thể được khắc phục với việc cắt cosmid với 2 enzyme giới hạn khác nhau bằng việc tạo ra các điểm giới hạn trái và giới hạn phải để không kết hợp với vị trí nào khác (Ish-Horowicz and Burke, 1981). Enzyme phosphastase sẽ tác động lên DNA chèn để đảm bảo những đoạn lồng vào sẽ không chèn vào DNA của cosmid. 3.5 M13 vectors M13 và các họ hàng của chúng là f1 và fd là thực khuẩn E.coli, dạng sợi. M13 là một lysogenic phage giống đực đặc trưng (male – specific) – thực khuẩn thể sinh ra virus phân hủy vi khuẩn khi bị kích thích. Hệ gene của chúng là một DNA chuỗi đơn dạng vòng dài 6407 bp (hình 3.15). Thực khuẩn thể M13 (M13 phage) có kích thước 900 * 9 nm, chứa một vòng đơn phân tử DNA (goi là chuỗi +). M13 xâm nhập vào vi khuẩn qua “cảng” là tiêm mao. Phage gắn một đầu vào tiêm mao rồi chuỗi đơn DNA của chúng xâm nhập vào vi khuẩn ( hình 3.16). Chuỗi đơn nhân đôi một cách nhanh chóng tạo chuỗi kép ( relicative form, RF) bằng cách tổng hợp mạch DNA bổ sung (mạch -) sử dụng DNA polymerase của vi khuẩn. Dạng RF của phage tăng lên theo cấp số nhân, khoảng 100 phân tử RF xuất hiện trong vi khuẩn. Quá trình phiên mã của hệ gene virus sản xuất những protein cần thiết cho sự lắp ráp một virus mới. Chuỗi đơn mã hóa protein (protein mã hóa bởi gene 2 ) thúc đẩy sự sao chép RF DNA chỉ có 101
Sản xuất protein trong y học trên một mạch đơn của DNA virus( mạch +). Các chuỗi phân tử DNA mạch đơn được lắp ráp trong các cơ thể virus mới rồi được giải phóng khỏi tế bào mà không phá hủy tế bào đó. Một tế bào vi khuẩn giải phóng khoảng 1000 phage trong một vòng đời của nó. Sự xâm nhiễm của thực khuẩn thể M13 không gây chết tế bào. Tế bào E.coli không bị phá hủy nhưng chúng phát triển chậm lại do phải gánh vác việc tổng hợp các bộ phận của phage. M13 nguyên thủy của quá trình sao chép (gọi là f1 ori) chứa 2 chuỗi DNA riêng biệt xếp chồng lên nhau có nhiệm vụ kiểm sóat quá trình sinh tổng hợp DNA. Hai vị trí – f1 initiator (khởi đầu) và f1- terminator (kết thúc) là dấu hiệu nhận biết sự bắt đầu và kết thúc sinh tổng hợp DNA. Vị trí khởi đầu được nhận biết bởi protein tổng hợp từ gene 2 – nằm trên mạch + trong RF DNA. Ở vị trí này, vòng DNA bắt đầu sao chép theo một chiều nhất định và kết thúc ở vị trí f1 terminator cũng được nhận biết bởi protein mã hóa bởi gene 2. Sự chuyển đổi giữa dạng mạch đôi RP và mạch đơn (+) của hệ gene của M13 làm nảy ra ý tưởng ứng dụng chúng làm vector. Chúng ta sẽ theo dõi ở chương sau, DNA mạch đơn tổng hợp từ phage rất thuận tiện trong kĩ thuật chuyển gene đột biến invitro (chương 7) và DNA sequencing (chương 8). Khác với λ, M13 không có “ vùng không cần thiết” có thể bị hủy trước khi gắn DNA ngoại lai. Nhưng lại có vùng intergenic (vùng hoạt động) giữa vùng khởi đầu của quá trình lặp và gene 2( hình 3.15) trong đó đoạn DNA ngoại lai được chèn vào. Vector M13 được phát triển cuối thập niên 70 khi gene lacZ (mã hóa α- peptide của β-galacttosidase ) được chèn vào hệ gene M13 102

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.