Giáo trình thực tập vi sinh vật đại cương

Chia sẻ: Tạ Tiến Đạt | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:0

Thêm vào BST

Báo xấu

482
lượt xem 77
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

các nhà vi sinh vật học làm việc chủ yếu với các giống vi sinh vật thuần khiết. Đó là các thế hệ sinh ra từ những tế bào riêng. trong không khí trên bề mặt các đồ vật trong phòng thí nghiệm ngay cả trên quần áo chân tay...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình thực tập vi sinh vật đại cương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ******* Bài giảng thực tập MÔN VI SINH VẬT ĐẠI CƯƠNG Giảng viên: TS. Nguyễn Thị Thanh Thuỷ Hà nội, 2009
BÀI 1: YÊU CẦU ĐỐI VỚI CÔNG VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VSV CÁCH SỬ DỤNG MÁY MÓC – CÁCH BAO GÓI DỤNG CỤ THUỶ TINH Các nhà vi sinh vật học làm việc chủ yếu với các giống vi sinh vật thuần khiết. Đó là các thế hệ sinh ra từ những tế bào riêng biệt. Trong không khí, trên bề mặt các đồ vật trong phòng thí nghiệm, ngay cả trên quần áo, chân tay… đều luôn có một lượng rất lớn các loại vi sinh vật, do vậy cần phải quan tâm tới việc giữ thuần khiết các giống vi sinh vật dùng trong nghiên cứu. Khi làm việc trong phòng thí nghiệm vi sinh vật học, cần phải tuân chỉ nghiêm ngặt các qui tắc nhất định YÊU CẦU ĐỐI VỚI PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC Phòng luôn phải được giữ gìn sạch sẽ. Trong thực tế, để tiêu diệt vi sinh vật trong không khí và trên bề mặt các đồ vật, ta có thể dùng các biện pháp khử trùng khác nhau. Không khí Thường được làm sạch bằng phương pháp thông gió. Phải thông gió liên tục trong 30-60 phút. Thông gió sẽ làm thấp rõ rệt số lượng vi sinh vật trong không khí, nhất là khi có chênh lệch về nhiệt độ giữa trong và ngoài phòng. Một cách làm sạch không khí khác có hiệu quả hơn và thường được sử dụng hơn, đó là việc chiếu bằng tia tử ngoại. Loại tia này có tác động chống vi sinh vật cao, làm chết không những các tế bào dinh dưỡng mà các bào tử của vi sinh vật nữa. Để khử trùng không khí cần chiếu tia tử ngoại từ 30 phút đến vài giờ tùy theo mức độ nhiễm bẩn của không khí. Chú ý: tránh không để các tia tử ngoại chiếu trực tiếp hoặc chiếu phản xạ lên mắt. Trong các phòng nhỏ, không nên ở trong đó khi đang bật đèn tử ngoại. Sàn nhà, tường và bàn ghế Được làm sạch bằng máy hút bụi, lau chùi bằng một số hoá chất khử trùng (dung dịch nước cloramin 0,5-3%) Làm vệ sinh trước và cả sau khi làm thí nghiệm Trên bàn làm việc không để các vật dụng không cần thiết. Phải có nhãn ghi trên tất cả các lọ hoá chất, các lọ dung dịch đã pha chế và phải đặt ở chỗ xác định Trong phòng thí nghiệm phải mặc áo blouse khi làm việc, không được phép ăn, uống, hút thuốc lá. NGUYÊN TẮC LÀM VIỆC VỚI CÁC GIỐNG VI SINH VẬT Trong điều kiện phòng thí nghiệm, vi sinh vật được nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng (đặc hoặc lỏng đựng trong các ống nghiệm, đĩa Petri hoặc các bình thuỷ tinh. Dụng cụ thuỷ tinh và môi trường dinh dưỡng đều đã được khử trùng trước. Cấy là công việc đưa các tế bào vi sinh vật vào các môi trường đã được khử trùng. Khi cấy (hoặc cấy chuyển) phải tiến hành theo những qui tắc xác định, đảm bảo giữ cho các giống nghiên cứu khỏi bị nhiễm vi sinh vật ở môi trường xung quanh 2 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
Trước khi cấy: ghi lên ống nghiệm (đĩa Petri hoặc bình thuỷ tinh) tên giống, tên môi trường, ngày nuôi cấy. Có thể viết bằng bút viết kính hoặc viết lên các nhãn giấy rồi dán vào dụng cụ Trong khi cấy: Khi lấy tế bào vi sinh vật trong môi trường đặc để cấy hoặc làm tiêu bản, người ta sử dụng các que cấy đầu tròn hoặc đầu nhọn. Để lấy các tế bào vi sinh vật trong môi trường lỏng, người ta thường dùng các pipet đã khử trùng. Cách tiến hành Khử trùng đầu que cấy trước khi lấy tế bào vi sinh vật. Hơ nóng đỏ đầu que cấy và làm nóng cả phần cán. Đưa que cấy đã khử trùng vào các dụng cụ chứa vi sinh vật. Để tránh làm chết vi sinh vật, trước hết phải áp que cấy vào mặt trong của các dụng cụ thuỷ tinh hoặc vào phần môi trường chứa vi sinh vật cho nguội rồi mới dùng để lấy một lượng nhỏ sinh khối vi sinh vật. Các thao tác đều được thực hiện bên cạnh ngọn lửa (không phải bên trên ngọn lửa) và phải tiến hành thật nhanh để tránh nhiễm các VSV ở môi trường xung quanh. Việc cấy vi sinh vật vào các môi trường vô trùng tốt nhất là được thực hiện trong phòng vô trùng Sau khi cấy Các tế bào vi sinh vật còn lại ở đầu que cấy sau khi cấy hoặc làm tiêu bản được đốt cháy trên ngọn lửa. Phải đốt từ phần dây kim loại sát với đầu que cấy để làm cho các tế bào vi sinh vật còn lại bị khô đi và không tạo thành khí dung (aerosol) làm nhiễm bẩn không khí, sau đó đặt thẳng đứng và nung đỏ đầu que cấy. Đối với hình thức lấy mẫu, cấy bằng pipet vô trùng, sau khi tiến hành xong, pipet phải được nhanh chóng ngâm vào các dung dịch khử trùng (dung dịch cloramin 0,5- 3% hay dung dịch phenol 3-5%) Sau khi cấy phải đặt ống nghiệm (hoặc các dụng cụ khác có nuôi cấy vi sinh vật) vào các tủ định ôn (thermostab) Đối với các dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật đã dùng xong, cần phải khử trùng bằng nồi hấp áp lực (autoclave) rồi mới đem đi rửa. Phải đổ lên bề mặt các môi trường đặc đã dùng xong một lớp dung dịch khử trùng, để trong 1 ngày, sau đó mới đổ và cọ rửa. Xử lý không cẩn thận các dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật sẽ có thể dẫn đến hiện tượng khí dung vi khuẩn (baterial aerosol) NGUYÊN TẮC GHI CHÉP THÍ NGHIỆM Sổ ghi chép các công việc thí nghiệm là tài liệu cho phép kiểm tra sự chính xác của các kết quả thu được. Phải ghi chép cẩn thận, rõ ràng theo một trật tự xác định. -Tên thí nghiệm, ngày bắt đầu và ngày kết thúc - Đối tượng nghiên cứu - Những điều kiện tiến hành thí nghiệm - Nguyên tắc cơ bản của phương pháp phân tích đã sử dụng - Những kết quả thu nhận được 3 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
Chú ý - Phải ghi chép tỉ mỉ các kết quả thu được, các số liệu phải ghi thành từng bảng, nếu cần thiết phải vẽ biểu đồ, đồ thị - Có quan sát, nhận xét, kết luận của bản thân - Không ghi chép vào các mảnh giấy rời CÁCH SỬ DỤNG MỘT SỐ MÁY MÓC Trong phòng thí nghiệm có một số loại máy móc thường xuyên được sử dụng, vì vậy cần phải nắm vững cách vận hành và bảo dưỡng các máy móc đó 1.NỒI ẤP ÁP LỰC (AUTOCLAVE) Nguyên lý Phương pháp sử dụng nồi hấp áp lực dựa trên nguyên tắc làm gia nhiệt các vật bằng hơi nước bão hoà dưới áp suất lớn hơn áp suất khí quyển. Khi áp suất tăng, nhiệt độ cũng tăng theo (bảng) Bảng. Nhiệt độ hơi nước bão hoà ở các áp suất khác nhau Nhiệt độ (oC) Áp suất (atm) Bình thường Cao (áp suất bổ sung) 1,0 - 100 1,0 0,5 112 1,0 1,0 121 1,0 1,5 128 1,0 2,0 134 Tác dụng phối hợp giữa nhiệt độ cao và áp suất đảm bảo cho việc khử trùng thực hiện được tốt. Khi hấp, áp lực sẽ tiêu diệt cả tế bào & sinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật Chú ý: khi ghi chế độ khử trùng bằng các đơn vị áp suất 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 atm… có nghĩa là nói đến áp suất bổ sung. Cấu tạo Nồi hấp thường có các cấu trúc khác nhau nhưng cấu tạo về mặt nguyên lý của bất kỳ nồi hấp áp lực nào cũng là như nhau. Cách sử dụng - Đổ nước vào nồi hấp với lượng thích hợp (đến vạch chuẩn trên ống thuỷ tinh đặt dưới phễu rót nước). Nước phải đủ, không nên đổ quá vì khi sôi nước có thể lọt vào ống dẫn đến áp kế và làm sai lạc chỉ số áp. Nếu đổ ít, hiệu quả khử trùng kém, có thể gây cháy nồi. Tốt nhất nên dùng nước cất cho vào nồi hấp vì nó sẽ không tạo ra canxi. - Các đồ dùng phải bao gói kỹ rồi mới xếp vào nồi hấp. Đồ nặng ở trên. Không nên xếp dụng cụ quá sát nhau để hơi nước có thể di chuyển dễ dàng - Các môi trường đem khử trùng được rót không quá nửa chiều cao của dụng cụ chứa chúng. Các dụng cụ có môi trường được đậy bằng nút bông để ngăn cản các vi 4 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
sinh vật trong không khí nhiễm vào môi trường. Tuy nhiên nút cũng không nên quá chặt, gây ảnh hưởng tới sự cung cấp không khí cho giống nuôi cấy - Đật nắp nồi hấp, vặn chặt khoá, đóng van thông hơi. - Đun nóng (có thể bằng điện hoằng bằng hơi đốt) khi kim áp kế chỉ đến vạch 0,5atm thì mở van thông hơi để loại hết không khí có sẵn trong nồi hấp ra. Do trong cùng một áp suất, nhiệt độ của hơi nước đơn thuần sẽ cao hơn nhiệt độ của hỗn hợp giữa hơi nước và không khí, như vậy tác dụng khử trùng của hơi nước đơn thuần lên tế bào vi sinh vật sẽ mạnh lên rất nhiều - Khi kim áp kế trở về 0, đóng van thông hơi, áp suất sẽ tăng dần tới mức cần thiết. Lúc đó chỉ cần điều chỉnh nguồn nhiệt để duy trì trạng thái này theo thời gian đã định trước (Hiện nay, trong phần lớn các phòng thí nghiệm, các nồi hấp áp lực đã được trang bị đầy đủ thiết bị chỉnh nhiệt độ, áp lực và thời gian..) - Khi đã đủ thời gian khử trùng, đợi áp suất trong nồi hạ dần tới vạch số 0, mở van thông hơi xả hết khí. Vặn ốc, mở nắp, lấy các đồ dùng đã được khử trùng ra. 2.TỦ ĐỊNH ÔN (THERMOSTAB) Đây là thiết bị quan trọng trong nuôi cấy vi sinh vật. Nhiệt độ trong tủ có thể thay đổi từ 0-60oC. Nhiệt độ khi đã được xác định sẽ được duy trì ổn định trong suốt thời gian nuôi cấy. Cấu tạo Bao gồm 2 lớp: - Lớp trong là lớp kim loại dẫn nhiệt và giữ nhiệt độ bên trong của tủ - Lớp ngoài là lớp kim loại dầy hơn và bao bọc bên trong một lớp cách nhiệt Giữa lớp trong và lớp ngoài thường là khoảng rỗng giữ cho nhiệt độ ít biến đổi Trong tủ có mắc bộ phận cảm ứng nhiệt để báo nhiệt độ lên xuỗng cho rơle hoạt động Phía mặt ngoài của tủ có các núm điều chỉnh nhiệt độ Các điểm cần chú ý khi sử dụng - Phải xem điện thế của máy với nơi đặt máy có giống nhau không. Nếu khác nhau phải dùng biến thế điện - Khi dùng lần đầu phải xem bộ phận điều chỉnh nhiệt có làm việc tốt không, nhhiệt độ trong tủ có ổn định không - Cửa tủ luôn đóng kín trừ khi lấy hoặc cho nguyên liệu vào nuôi cấy - Luôn dảm bảo sạch sẽ, khô ráo trong tủ. Cho máy chạy thường xuyên nhất là những ngày trời ẩm 5 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
3. TỦ SẤY Nguyên lý Đây là phương pháp dùng để khử trùng các dụng cụ thuỷ tinh bằng không khí nóng. Công việc này được thực hiện trong tủ sấy ở nhhiệt độ 165-180oC trong vòng 2 giờ. Khi đó có thể tiêu diệt cả tế bào sinh dưỡng và bào tử của vi sinh vật Cấu tạo Tủ sấy có cấu tạo bởi các vật liệu chịu nhiệt, thường bằng kim loại hoặc amiăng. Trong tủ có các ngăn, phía trên có lỗ để cắm nhiệt kế sao cho bầu thuỷ ngân của nhiệt kế phải đặt ở bên trong tủ, cách thành trên của từ 6-8cm. Không nên đặt sát thành tủ vì nhiệt độ ở đó thường cao hơn nhiệt so với trong tủ. Việc duy trì nhiệt độ cần thiết được thực hiện nhờ thiết bị điều hoà nhiệt (thermoregulator) Cách sử dụng - Các dụng cụ đã chuẩn bị tốt được đưa vào tử sấy. Không nên xếp quá khít nhau để không khí có thể lưu thông và làm nóng đều các vật cần khử trùng. - Đóng kín cửa tủ và các lỗ không khí, bật công tắc điện. Khi nhiệt độ lên tới 165- 180oC thì duy trì nhiệt độ này trong vòng 2 giờ Chú ý: nếu nhiệt độ xuống thấp thì tác dụng khử trùng không còn, nếu nhiệt độ quá cao, lớn hơn 180oC sẽ gây cháy giấy. - Khử trùng xong, tắt công tắc điện nhưng không được mở cửa tủ trước khi nhiệt độ hạ xuống dưới 80oC, nếu không sẽ gây nứt và làm ảnh hưởng đến tính vô trùng của các dụng cụ. CÁCH XỬ LÝ DỤNG CỤ THỦY TINH Đối với dụng cụ thuỷ tinh mới, dụng cụ thuỷ tinh trước và sau khi làm thí nghiệm, cần chú ý hai nhiệm vụ chính là trung tính và rửa các dụng cụ này. Phương pháp trung tính dụng cụ thuỷ tinh Phương pháp này được sử dụng nhằm tránh sự thay đổi pH gây ra từ các dụng cụ chứa vào trong môi trường nuôi cấy Phương pháp thử: lấy nước trung tính (pH=7) cho vào trong dụng cụ thuỷ tinh, đem hấp ở nhiệt độ cao khoảng 30’ -> 1 giờ. Lấy ra, để nguội, thử pH. Nếu pH>7, ngâm dụng cụ này vào dung dịch HCl 2% trong 10giờ. Sau khi thử lại thấy chưa trung tính thì tiến hành ngâm tiếp. Nói chung dụng cụ thuỷ tinh đều kiềm Rửa các dụng cụ thuỷ tinh Dụng cụ mới Dùng chổi lông sát xà phòng rửa sạch trong, ngoài dụng cụ, rửa xong để dốc ngược cho khô nước Dụng cụ sau khi dùng Ống nghiệm: Dùng xong qua khử trùng trong nồi hấp áp lực hay ngâm trong dung dịch lyzol 2% trong 24 h 6 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
Đổ các vật phẩm trong ống nghiệm ra, dùng xà phòng rửa sạch trong, ngoài ống. Tráng sạch, để ráo. Nếu bằng cách trên chưa sạch thì có thể ngâm vào dung dịch KMnO4 0,2% trong một đêm, vớt ra, dùng dung dịch HCl 0,2% để tẩy thuốc tím. Sau đó rửa sạch như trên Một số dung dịch có thể dùng để rửa (ngâm trong 24h) NaOH 4% ; HCl 0,2% ; HNO3 20% ; Na3PO4 5% ;H2SO4 20% - Pipette: dùng xong ngâm trong dung dịch fenol 5%, sau đó ngâm vào dung dịch NaOH 0,4% - Đĩa Petri: dùng vải xát xà phòng rửa bên trong và các góc quanh đĩa, úp sấp đĩa, cọ sát bên ngoài. Rửa bằng nước sạch nhiều lần, để ráo. - Chai lọ: Trước khi rửa, đổ hết các chất còn lại trong chai, lọ ra. Ngâm nước 1-2 ngày. Dùng dung dịch xà phòng đặc rửa sạch, xúc rửa bên trong nhiều lần, xúc rửa lại với dung dịch HCl 0,2%. Tráng sạch, để ráo. - Đối với các lọ đựng thuốc nhuộm, cần ngâm trong dung dịch HCl hay cồn, sau đó dùng nước rửa sạch. - Phiến kính: Nếu phiến kính có dầu, trước khi rửa phải lau sạch, ngâm phiến kính vào dung dịch credin 2% hoặc dung dịch fenol 5%. Có thể ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1% hay dung dịch lyzol 5%. Đun trong nước xà phòng 5 phút. Rửa sạch, để khô. Có thể giữ phiến kính trong cồn, khi dùng lấy ra lau khô, hơ lên lửa. Như vậy tránh được bụi, phiến kính sẽ sạch hơn. BAO GÓI DỤNG CỤ THỦY TINH Các dụng cụ thuỷ tinh chiếm một phần lớn trong các dụng cụ phòng thực tập vi sinh vật học. Việc xử lý và bao gói các dụng cụ này có liên quan trực tiếp tới kết quả tiến hành. Dụng cụ phải được lựa chọn đúng qui cách, đảm bảo chất lượng, phải được xử lý tốt, không có vết bẩn và không chứa tạp chất. Bao gói phải đạt tiêu chuẩn khi khử trùng và thuận tiện khi sử dụng. Trước khi hấp khử trùng dụng cụ, vật liệu, cần phải tiến hành bao goí kỹ càng và đúng kỹ thuật để thuận tiện cho công việc khử trùng, tránh hiện tượng nứt vỡ hay bị tạp nhiễm sau khi hấp Cách làm nút bông Làm bằng bông không thấm nước (bông mỡ) loại sợi dài. Cắt bông thành miếng nhỏ hình vuông 7-8cm. Tuỳ theo đường kính miệng ống nhỏ hay to mà ta có thể thay đổi kích thước của miếng bông cho phù hợp Chú ý - Nút bông cho ống nghiệm không dài quá 4 cm - Không làm nút bông quá chặt gây vỡ ống nghiệm - Không làm nút bông quá lỏng vì dễ bị nhiễm tạp - Làm nút bông cho các bình lớn phải bọc thêm vải thưa hoặc gạc ở ngoài 7 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
Làm nút ống hút Mục đích: ngăn ngừa các chất từ môi trường nuôi cấy vào trong miệng và tránh nhiễm tạp từ miệng vào môi trường Cách làm Dùng que nhỏ cho vào miệng ống hút 1 chút bông (cách miệng 1-2cm) Chú ý: Không làm nút chặt quá vì sẽ khó hút các chất Không làm nút lỏng vì nút bông có thể di động lên, xuống Bao gói dụng cụ Sau khi đã làm nút, các dụng cụ phải được bao gói quy cách để đem hấp - Đối với ống nghiệm đựng môi trường đã có nút bông, cần dùng giấy bọc chặt phía đầu nút bông lại - Chai lọ cũng được bọc chặt phần nút bằng giấy - Pipet được gói bắt đầu từ phía đầu nhỏ giọt, cuộn giấy dần theo kiểu xoáy trôn ốc cho tới hết ở phía đầu có nút bông. Các pipet có thể được gói từ 1 tới vài chiếc - Các đĩa Petri được gói thành chồng, mỗi chồng từ 3-5 chiếc - Các dụng cụ khác, tuỳ theo yêu cầu mà có sự bao gói cho thích hợp. Nếu hấp ở nồi hấp áp lực thì không được bao gói bằng giấy thấm nước mà phải dùng loại giấy dai, không thấm nước. Các dụng cụ bao gói phải thật khô, sạch, tránh vỡ trong khi hấp. Dụng cụ bao gói xong phải dán nhãn, đề ngày đem hấp để tiện việc theo dõi, sử dụng Nội dung đạt được Quan sát và biết cách sử dụng máy móc như: tủ định ôn, nồi hấp áp lực, tủ sấy. Thực tập các xử lý làm nút bông và bao gói các dụng cụ thuỷ tinh, tiến hành sấy và hấp khử trùng các dụng cụ trên Chuẩn bị dụng cụ và hoá chất Máy móc - Dụng cụ: Tủ định ôn Tủ sấy Nồi hấp áp lực Dụng cụ thuỷ tinh Chổi rửa các dụng cụ thuỷ tinh Đũa tre, vải bông Dụng cụ ngâm đồ thuỷ tinh Giá gỗ, giỏ lưới Chậu rửa Hoá chất Xà phòng Dung dịch kiềm Dung dịch axit HCl 0,2%; H2SO4 20%, Fenol 5%; HNO3 Dung dịch chất oxy hoá: KmnO4 0,2%; K2Cr2O7 10% Dung dịch chất sát trùng: lyzol 2%; credin 2% 8 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
BÀI 2 - PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI, CÁCH LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT Việc nghiên cứu, cấu tạo các tế bào vi sinh vật hết sức nhỏ bé chỉ có thể thực hiện được nhờ sự giúp đó của các kính hiển vi. Hiện nay, người ta đã sáng chế ra nhiều loại kính hiển vi khác nhau nhằm mục đích nghiên cứu rõ và sâu hơn về vi sinh vật. Tuy nhiên ở đây chúng ta chỉ nghiên cứu sử dụng loại kính hiển vi quang học – loại kính được sử dụng ở hầu hết các lĩnh vực có liên quan đến vi sinh vật. Để quan sát vi sinh vật dưới kính hiển vi quang học, cần làm tiêu bản các tế bào sống (tiêu bản tươi) và tiêu bản các tế bào đã được cố định (chết) Mục đích – yêu cầu - Nắm vững cấu tạo của kính hiển vi, hiểu rõ nguyên tắc và phương pháp sử dụng - Sử dụng thành thạo kính hiển vi để quan sát hình thái và cấu tạo của vi sinh vật - Thực hiện tốt các biện pháp, yêu cầu bảo vệ kính hiển vi trước và sau khi sử dụng - Học các làm tiêu bản tế bào vi sinh vật sống, tiêu bản cố định và nhuộm màu - Làm quen với hình thái học của các đại diện thuộc nhóm vi sinh vật khác nhau A. KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC VÀ CÁCH SỬ DỤNG Kính hiển vi bao gồm ba bộ phận chính sau đây: Bộ phận cơ giới Chân kính: Dùng để đỡ kính hiển vi Khay kính: Nơi đặt tiêu bản để quan sát. ở giữa có một lỗ hổng để ánh sáng có thể đi qua. Trên khay có kẹp để giữ tiêu bản. Khay kính có thể được cố định hoặc đi động theo các chiều là nhờ có ốc cố định và ốc chuyển dịch nằm ở mép dưới khay kính. Trụ mang ống kính: là bộ phận dùng để đặt ống kính. Trụ kính có bộ đầu (đầu trụ) để gắn ống kính và bàn xoay Ống kính: là ống kim loại hình trụ, phía trên gắn thị kính, phía dưới gắn bàn xoay có gắn các vật kính. Phần trên ống kính có thể là một ống gắn thị kính hoặc có thẻ là hai ống gắn thị kính. Phần này có thể quay được theo các hướng nhờ vít hãm Ốc điều chỉnh: gồm ốc vĩ cấp và ốc vi cấp. Các ốc này thực chất là điều chỉnh khoảng cách giữa tiêu bản và đầu vật kính. Bộ phận quang học Vật kính: Vật kính là hệ thống quang học gồm nhiều thấu kính ghép lại với nhau. Bộ phận quan trọng nhất quyết định tính năng của kính hiển vi (tính năng tạo ảnh thật của tiêu bản) Mỗi kính hiển vi tuỳ theo thiết kế : Vật kính bội số thấp, trung bình và cao. Vật kính có bội số thấp là các vật kính 8X; 10X; 20X; vật kính có bội số cao trung bình là 40X; 60X; hoặc 65X; vật kính có bội số cao là 90X hoặc 100X (còn gọi là vật kính 9 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
đầu, ở đầu có một vòng đen để phân biệt với vật kính khác) vạt kính có bội số thấp thường được dùng để xem tươi, còn vật kính dầu thường để xem tiêu bản nhuộm Thị kính: cấu tạo gồm hai thấu kính ghép lại. Thị kính không có năng lực tạo ảnh như vật kính mà chủ yếu chức năng của nó là phóng đại ảnh do vật kính thu được. Thông thường thị kính có độ phóng đại: 7X; 10X; 15X và 20X (hoặc 12X, 16X…) Độ phóng đại tiêu bản quan sát sẽ là tích số của độ phóng đại thị kính với độ phóng đại của vật kính đem sử dụng Ví dụ: nếu dùng vật kính dầu có độ phóng đại 90X và thị kính có độ phóng đại 15X để quan sát tiêu bản thì tiêu bản đã được phóng đại lên: 90x15 = 1350 lần Bộ phận tập trung ánh sáng Gương phản chiếu: Đặt dưới khay kính gồm hai mặt lõm và lồi Tụ quang kính: đặt dưới khay kính dùng để tập trung ánh sáng từ gương phản chiếu vào tiêu bản. Tụ quang kính do một hoặc nhiều thấu kính tạo nên sự tập trung ánh sáng. Dưới hệ thống thấu kính là bộ phận chắn sáng. Tụ quang kính có thể di động lên xuống nhờ có ốc điều khiển làm chuyển dịch bản lề gần tụ quang. CÁCH SỬ DỤNG Tư thế kính: Đặt kính trên bàn ngay ngắn, ở tư thế có lợi nhất cho người quan sát. Khi quan sát người ta thường dùng mắt trái còn mắt phải để ghi chép Nguồn sáng Có thể sử dụng hai nguồn sáng là nguồn sáng tự nhiên và nguồn sáng nhân tạo (ánh sáng đèn) Sử dụng nguồn sáng tự nhiên thường là ánh sáng tán xạ (ánh sáng gián tiếp). Tránh dùng ánh sáng chiếu trực tiếp vì có hại cho mắt và ánh sáng không được rõ. Sử dụng nguồn sáng nhân tạo, thường người ta dùng ánh sáng của đèn điện và ánh sáng của đèn dầu, đèn đất, nến….Cần dùng những phiến kính lọc màu đặt ở tụ quang kính để tránh sự ảnh hưởng của tia sáng màu vàng hoặc màu nâu đến màu sắc thật của ảnh. Trường hợp ánh sáng mạnh còn sử dụng kính mờ màu trắng để giảm bớt cường độ ánh sáng và làm cho ánh sáng đều Cách lấy ánh sáng Hiệu quả quan sát tiêu bản có quan hệ rất lớn đến cách sử dụng ánh sáng. Sử dụng tốt ánh sáng có quan hệ đến ba yếu tố là cách sử dụng nguồn sáng, sử dụng gương phản chiếu và kính tụ quang Đối với kính hiển vi có bố trí kính tụ quang. Trong trường hợp thông thường: dùng mặt phẳng gương phản chiếu để bảo đảm phát huy tính năng tạo ảnh của kính. Trong trường hợp ánh sáng không đủ có thể dùng kính lõm. Đối với kính hiển vi không có bố trí kính tụ quang thì nói chúng đều dùng mặt lõm của gương phản chiếu Sử dụng kính tụ quang cần nắm được các điểm sau đây: khi quan sát với vật kính bội số táp thường ít mở bộ phận chắn sáng, và hạ thấp đến mức gần như thấp nhất 10 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
kính tụ quang. Khi dùng vật kính có bội số cao hơn thì kính tụ quang cũng được nâng dần lên đến mức cần thiết để đạt được độ chiếu sáng tốt, ảnh rõ. Dùng với vật kính dầu (bội số cao) cần thiết phải nâng kính tụ quang lên mức tối đa và có thể mở hoàn toàn bộ phận chắn sáng. Xác định tiêu điểm và quan sát Khi xem tươi chỉ cần hạ thấp ống kính gần sát xuống tiêu bản, sau đó vặn ốc vĩ cấp nâng từ từ ống kính lên, đồng thời quan sát trong kính, nếu thấy chớp ảnh thì dùng ốc vi cấp để điều chỉnh cho rõ ảnh của tiêu bản. Khi xem tiêu bản nhuộm với vật kính dầu thì đầu tiên phải xác định tiêu điểm với vật kính bội số thấp nhất. Sau đó nhỏ một giọt dầu bạch dương (cedre) rất nhỏ vào vị trí đã được xác định không làm lan rộng ra. Do vật kính dầu có độ phóng đại lớn, đường kính thấu kính nhỏ vì vậy khi không cho dầu thì chỉ có một phần nhỏ ánh sáng lọt vào thấu kính, ảnh vào sẽ không được rõ, dầu bạch dương có chiết suất xấp xỉ chiết xuất thuỷ tinh cho nên ánh sáng đi qua tiêu bản để vào vật kính là một môi trường gần như đồng nhất nên di thẳng mà không bị khúc xạ vì vậy lượng ánh sáng vào nhiều, ảnh rõ. Xoay vật kính dầu cho sát xuống tiêu bản cho đầu vật kính ngập trong dầu. Khi thấy có chớp ảnh thì vặn ốc vi cấp từ từ để thấy rõ ảnh tiêu bản. CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI Lấy kính hiển vi trong hộp ra nên dùng tay phải, nắm chắc trụ kính kéo kính ra theo hướng nằm ngang không để đụng vào thành hộp; sau đó dùng tay trái đỡ chân kính để mang đi. Nếu mang đi xa thì phải cố định chắc chắn để tránh bị hỏng kính do bị lắc mạnh Không được sờ tay vào các đầu của vật kính và thị kính. Nếu phát hiện thấy vật kính, thị kính bị bụi bẩn thì phải dùng giấy riêng để lau kính hay khăn lụa để lau, khi lau phải nhẹ nhàng Khi dùng xong, nếu sử dụng vật kính dầu thì trước hết phải dùng giấy mềm hoặc vải lụa để lau nhẹ cho sạch dầu, sau đó lau lại bằng xylen hoặc benzen cho hết dầu ở đầu vật kính. Xoay các bộ phận của kính về đúng chỗ qui định Không được để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp vào kính. Không được tháo lắp các bộ phận của kính, không tự ý cho dầu vào các bộ phận cơ giới của kính Phải để nơi khô ráo thoáng, không nóng, ít bụi bẩn. B. PHƯƠNG PHÁP LÀM VÀ NHUỘM CÁC TIÊU BẢN PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN TƯƠI KHÔNG NHUỘM Tiêu bản “giọt ép” Tiêu bản “giọt ép” được dùng để xác định hình thái, kích thước, xếp và phương thức sinh bào tử của các tế bào vi sinh vật Cách làm: Dùng một phiên kính (lame) khô, sạch, lấy một giọt nước vô trùng đặt lên giữa phiên kính. Sau đó dùng que cấy vô trùng thêm vào đó một ít tế bào vi sinh vật hay 11 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
vật liệu cần nghiên cứu (nước dưa, sữa ….), trộn đều Dùng một lá kính (lamella) đậy lên giọt dung dịch vi sinh vật trên. (hình) Chú ý: Tránh đậy nhanh, mạnh vì có thể gây nên các bọt khí và làm cho giọt dịch bắn lung tung ra ngoài. Tiêu bản “giọt treo”: Được dùng để quan sát sự sinh sản của vi sinh vật, sự hình thành và nảy mầm của bào tử, phát hiện khả năng di động và mối quan hệ của các tế bào vi sinh vật với kích thích hoá học Cách làm: Dùng que cấy đầu tròn lấy một giọt dịch huyền phù vi sinh vật đặt lên trên 1 lá kính sạch và khô Bôi một lớp vazơlin mỏng quanh chỗ lõm trên phiến kính để có thể gắn chặt lá kính bên trên, tránh khô dịch quan sát Quay ngược lá kính xuống phía dưới và đặt lên trên một phiến kính lõm sao cho giọt dịch nằm đúng trong chỗ lõm Tiêu bản vết: Dùng để nghiên cứu sự phân bố tự nhiên của các tế bào trong khuẩn lạc vi sinh vật, hình thái bào tử & cuống sinh bào tử ở xạ khuẩn, nấm mốc. Cách làm: Cách 1: dùng lá kính ép nhẹ lên trên một đám vi sinh vật mộc dày đặc hay phía trên một khuẩn lạc riêng rẽ. Đặt tiêu bản đã nhận được lên một phiến kính đã có sẵn một giọt nước hay một giọt dung dịch xanh metylen 1/40 Cách 2: có thể dùng ngay phiến kính ép nhẹ lên bề mặt của vi sinh vật hoặc bề mặt của khuẩn lạc. Lấy ra làm tiêu bản “vết” PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN NHUỘM Mục đích: có thể quan sát một các rõ ràng hơn hoạt động sống của tế bào vi sinh vật Cách làm: giống như tiêu bản “giọt treo” hoặc “giọt ép”, nhưng cho thêm dung dịch thuốc nhuộm xanh metylen …% PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH VÀ NHUỘM MÀU TIÊU BẢN. Cố định và nhuộm màu tiêu bản dùng để quan sát kỹ các phần cấu trúc của tế bào. Những tiêu bản này có tác dụng bảo tồn tiêu bản của một loại hình vi sinh vật nào đó cho các nghiên cứu về sau. Việc chuẩn bị tiêu bản gồm các bước: chuẩn bị vết bôi, làm khô, cố định và nhuộm màu (hình) Chuẩn bị vết bôi: Đặt vật liệu nghiên cứu lên một phiến kính sạch theo kiểu làm giọt ép, dùng que cấy dàn đều vật liệu trên diện tích 1-2cm2 12 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
Làm khô vết bôi: Tiêu bản được làm khô trong không khí, nếu khô chậm có thể hơ phiên kính lên phía trên cao của ngọn lửa đèn cồn. Tránh làm quà nóng vết bôi vì nếu như vậy vi sinh vật sẽ bị biến dạng. Cố định: Mục đích - Gắn các tế bào vi sinh vật lên trên phiến kính - Tránh bị rửa trôi - Làm cho vết bôi dễ bắt thuốc nhuộm do các tế bào chết dễ nhuộm màu hơn các tế bào sống, an toàn sử dụng vết bôi hơn, nhất là khi sử dụng các vi sinh vật gây bệnh. Nhuộm màu: - Người ta chia loại thuốc nhuộm thành hai loại: thuốc nhuộm axit và thuốc nhuộm bazơ - Tế bào vi sinh vật được nhuộm màu chủ yếu bằng các thuốc nhuộm bazơ - Thuốc nhuộm axit gồm: eozin, eritrozin, nigrozin, fuchsin zit…, chúng liên kết chặt chẽ với cá thành phần tế bào chất (có tính bazơ) của tế bào. - Thuốc nhuôm bazơ: xanh metylen, fuchsin kiềm, tím gentian, tím kết tinh, safranin…., chúng liên kết với các thành phần chất nhân (có tính axit) của tế bào. - Người ta chia các cách nhuộm: nhuộm đơn và nhuộm phân biệt. a. Nhuộm đơn: có thể quan sát toàn bộ hình dạng và kích thước tế bào. Dùng thuốc nhuộm như: xanh metylen, fuchsin, tím getian. b. Nhuộm phân biệt: dùng để nhuộm phân biệt để nghiên cứu một số cấu trúc tế bào, đặc tính và xác định vi sinh vật Cách làm: Đối với nhuộm đơn và nhuộm phân biệt: - Đặt phiến kính đã được cố định trên giá thuỷ tinh. - Nhỏ 1-2 giọt thuốc nhuộm lên tiêu bản. - Rửa nhẹ tiêu bản bằng nước tới khi thấy nước trong. c. Nhuộm Gram (nhuộm kép) Dựa vào sự khác nhau về thành phần hoá học trong thành tế bào của tế bào vi khuẩn. Sử dụng phối hợp các loại thuốc nhuộm để phân biệt sự khác nhau đó. Cách làm (hình…) Nội dung tường trình - Làm tiêu bản tươi không nhuộm và nhuộm đối với các loài vi sinh vật trong nhóm: + Vi khuẩn (Sarcina, Staphylococcus, Bacillus subtilis, E.coli) + Nấm men: (Saccharomyces cerevisiae) + Nấm mốc (Mucor, Aspergillus, Rhizopus) - Miêu tả hình thái các loại vi khuẩn. 13 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
- Miêu tả hình thái và sự nảy chồi của nấm men. - Miêu tả hình thái cơ quan mang bào tử và bảo tử của nấm mốc - Nhuộm Gram đối với các loại vi khuẩn. Vẽ hình thái và xác định sự bắt màu của chúng Chuẩn bị dụng cụ và hoá chất Dụng cụ Kính hiển vi, dầu soi kính Que cấy tròn và nhọn Phiến kính thường và lõm, lá kính Đèn cồn. Giá và chậu thuỷ tinh Hoá chất Cồn 96o Xanh metylen axit phenic Tím gentian KI I2 Axeton Safranin Fucshin 14 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
BÀI 3 - MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VSV 1. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Khả năng tổng hợ p và cách thức thu nhận năng lượng khác nhau tuỳ thuộc vào mỗi loại vi sinh vật. Do vậy nhu cầu về các chất dinh dưỡng của chúng cũng khác nhau. Môi trường dinh dưỡng cần thiết cho việc nuôi cấy tích luỹ, phân lập, bảo quản giống cũng như nuôi cấy với mục đích nghiên cứu quá trình trao đổi chất hoặc thu nhận sản phẩm trao đổi chất có giá trị ở vi sinh vật. Môi trường dinh dưỡng cần phải chứa đựng tất cả các thành phần cần thiết đối với quá trình hình thành cấu trúc và năng lượng của tế bào. Đó là các nguồn dinh dưỡng cacbon, nitrogen, nguyên tố khoáng và nguyên tố vi lượng. Tuy nhiên môi trường này phải có các điều kiện lý, hoá phù hợp với điều kiện sống của vi sinh vật đó như: độ pH, thể oxy hoá khử, nồng độ các chất, độ thoáng khí…. A. CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG 1. Căn cứ vào thành phần, nguồn gốc các chất dinh dưỡng có trong môi trường Môi trường tự nhiên: Môi trường hình thành từ các sản phẩm có nguồn gốc động vật hoặc thực vật như: nước ép rau, quả, tổ chức mô cơ động vật, màu pha loãng, sữa, … hoặc có thể là nước chiết thu được khi chế tạo từ các cơ chất tự nhiên như thịt, phân, đất, các bộ phận của thực vật … Trên môi trường tự nhiên, nhiều loại vi sinh vật phát triển rất tốt do có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Tuy nhiên các môi trường này có thành phần hóa học phức tạp, không ổn định, không thuận lợi cho việc nghiên cứu sinh lý, trao đổi chất của vi sinh vật Các môi trường tự nhiên chủ yếu được dùng để nuôic cấy tích luỹ sinh khối hoặc để định tên vi sinh vật Môi trường tổng hợp: Môi trường được hình thành từ các hợp chất hoá học tinh khiết, được xác định và lấy với những nồng độ phù hợp. Ưu điểm: do biết rõ thành phần và số lượng thành phần đưa vào môi trường nên có thể nghiên cứu được nhu cầu cũng như sự chuyển hoá của chúng thành các sản phẩm trao đổi chất tương ứng. Nhược điểm: giá thành cao Môi trường bán tổng hợp: Thuộc loại môi trường tự nhiên có thành phần không xác định. Trong thành phần của chúng, ngoài các hợp chất đã rõ bản chất hoá học còn có cả những chất chưa biết rõ thành phần Môi trường này được sử dụng phổ biến trong vi sinh vật học công nghiệp để thu nhận các axit amin, vitamin và các sản phẩm quan trọng khác trong hoạt động sống của vi sinh vật 15 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
Căn cứ về công dụng của môi trường Phân loại thành các môi trường: môi trường chọn lọc và môi trường chuẩn đóan phân biệt Môi trường cơ sở: là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất và trên cơ sở của môi trường này có thể tạo ra các môi trường cần dùng khác. Môi trường cơ sở thường thấy nhất là môi trường nước pepton, môi trường nước thịt pepton. Môi trường chọn lọc: Môi trường đảm bảo sự phát triển ư thế của một loài hay một nhóm vi sinh vật nào đó ít thuận lợi hoặc hoàn toàn bất lợi đối với dự phát triển của các vi sinh vật khác. Các môi trường chọn lọc chủ yếu được sử dụng để phân lập vi sinh vật từ môi trường sinh sống tự nhiên của chúng hoặc dùng để nuôi cấy tích luỹ. Môi trường chuẩn đoán phân biệt (môi trường chỉ thị) Cho phép phân biệt khá nhanh loài vi sinh vật này với loài vi sinh vật khác. Thành phần của môi trường này phải tính toán, chọn lựa sao cho phát hiện được rõ ràng các đặc điểm của loài đó. Các môi trường chỉ thị được dùng trong vi khuẩn học lâm sàng, trong nghiên cứu di truyền học và định tên vi sinh vật Căn cứ vào trạng thái vật lý của môi trường Căn cứ vào trạng thái vật lý của môi trường, có thể phân biệt thành các dạng sau: Môi trường lỏng: Hợp thành do sự hoà tan các chất dinh dưỡng cần thiết ở trong nước như môi trường nước thịt, nước pepton, nước các loại củ, quả như carot, su hào, khoai tây, giá đỗ…. Môi trường này được ứng dụng để phát hiện các đặc điểm sinh lý – sinh hoá của vi sinh vật, để tích lý sinh khối hoặc các sản phẩm trao đổi chất, để giữ giống và bảo quản nhiều loại vi sinh vật không phát triển tốt trên các môi trường đặc. Môi trường bán lỏng: Được hình thành trên cơ sở của môi trường lỏng có bổ sung một số chất làm đông giúp cho môi trường đặc lại nhưng có độ đông kém. Môi trường bán lỏng dùng để theo dõi sự di động của vi khuẩn Môi trường rắn: Hình thành trên cơ sở của môi trường lỏng có bổ sung chất làm đông nhiều hơn môi trường bán lỏng nhằm tăng độ đông cứng của môi trường Môi trường này được ứng dụng để tách các giống thuần khiết, nghiên cứu định tên (xác định hình thái khuẩn lạc, đặc điểm sinh trưởng trên thạch nghiêng…), để giữ giống, để đếm số lượng vi sinh vật, để xác định tính đối kháng của vi sinh vật trong nhiều trường hợp khác nhau. Môi trường xốp: Được ứng dụng trong vi sinh vật học công nghiệp. Thuộc loại này có kê nấu nhừ, cám, cát thạch anh thấm dung dịch dinh dưỡng 16 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
B. CÁCH PHA CHẾ CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG Đối với các loại môi trường khác nhau, cách chế tạo có những quy tắc chung giống nhau. Quy trình pha chế môi trường Phối hợp và hoà tan nguyên liệu Cân chính xác các nguyên liệu trong môi trường theo lượng đã định. Cho vào dụng cụ nấu: - Nếu chế môi trường lỏng khi đun chú ý bổ sung lượng nước bốc hơi - Nếu chế môi trường rắn: cân chính xác hoá chất (từ lượng nhỏ nhất tới lượng tăng dần), xác định lượng thách cần cho. Bổ sung nước cho tới thể tích yêu cầu. Ngoáy đều. Đun trên bếp cho tan thạch. Chú ý ngoáy đều để tránh bọt khí ở phía trên và bị cháy ở phía dưới. Kiểm tra độ pH Có thể dùng máy đo pH hoặc so màu. Căn cứ vào độ pH đã được xác định, điều chỉnh độ pH của môi trường theo đúng yêu cầu nuôi cấy. Thông thường điều chỉnh độ pH của môi trường cao hơn só với yêu cầu một chút vì theo kinh nghiệm, môi trường sau khi khử trùng pH sẽ bị hạ thấp (môi trường thạch rắn khi hấp pH hạ 0,4; môi trường thạch mầm hạ 0,2; môi trường lỏng hạ 0,1 Muốn điều chỉnh pH thường dùng dung dịch HCl, NaOH, H2SO4, NaHCO3… pha với nồng độ xác định Lọc và phân phối môi trường Có thể dùng giấy lọc, vải xô, bông hoặc lọc bằng thiết bị lọc chân không Phân phối môi trường vào các dụng cụ cần làm. Chú ý lượng môi trường không vượt quá tỉ lệ cho phép so với dung tích vật chứa để tránh bị trào ra ngoài. - Khi hấp thạch nghiêng không đổ quá 1/4 dung tích ống - Khi hấp thạch ống không đổ quá 2/3 dung tích ống - Khi hấp thạch trong bình tam giác, lượng môi trường không vượt quá 2/3 dung tích bình Khử trùng Thông thường khử trung trong nồi hấp áp lực. Nhiệt độ và thời gian khử trùng tuỳ thuộc vào đặc tính của môi trường đó. Do kả năng dễ biến đổi đặc tính hoá học của môi trường khi có mặt các chất trong quá trình khử trùng, ta có thể hấp riêng rẽ một số chất, sau đó kết hợp lại với nhau trước khi dùng để nuôi cấy Một số môi trường dễ bị phá hủy ở nhiệt độ cao, có thể dùng phương pháp gián đoạn (phương pháp tyndal) để xử lý. Kiểm định Sau khi hấp khử trùng, đặt môi trường trong tủ định ôn ở nhiệt độ 300 C. Sau 24- 48h nếu không thấy vi sinh vật xuất hiện thì đạt yêu cầu Bảo quản Môi trường được kiểm định nếu chưa dùng ngay thì phi bảo quản ở nhiệt độ thấp và tránh ánh sáng giúp môi trường không bị khô, không bị oxy hoá hoặc có những biến đổi về pH, đồng thời giữ cho môi trường không bị nhiễm tạp. Chú ý: thời gian BQ không quá dài 17 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
CÁCH PHA CHẾ MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG Cách pha chế một số loại môi trường 1. Môi trường tự nhiên Môi trường canh thịt – pepton (MPB): là môi trường để nuôi cấy vi sinh dị dưỡng Cách làm: Thịt (loại bỏ xưng, mỡ, gân) xay nhỏ : 500g + 1 lít nước -> lọc lấy nước -> đun sôi - > lọc -> bổ sung nước tới mức ban đầu -> bổ sung 0.5% NaCl + 1% pepton -> khử trùng 1atm/20-30 phút Môi trường mạch nha: là môi trường tốt với các loại vi khuẩn lactic, vi khuẩn axetic, nấm men, nấm mốc và các loại vi sinh vật dị dưỡng thường dùng đường làm nguồn cacbon và nguồn nguyên liệu năng lượng Cách làm : Đại mạch nảy mầm (thóc nẩy mầm) xay nhỏ : 250g + nước : 1 lít -> đun nóng -> nâng nhiệt -> đường hoá hết tinh bột (không có phán ứng màu với thuốc thử Iod) -> lọc -> đo nồng độ dung dịch đường (độ Balling - oB) Nồng độ đường trong nước mạch nha mới thường đạt 16-18oB. Muốn có các nồng độ cần thiết, ta dùng nước sạch để pha loãng + Đối với nấm mốc, nồng độ 3-4oB + Đối với men, nồng độ 6-8oB + Đối với vi khuẩn lactic, nồng độ 8-12oB Nước mạch nha được khử trùng 0,5atm/20-30 phút Môi trường khoai tây: được sử dụng chủ yếu để phân lập và nuôi cấy các loài trong giống Clostriodium và các đại diện vi khuẩn phân giải tinh bột khác. Cách làm Khoai tây gọt vỏ, cắt nhỏ : 200 g + 1 lít nước -> đun sôi (15 phút) -> phân phối vào dụng cụ nuôi cấy -> khử trùng (1,5 atm/30 phút) -> CaCO3 môi trường nuôi cấy 2. Môi trường tổng hợp Môi trường Hansen : sử dụng để nuôi cấy nấm men Nguyên liệu (g/l) Glucose(maltose, saccharose) : 50 g Pepton : 10g KH2PO4 : 3g MgSO4 : 2-5g Thạch : 20g pH :… Cách làm Hoà tan hỗn hợp các nguyên lieuẹ trong nước, đun cho tan hết thạch, hấp khử trùng, 121oC/15 phút Môi trường Saburaud 2. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY PHÂN LẬP VI SINH VẬT Trong công tác nghiên cứu vi sinh vật: cấy, phân lập có tầm quan trọng lớn trong công tác bảo tồn giống, tạo ra những giống thuần chủng hay các giống mới 18 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
Trong môi trường mới, vi sinh vật phát triển tốt, tăng nhanh về số lượng tế bào. Tuy nhiên sau một thời gian nguồn dinh dưỡng cạn dần, sự tích luỹ sản phẩm của quá trình trao đổi chất tăng lên gây tác dụng ức chế vi sinh vật thậm chí còn thay đôỉ đặc tính hoặc gây chết tế bào. Do vậy nên cần cấy truyền sang môi trường mới Qua phân lập người ta có thể sàng lọc ra được các chủng loại vi sinh vật riêng biệt. Trên cơ sở để nhận biết và thuần chủng các giống theo yêu cầu của con người PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP Dùng phương pháp cấy trên thạch đĩa nhằm tạo ra những khuẩn lạc riêng rẽ, thuận lợi cho việc nhận xét, phân biệt hay chọn lọc các chủng vi sinh vật có trong mẫu. Phương pháp phân lập được tiến hành theo các bước sau: Lấy mẫu Tuỳ theo mẫu đem phân lập mà có cách lấy mẫu và khối lượng mẫu lấy khác nhau. Cần bảo đảm các điều kiện chung - Số lượng phải đủ để phân lập và tiến hành phân tích các chỉ tiêu khác (nếu cần) - Phải ghi chú rõ ràng thời gian và địa điểm lấy mẫu phân lập - Thời gian lấy mẫu tiến hành nhanh - Chú ý công tác vô trùng và chọn lọc mẫu có tính đại diện Xử lý mẫu Mẫu rắn: Bao gồm các mẫu đất, mẫu thức ăn bột, mẫu thịt….Cân chính xác 10g mẫu cho vào cối vô trùng nghiền kỹ, sau đó pha loãng tới 100ml bằng nước cất vô trùng. Lắc đều hút lấy 1ml dịch mẫu để làm bước pha loãng tiếp theo Mẫu lỏng: không cần xử lý trước, chỉ cần hút lấy 1ml dịch mẫu để pha loãng Phương pháp pha loãng mẫu và cấy Chuẩn bị dãy ống nghiệm chứa 9ml nước vô trùng hoặc dung dịch NaCl 9% vô trùng, số lượng ống tuỳ theo sự ước đoán số vi sinh vật trong mẫu nhiều hay ít. Cách làm (hình) Chú ý: khi chuyển chuyển sang nồng độ mới, cần thay pipet Cấy trên môi trường thạch đĩa: các môi trường này đã được chuẩn bị và kiểm nghiệm từ bài trước. Cấy từ các độ pha loãng nào đó phụ thuộc vào số lượng vi sinh vật có trong. Dùng pipet vô trùng lấy một thể tích nhất định (thường là 0,05; 0,1; 0,2 ml) ở các dịch có độ pha loãng tương ứng, cấy lên bề mặt thạch có chứa trong đĩa Petri, dùng que gạt dàn đều lên khắp bề mặt môi trường. Từ mỗi độ pha loãng cần lặp lại từ 3-5 lần. Mỗi lần chỉ sử dụng 1 pipet và 1 que gạt vô trùng Các đĩa chứa môi trường đã cấy được đặt vào tủ định ôn với nhiệt độ thích hợp để theo dõi sự phát triển của các vi sinh vật cần phát hiện Nói chúng, sau 24 giờ, vi sinh vật đã sinh trưởng và phát triển tốt, hình thành các khuẩn lạc trong môi trường. Để đảm bảo cho vi sinh vật mọc hết, có thể xác định 19 Thực tập VSV N.T.T.Thủy
thời gian nuôi cấy như sau: vi khuẩn 36-48 giờ, nấm men 48-72 giờ, nấm mốc 96- 120 giờ. Nội dung thực tập và tường trình Phần làm môi trường - Chia thành các nhóm thực tập làm môi trường: canh thịt. Pepton, môi trường khoai tây, môi trường Hansen và môi trường Saburaud - Tiến hành đổ môi trường thạch nghiêng, thạch đĩa đối với môi trường Hansen và Saburaud - Nêu tóm tắt cách làm môi trường và xác định hiệu quả khử trùng môi trường trên. Dụng cụ, hoá chất và nguyên liệu Dụng cụ Cốc nấu: 1000ml, 500ml, 250ml Phễu thuỷ tinh Hộp lồng Ống nghiệm: 16x160ml Bình tam giác: 100ml, 200 ml, 250ml Bình định mức: 250ml, 500ml, 1000ml Đèn cồn Đũa thuỷ tinh Hộp so màu pH kế Bếp điện Nồi hấp áp lực Hoá chất và nguyên liệu Dung dịch axit: HCl 0,1N hoặc H2SO4 0,1N Dung dịch bazơ: NaOH 0,1N hoặc NaHCO3 0,1N K2SO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O NaCl CaCO3 Đường Glucose Pepton Thạch Phần phân lập - Chia thành các nhóm thực tập phân lập vi sinh vật trên môi trường rắn: Bánh biscuit, thóc, mẻ; môi trường lỏng: nước sinh hoạt, nước dưa chua, sữa tươi. - - - Tiến hành làm các ống nghiệm có chứa dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng để pha loãng mẫu. - Theo dõi sự xuất hiện khuẩn lạc khả năng phát triển của chúng. Xác định các đặc điểm hình thái khuẩn lạc cũng như hình thái tế bào. Vẽ hình minh hoạ 20 Thực tập VSV N.T.T.Thủy