Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
<br />
Số 1/2016<br />
<br />
THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC<br />
<br />
KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN<br />
VIBRIO ALGINOLYTICUS GÂY BỆNH ĐỎ THÂN<br />
TRÊN TÔM HÙM BÔNG (Panulirus ornatus) Ở TỈNH PHÚ YÊN<br />
ANTIBIOTIC RESISTANCE OF VIBRIO ALGINOLYTICUS ISOLATED FROM RED<br />
BODY LOBSTERS (Panulirus ornatus) IN PHU YEN PROVINCE<br />
Võ Văn Nha1 , Nguyễn Tường Vy2<br />
Ngày nhận bài: 11/9/2015; Ngày phản biện thông qua: 08/3/2016; Ngày duyệt đăng: 15/3/2016<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Nghiên cứu được tiến hành lập kháng sinh đồ với 8 loại kháng sinh trên 12 chủng Vibrio alginolyticus<br />
phân lập ở tôm hùm bông bị bệnh đỏ thân (Panulirus ornatus) nuôi lồng tại tỉnh Phú Yên nhằm đánh giá sự<br />
kháng kháng sinh của vi khuẩn Vibrio alginolyticus. Kết quả kháng sinh đồ cho thấy có 4 loại kháng sinh nhạy<br />
với Vibrio alginolyticus gồm: tetracycline, streptomycine, nalidixic acid, gentamicine; nhạy ở mức trung bình<br />
có ofloxacine, doxycycline; và các loại kháng sinh đã bị kháng là flumequine, ciprofloxacine. Kết quả này<br />
góp phần làm cơ sở đề xuất loại kháng sinh điều trị bệnh đỏ thân có hiệu quả trên tôm hùm bông nuôi lồng ở<br />
Phú Yên.<br />
Từ khóa: Bệnh đỏ thân, tôm hùm bông, Vibrio alginolyticus<br />
ABSTRACT<br />
The study was conducted as resistance to antibiotics, with 8 antibiotics out of 12 strains Vibrio<br />
alginolyticus isolated in red body spiny lobster (Panulirus ornatus) cage cultured in Phu Yen province to<br />
assess the antibiotic resistance of bacterium Vibrio alginolyticus. Results showed that 4 antibiotics were<br />
sensitivity to Vibrio alginolyticus including: tetracycline, streptomycine, nalidixic acid, gentamicine;<br />
intermediate sensitivity towards: ofloxacine, doxycycline; and the antibiotic resistance towards: flumequine,<br />
ciprofloxacine. These results were contribd to propose an effective procedure of antibiotic treatment of red<br />
body lobsters in spiny lobsters in cage.<br />
Key word: Red body disease, ornate rock lobster, Vibrio alginolyticus<br />
I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Tôm hùm là giáp xác có hàm lượng dinh<br />
dưỡng cao, có giá trị về mặt kinh tế. Tuy<br />
nhiên, tình hình dịch bệnh gia tăng là một yếu<br />
tố gây tổn hại nhiều trong nuôi trong nuôi tôm<br />
hùm. Các bệnh thường xảy ra ở tôm hùm<br />
nuôi nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn với<br />
những đợt dịch bệnh có qui mô lớn, đặc biệt<br />
<br />
1<br />
<br />
2<br />
<br />
là các vi khuẩn Vibrio alginolyticus, V. harveyi,<br />
V. parahaemolyticus và Listone anguillarum là<br />
tác nhân gây nhiều bệnh ở tôm hùm. Ở trong<br />
nước, theo Võ Văn Nha (2005) [2] tôm hùm<br />
bông có dấu hiệu đỏ thân thường bắt gặp các<br />
giống vi khuẩn khác nhau: Vibrio alginolyticus,<br />
V. parahaemolyticus, V. damsela, V. fluvialis,<br />
V. metschinikovii, V. anguillarum, V. cholera.<br />
<br />
TS. Võ Văn Nha: : Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III<br />
Ths. Nguyễn Tường Vy: Viện Hải dương học - Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam<br />
<br />
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 41<br />
<br />
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
Kết quả cảm nhiễm cho thấy Vibrio alginolyticus<br />
là một trong các tác nhân gây bệnh đỏ thân<br />
ở tôm hùm bông giai đoạn ương giống. Có<br />
nhiều biện pháp hạn chế việc nhiễm khuẩn,<br />
trong đó sử dụng kháng sinh như một biện<br />
pháp để khống chế các vi khuẩn gây bệnh. Do<br />
việc sử dụng chưa đúng qui định, chưa kiểm<br />
soát chặt chẽ đã gây tác động đến môi trường<br />
và hệ sinh thái. Nhiều nghiên cứu trong và<br />
ngoài nước cũng chỉ ra rằng tác động của<br />
việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy<br />
sản là đã tạo ra những chủng vi khuẩn kháng<br />
kháng sinh.<br />
Ở nước ngoài đã có nhiều nghiên cứu<br />
thực hiện đánh giá khả năng kháng kháng sinh<br />
chủng Vibrio alginolyticus. Năm 2004, Jacintha<br />
Sugnaseelan đã kiểm tra sự kháng thuốc của 43<br />
dòng V. alginolyticus phân lập từ sò huyết nuôi<br />
với 15 loại kháng sinh cho thấy, tất cả các chủng<br />
đều thể hiện tính kháng với một hoặc nhiều<br />
loại kháng sinh, 100% chủng V. alginolyticus<br />
kháng với vancomycin; 97,7% kháng với<br />
penicillin; 95,4% kháng với bacitracin [12]. Rim<br />
Lajnef (2012) [7] khảo sát sự kháng kháng<br />
sinh trên 69 chủng V. alginolyticus từ những<br />
vùng nuôi ở Bắc Châu Phi, kết quả cho thấy có<br />
59/69 chủng (85,0%) kháng với ít nhất 6 loại<br />
kháng sinh cùng một lúc, trong đó có 94,2%<br />
chủng kháng với tetracycline; 85,5% kháng với<br />
erythromycin; 84,0% kháng với kanamycin;<br />
76,8% kháng với gentamycin và 75,3% kháng với<br />
<br />
Số 1/2016<br />
cefotaxim. Tại Việt Nam, chưa có nhiều thông<br />
báo về khả năng kháng kháng sinh của chủng<br />
V. alginolyticus. Trên đối tượng tôm hùm, Võ<br />
Văn Nha (2005) [2] đã có nghiên cứu sử dụng<br />
một số loại kháng sinh có hiệu quả để điều<br />
trị bệnh do Vibrio alginolyticus gây ra nhưng<br />
nghiên cứu vẫn chưa đi sâu vào hiện tượng<br />
kháng kháng sinh trên vi khuẩn này.<br />
Hiện tượng kháng kháng sinh đang là mối<br />
lo ngại không chỉ đối với người nuôi gây những<br />
khó khăn cho việc trị về sau mà nó còn ảnh<br />
hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng (dư<br />
lượng fluoroquinolones và enrofloxacin gây<br />
mất thị lực, chloramphenicol làm suy tủy). Bài<br />
báo này là cơ sở để đề xuất loại kháng sinh<br />
điều trị bệnh đỏ thân trên tôm hùm có hiệu quả,<br />
hạn chế việc lạm dụng kháng sinh, nhằm mục<br />
đích hướng tới “phát triển bền vững” trong nuôi<br />
tôm hùm ở Việt Nam.<br />
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
<br />
1. Vật liệu nghiên cứu<br />
Vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ<br />
tôm hùm bông bị bệnh đỏ thân từ tháng 12/2013<br />
đến tháng 3/2014 tại 3 vùng nuôi tôm hùm lồng<br />
thuộc xã Xuân Thịnh (đặc trưng cho vùng nuôi<br />
thuộc đầm Cù Mông), xã Xuân Phương (đặc<br />
trưng cho vùng nuôi thuộc vịnh Xuân Đài) và<br />
xã An Chấn (vùng nuôi thuộc biển Đông) tỉnh<br />
Phú Yên. Số lượng mẫu thu được thể hiện ở<br />
bảng 1:<br />
Bảng 1. Số lượng mẫu tôm hùm thu để phân lập Vibrio alginolyticus<br />
<br />
Địa điểm (xã)<br />
<br />
Chiều dài (cm)<br />
(nhỏ nhất – lớn nhất)<br />
<br />
Khối lượng (gam)<br />
(nhỏ nhất – lớn nhất)<br />
<br />
Số lượng mẫu thu<br />
(con)<br />
<br />
Xuân Phương<br />
<br />
5-25<br />
<br />
20-400<br />
<br />
4<br />
<br />
Xuân Thịnh<br />
<br />
5-25<br />
<br />
20-400<br />
<br />
4<br />
<br />
An Chấn<br />
<br />
5-25<br />
<br />
20-400<br />
<br />
4<br />
<br />
2. Phương pháp nghiên cứu xác định hiện tượng<br />
kháng kháng sinh của Vibrio alginolyticus<br />
trên tôm hùm bông bệnh đỏ thân<br />
2.1. Phương pháp thu mẫu, nuôi cấy, phân lập<br />
và định danh vi khuẩn Vibrio alginolyticus<br />
Mẫu tôm hùm: Thu chọn lọc những con còn<br />
sống, có dấu hiệu đặc thù của bệnh đỏ thân như:<br />
<br />
42 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br />
<br />
tôm yếu lờ đờ, bỏ ăn, nhìn phần bụng tôm thấy<br />
có màu đỏ hồng hoặc đỏ tím, khớp đôi chân<br />
bò rời ra, râu dễ gãy. Tất cả các mẫu tôm sau<br />
khi thu được đưa nhanh về phòng thí nghiệm<br />
bằng thùng xốp được sục khí.<br />
Thu mẫu bệnh phẩm: Dùng panh, kéo đã<br />
sát trùng bằng cồn 70o để lấy gan tụy tôm bệnh.<br />
<br />
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
<br />
Số 1/2016<br />
<br />
Đưa mẫu vào các ống nghiệm có chứa 2-3<br />
ml nước muối sinh lý đã vô trùng.<br />
Rửa mẫu bằng nước muối sinh lý 2-3 lần,<br />
sau đó nghiền nát mẫu gan tụy tôm bệnh trong<br />
nước muối sinh lý.<br />
Mẫu sau khi xử lý tiến hành nuôi cấy<br />
trên môi trường TCBS (thiosulfat citrate bile<br />
saccharose). Thời gian nuôi cấy 24 giờ ở 300C.<br />
Chọn những khuẩn lạc vàng có hình dạng<br />
khác nhau để làm thuần vi khuẩn.<br />
Xác định tên vi khuẩn gây bệnh: Các đặc<br />
điểm về hình thái, sinh hóa đã được kiểm tra<br />
bằng việc sử dụng bộ kít API 20E và soi trên<br />
kính hiển vi ở độ phóng đại từ thấp đến cao<br />
(40x đến 1000x). Vi khuẩn được định danh<br />
theo khóa phân lập Bergey [5] dựa trên phương<br />
pháp nghiên cứu của Frerich (1984) [6].<br />
2.2. Phương pháp lập kháng sinh đồ<br />
Dựa trên phương pháp Kirbry-Bauer, sử<br />
dụng môi trường TSA (Tryptic Soy Agar), chọn<br />
8 loại kháng sinh đã được chọn làm thí nghiệm<br />
bao gồm doxycycline, tetracycline, flumequine,<br />
ofloxacine, streptomycine, ciprofloxacine, acid<br />
nalidixic và gentamicine. Cụ thể được mô tả<br />
như sau:<br />
<br />
Bước 1: Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn<br />
lạc trên đĩa thạch có V. alginolyticus đã được<br />
làm thuần, cho vào ống nghiệm chứa 10ml<br />
nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng.<br />
Bước 2: Điều chỉnh mật độ vi khuẩn được<br />
xác định dựa vào phương pháp so màu trên<br />
máy quang phổ U-5100 (Hitachi-Nhật): dung<br />
dịch trộn đều trên máy voltex sau đó đem đo<br />
trên máy so màu quang phổ ở bước sóng<br />
610nm, điều chỉnh độ đục ở mức OD= 0,1±<br />
0,02, khi đó mật độ vi khuẩn trong ống nghiệm<br />
tương ứng khoảng 1 x 108 cfu/ml.<br />
Bước 3: Lấy 0,2 ml vi khuẩn từ ống<br />
nghiệm đã điều chỉnh mật độ trải đều trên đĩa<br />
thạch, sau đó gắn các đĩa kháng sinh (Hãng<br />
Biorad-Mỹ) vào đĩa thạch (đĩa kháng sinh là<br />
những mảnh giấy tròn có tẩm kháng sinh) và ủ<br />
trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C.<br />
Bước 4: Sau 24 giờ, đo đường kính vô<br />
trùng (mm) bằng thước kẹp có độ chính xác<br />
đến 1mm. Dựa vào chuẩn đường kính vòng vô<br />
trùng của tài liệu CLSI- The Clinical and Laboratory Standards Institure (2006) để xác định<br />
loại kháng sinh nhạy, trung gian và kháng [13].<br />
Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.<br />
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br />
<br />
Bảng 2. Tỷ lệ phần trăm nhạy, nhạy trung bình và kháng của các chủng V. alginolyticus<br />
phân lập ở những vùng khác nhau với 8 loại kháng sinh<br />
Tên kháng sinh<br />
<br />
Doxycycline<br />
Tetracycline<br />
Flumequine<br />
Ofloxacine<br />
Ciprofloxacine<br />
Nalidixic Acid<br />
Streptomycine<br />
Gentamicine<br />
<br />
Số chủng<br />
<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
<br />
Kết quả kháng sinh đồ từ bảng 2 cho thấy,<br />
với 8 loại kháng sinh đưa vào thí nghiệm trên 12<br />
chủng V. alginolyticus phân lập từ tôm hùm bị<br />
bệnh đỏ thân thu ở Phú Yên thì có 4 loại kháng<br />
sinh nhạy với vi khuẩn V. alginolyticus; 2 loại<br />
kháng sinh nhạy ở mức trung bình và 2 loại<br />
kháng sinh đã thể hiện tính kháng (bảng 2).<br />
<br />
Kháng (%)<br />
<br />
25,0<br />
8,3<br />
75,0<br />
41,7<br />
50,0<br />
0,0<br />
0,0<br />
0,0<br />
<br />
Trung gian (%)<br />
<br />
58,3<br />
33,4<br />
25,0<br />
58,3<br />
25,0<br />
33,3<br />
8,3<br />
0,0<br />
<br />
Nhạy (%)<br />
<br />
16,7<br />
58,3<br />
0,0<br />
0,0<br />
25,0<br />
66,7<br />
91,7<br />
100,0<br />
<br />
Trong 4 loại kháng sinh nhạy với<br />
V. alginolyticus thì gentamicine là kháng sinh có<br />
độ nhạy với 12 chủng vi khuẩn (100%), tiếp theo<br />
là streptomycine, nalidixic acid và tetracycline.<br />
Vì vậy, có thể đề xuất các loại kháng sinh này<br />
cho việc điều trị bệnh đỏ thân ở tôm hùm. Tuy<br />
nhiên, riêng tetracycline mặc dù kết quả cho thấy<br />
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 43<br />
<br />
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
<br />
Số 1/2016<br />
<br />
vẫn còn nhạy với V. alginolyticus, nhưng vẫn có<br />
Banerjee (2011) [4] xác nhận đây là nhóm<br />
8,3% vi khuẩn đã kháng. Jacintha Sugnaseelan<br />
kháng sinh bị kháng phổ biến nhất mặc dù<br />
(2004) [12] cũng chỉ ra rằng, đã xảy ra hiện<br />
trước đây nhóm kháng sinh này có hiệu quả<br />
tượng kháng tetracycline trên vi khuẩn<br />
nhất trong kiểm soát V. alginolyticus [12]. Theo<br />
V. alginolyticus phân lập từ sò huyết. Do vậy,<br />
báo cáo của cục kiểm định thuốc châu Âu,<br />
việc sử dụng tetracycline phải hết sức cân<br />
quionolone là nhóm kháng sinh rất quan trọng<br />
nhắc bởi tính kháng kháng sinh vẫn có thể xảy<br />
chuyên dùng để điều trị các bệnh nhiễm trùng<br />
ra nếu sử dụng trong thời gian dài và liên tục.<br />
nguy hiểm cho người và động vật. Do vậy,<br />
Kháng sinh nhạy ở mức trung bình đối<br />
nhóm quionolone là thành phần chính trong<br />
với V. alginolyticus trong nghiên cứu này là<br />
các sản phẩm thương mại như Beta-Entro 20,<br />
ofloxacine và doxycycline. Đã có một vài báo<br />
Enro-β 40,… dùng trong nuôi tôm hùm lồng ở<br />
cáo cho thấy hiện tượng kháng thuốc đối với<br />
Việt Nam, mà đây là nhóm kháng sinh cấm sử<br />
doxycycline và ofloxacine, cụ thể Rim Lajnef<br />
dụng trong nuôi trồng thủy sản của Việt Nam.<br />
(2012) [7] cho rằng, có 69,6% trong số 69<br />
Hệ lụy của việc người dân dùng kháng sinh<br />
chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ<br />
cấm là rất lớn, đó là sự tồn lưu của kháng sinh<br />
các cơ sở nuôi cá ở Bắc Châu Phi thể hiện tính<br />
trong thực phẩm gây nguy hiểm cho người sử<br />
kháng với doxycycline. Sanjoy Banerjee (2011)<br />
dụng, tăng tác dụng phụ, tăng độc tính, gây<br />
[4] phân lập được 48,3% các loài vi khuẩn<br />
chủng vi khuẩn lờn thuốc làm cho việc chữa trị<br />
thuộc nhóm Vibrio trong đó có V. alginolyticus<br />
về sau gặp khó khăn. Do vậy, các cơ quan có<br />
từ các cơ sở nuôi tôm thẻ chân trắng đã cho<br />
thẩm quyền cần có biện pháp tuyên truyền và<br />
kết quả kháng với norfloxacine cùng nhóm với<br />
quản lý chặt chẽ hơn.<br />
ofloxacine.<br />
So sánh với kết quả nghiên cứu của<br />
Cũng từ kết quả bảng 2 cho thấy, hầu hết<br />
Võ Văn Nha (2005) [2] cũng trên vi khuẩn<br />
vi khuẩn kháng với kháng sinh flumequine<br />
V. alginolyticus phân lập từ tôm hùm bông bị<br />
(75,0%) và ciprofloxacine (50,0%) thuộc nhóm<br />
bệnh đỏ thân ở Phú Yên cho thấy, đường kính<br />
quinolone, điều này trùng hợp với những<br />
vòng vô khuẩn ở các chủng phân lập trong<br />
công bố trước đây rằng hiện nay vi khuẩn<br />
nghiên cứu này đã giảm xuống rõ rệt, giảm<br />
V. alginolyticus có tỉ lệ kháng cao với các kháng<br />
mạnh đối với những loại kháng sinh được<br />
sinh thuộc nhóm quinlone và được Sanjoy<br />
người dân sử dụng phổ biển (bảng 3).<br />
Bảng 3. Khả năng kháng kháng sinh của Vibrio alginolyticus phân lập<br />
từ tôm hùm bị bệnh đỏ thân<br />
Nhóm kháng sinh<br />
<br />
Tetracycline<br />
<br />
Quinolone<br />
Aminoglycosides<br />
Ghi chú:<br />
<br />
Tên kháng sinh<br />
<br />
Doxycycline<br />
Tetracycline<br />
Flumequine<br />
Ofloxacine<br />
Ciprofloxacine<br />
Nalidixic Acid<br />
Streptomycine<br />
Gentamicine<br />
<br />
Nồng độ Đường kính độ nhạy<br />
chuẩn (mm) (*)<br />
kháng<br />
sinh<br />
Trung<br />
Nhạy<br />
(µg/dĩa) Kháng<br />
gian<br />
<br />
30 UI<br />
30<br />
30<br />
5<br />
5<br />
30<br />
10<br />
120<br />
<br />