Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất enzyme L-sparaginase từ nấm Aspergillus terreus SF 981 bằng phương pháp lên men bán rắn

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:15

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất enzyme l asparaginase từ nấm Aspergillus terreus SF 981 bằng phương pháp lên men bán rắn được thực hiện nhằm xác định các yếu tố thích hợp cho quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase và làm nguyên liệu để sản xuất các sản phẩm có hoạt tính sinh học hỗ trợ và điều trị bệnh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất enzyme L-sparaginase từ nấm Aspergillus terreus SF 981 bằng phương pháp lên men bán rắn

INVESTIGATION OF FACTORS AFFECTING THE PRODUCTION OF ENZYME L-ASPARAGINASE FROM Aspergillus terreus SF-981 BY SOLID STATE FERMENTATION Nguyen Pham Tuan1*, Bang Hong Lam2, and Nguyen Pham Tu1 1 An Giang Biotechnology center, Chau Thanh district, An Giang province 2 An Giang University, Viet Nam Nation University, Ho Chi Minh City *Corresponding author: ngphamtuan1983@gmail.com Tel. +84.988202055. Abstract L-asparaginase is an important anticancer enzyme that is used in the first line treatment of acute lymphoblastic leukemia. The Aspergillus terreus SF-981 have the ability to produce extracellular enzymes in high quantities, which are easily extracted and purified. This mycelium may provide to potential ideal sources of L-asparaginase. The study was conducted to evaluate the effect of factors on the production of L- asparaginase from this type of mycelium by solid state fermentation method and is a prerequisite for the production of products capable of supporting and treating diseases. The effect of factors on the production of L-asparaginase from Aspergillus terreus SF-981 as medium, substrates, moisture, initial cell density, pH of medium, size of substrate and fermentation time was investigated. Enzyme L-asparaginae activity, protein content, biomass fungal and enzyme specific activity assay were determined by spectrophotometer and weighing method. The results showed that, Aspergillus terreus SF-981 strains produced enzyme L-asparaginase under conditions as medium (modified Czapek‟s Dox broth), substrates (soybean meal), moisture (70%), initial cell density (107 cell/mL), pH of medium (pH = 8), size of substrate (2 mm) and fermentation time (4 day), Enzyme L-asparaginae activity, protein content and enzyme specific activity reaches 147.74 U/g; 4.19 mg/g; 25.26 IU/mg and 11.19 g/bottle 500 mL respectively. Keywords: Aspergillus terreus SF-981, L-asparaginase, protein, biomass, activity. 213
KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME L-ASPARAGINASE TỪ NẤM Aspergillus terreus SF-981 BẰNG PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN Nguyễn Phạm Tuấn1*, Bằng Hồng Lam2 và Nguyễn Phạm Tú1 1 Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang, huyện Châu Thành, tỉnh An Giang 2 Trường Đại học An Giang, Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: ngphamtuan1983@gmail.com Số điện thoại: 0988.202055 Tóm tắt L-asparaginase là một enzyme chống ung thư quan trọng và được sử dụng đầu tiên để điều trị bệnh bạch cầu tăng lympo bào cấp tính. Nấm Aspergillus terreus SF- 981 là nguồn sản xuất enzyme ngoại bào phong phú, dễ trích ly và tinh sạch, đặc biệt là nguồn enzyme L-asparaginase tiềm năng. Mục tiêu nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định điều kiện thích hợp cho quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase từ nấm này bằng phương pháp lên men bán rắn và làm tiền đề cho quá trình sản xuất các sản phẩm hỗ trợ và điều trị bệnh. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bán rắn sản xuất enzyme L-asparaginase từ nấm Aspergillus terreus SF-981 bao gồm môi trường dinh dưỡng, pH môi trường, cơ chất, độ mịn cơ chất, độ ẩm cơ chất, mật số tế bào và thời gian lên men. Hoạt tính enzyme L-asparaginase, hàm lượng protein, hoạt độ riêng enzyme L-asparaginase và sinh khối nấm được xác định bằng phương pháp quang phổ và cân. Kết quả cho thấy, nấm Aspergillus terreus SF-981 sản xuất enzyme L-asparaginase dưới các điều kiện như môi trường (Czapek‟s Dox broth cải tiến), pH môi trường (pH = 8), cơ chất lên men (bã đậu nành), độ mịn cơ chất (2 mm), độ ẩm cơ chất (70%), mật số tế bào (107 tế bào/mL) và thời gian lên men (4 ngày) cho hoạt tính enzyme, hàm lượng protein, hoạt độ riêng enzyme và sinh khối nấm đạt cao nhất lần lượt là 147,74 U/g; 4,19 mg/g; 35,26 IU/mg và 11,19 g/keo 500mL. Từ khóa: Aspergillus terreus SF-981, protein, hoạt độ, sinh khối, L- asparaginase. 214
1. Mở đầu Enzyme L-asparagianse (EC3.5.1.1) là một enzyme xúc tác quá trình thủy phân L-asparagine thành L-aspartate và ammonia. Trong điều trị ung thư, L-asparaginase giúp loại bỏ L-asparagine trong các tế bào khối u, do đó kiểm soát tăng trưởng khối u hiệu quả. Trong thực tế, L-asparaginase được sử dụng đề điều trị bệnh ung thư Bạch cầu lympho ác tính (Sanjotha và Manawadi, 2017). Trong tự nhiên, enzyme L- asparaginase có thể được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau như vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm,… Enzyme L-asparaginase chủ yếu được sản xuất từ vi khuẩn (E. coli và E. carotovora) do chi phí sản xuất thấp nhưng có nhiều tác dụng phụ, chủ yếu là quá mẫn cảm dẫn đến phản ứng dị ứng và sốc phản vệ. Những năm trở lại đây, nấm Aspergillus terreus được xem là nguồn tổng hợp enzyme L-asparaginase phong phú và giàu tiềm năng trong tự nhiên (Sanjotha và Manawadi, 2017). Nấm này tổng hợp enzyme L- asparaginase bằng hai phương pháp lên men chìm và lên men bán rắn, quá trình lên men bán rắn sản xuất enzyme L-asparaginase chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố sinh học và phi sinh học (Subhan et al., 2016). Lên men trạng thái bán rắn đã được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm cho các mục đích khác nhau như sản xuất enzyme, acid hữu cơ, phẩm màu,… (Jian và Yang, 2013). Lên men bán rắn là môi trường sống tự nhiên của hầu hết các vi sinh vật (chủ yếu nấm mốc); đòi hỏi ít năng lượng để khử trùng (vì hoạt động của nước thấp hơn); ít bị nhiễm khuẩn; sản xuất các sản phẩm với năng suất cao hơn; môi trường thuận lợi; tận dụng được các phụ phế phẩm nông nghiệp và kiểm soát được nước thải (Carlos et al., 2017). Trong quá trình lên men bán rắn để sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học, nấm Aspergillus terreus chịu tác động của các yếu tố như pH, cơ chất, độ mịn cơ chất, mật số tế bào, lượng giống cấy và thời gian lên men,… Xuất phát từ thực trạng nêu trên, nghiên cứu ―Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase từ nấm Aspergillus terreus SF-981 bằng phƣơng pháp lên men bán rắn‖ được thực hiện nhằm xác định các yếu tố thích hợp cho quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase và làm nguyên liệu để sản xuất các sản phẩm có hoạt tính sinh học hỗ trợ và điều trị bệnh. 2. Nguyên vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên vật liệu Mẫu nấm Aspergillus terreus SF-981 được lưu giữ ở phòng thí nghiệm Sinh hóa, Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang và bảo quản trên môi trường PDA ở điều kiện 40C. Hóa chất và thiết bị gồm (NH4)2SO4, TCA, Nessler (Merck, Mỹ), máy đo quang phổ (Human, Hàn Quốc), cân phân tích (Ohaus, Mỹ), nồi hấp thanh trùng (Hirayama, Nhật Bản),… 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng lên men đến quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase Mẫu nấm Aspergillus terreus SF-981 được hoạt hóa trên môi trường Potato Dextrose Broth ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 3 - 5 ngày. Tiến hành kiểm tra mật số tế bào bằng buồng đếm hồng cầu. Chuẩn bị các công thức thí nghiệm có chứa 20 g cơ chất (bột bắp) và bổ sung 25 mL môi trường lên men khác nhau (Glucose Asparagine Broth, Asparagine Dextrose Salts Broth, Czapek‘s Dox broth cải tiến và Inorganic Salts Starch Asparagine) ở pH = 215
7 và đạt độ ẩm 50%. Tiến hành cấy 10 mL dung dịch sinh khối nấm (mật độ 105 tế bào/mL) vào các công thức thí nghiệm và ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 3 ngày. Chỉ tiêu theo dõi: hoạt tính enzyme, hàm lượng protein, hoạt độ riêng và sinh khối nấm. Sau thời gian lên men, enzyme thô từ cơ chất lên men được chiết xuất bằng cách sử dụng 0,1 M dung dịch đệm phosphate (pH = 8), lắc ở tốc độ 150 vòng/phút trong 30 phút. Hỗn hợp được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong khoảng 10 phút ở điều kiện nhiệt độ 40C. Dịch lọc được sử dụng để phân tích. Hoạt tính của enzyme L-asparaginase được xác định dựa theo mô tả của Imada et al. (1973), hỗn hợp gồm 0,5 mL L- asparagine 4 M và 0,5 mL Tris-HCl (pH = 7,2) được thêm vào 0,5 mL enzyme thô và ủ nhiệt độ 370C trong 30 phút. Sau đó, dừng phản ứng bằng cách thêm 0,5 mL tricholoroacetic acid (TCA). Mẫu đối chứng được thực hiện tương tự nhưng cho TCA vào trước enzyme thô. Tiếp theo 0,1 mL hỗn hợp phản ứng, 3,75 mL nước cất và 0,2 mL thuốc thử Nessler, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và đo độ hấp thụ quang ở λ = 450 nm. Một đơn vị hoạt độ của L-asparaginase là lượng enzyme giải phóng 1 μmol amoniac trong 1 phút ở điều kiện 370C. Trong đó: 2,5 = tổng thể tích phản ứng của hỗn hợp (mL). 0,1: thể tích hỗn hợp enzyme sử dụng phản ứng cuối (mL). 30: thời gian phản ứng (phút); 1: thể tích enzyme sử dụng (mL). Hàm lượng protein được xác định dựa theo phương pháp của Lowry et al. (1951) và hoạt độ riêng của enzyme được tính theo công thức: UI/mL hoặc UI/mg = hoạt tính enzyme/hàm lượng protein. Sinh khối nấm: cơ chất sau khi lên men được chiết xuất thu enzyme thô, phần cặn được tiến hành sấy khô ở điều kiện nhiệt độ 600C để xác định sinh khối của nấm sau khi lên men (g/keo). 2.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase Chuẩn bị các công thức thí nghiệm có chứa 20 g cơ chất (bột bắp) và bổ sung 25 mL môi trường Czapek‘s Dox broth lên men có pH khác nhau (4; 5; 6; 7; 8 và 9) và đạt độ ẩm môi trường 50%. Tiến hành cấy 10 mL dung dịch sinh khối nấm (mật độ 105 tế bào/mL) vào các công thức thí nghiệm và ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 3 ngày. 2.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của cơ chất lên men đến quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase Chuẩn bị các công thức thí nghiệm có chứa 20 g cơ chất khác nhau (bột bắp, vỏ lựu, bột đậu nành, cám gạo và bã mía), bổ sung 25 mL môi trường Czapek‘s Dox broth lên men có pH = 8 và độ ẩm môi trường 50%. Tiến hành cấy 10 mL dung dịch sinh khối nấm (mật độ 105 tế bào/mL) vào các công thức thí nghiệm và ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 3 ngày. 216
2.2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của kích thƣớc cơ chất lên men đến quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase Chuẩn bị các công thức thí nghiệm có chứa 20 g cơ chất (bột đậu nành) với độ mịn khác nhau (0,2; 0,5 1 và 2 mm) qua rây lọc và bổ sung 25 mL môi trường Czapek‘s Dox broth có pH = 8 và độ ẩm môi trường 50%. Tiến hành cấy 10 mL dung dịch sinh khối nấm (mật độ 105 tế bào/mL) vào các công thức thí nghiệm và ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 3 ngày. 2.2.5. Khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng đến quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase Chuẩn bị các công thức thí nghiệm có chứa 20 g cơ chất (bột đậu nành) với độ mịn 2 mm qua rây lọc và bổ sung 25 mL môi trường Czapek‘s Dox broth có pH = 8 và độ ẩm môi trường khác nhau (30; 50; 70 và 90%). Tiến hành cấy 10 mL dung dịch sinh khối nấm (mật độ 105 tế bào/mL) vào các công thức thí nghiệm và ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 3 ngày. 2.2.6. Khảo sát ảnh hƣởng của mật số tế bào đến quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase Chuẩn bị các công thức thí nghiệm có chứa 20 g cơ chất (bột đậu nành) với độ mịn 2 mm qua rây lọc và bổ sung 25 mL môi trường Czapek‘s Dox broth lên men có pH = 8 và độ ẩm môi trường 70%. Tiến hành cấy 10 mL dung dịch sinh khối nấm (mật độ tế bào khác nhau) vào các công thức thí nghiệm và ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 3 ngày. 2.2.7. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian lên men lên men đến quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase Chuẩn bị các công thức thí nghiệm có chứa 20 g cơ chất (bột đậu nành) với độ mịn 2 mm qua rây lọc và bổ sung 25 mL môi trường Czapek‘s Dox broth có pH = 8 và độ ẩm môi trường 70%. Tiến hành cấy 10 mL dung dịch sinh khối nấm (mật độ 107 tế bào/mL) vào các công thức thí nghiệm và ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian lên men khác nhau. 2.3. Phƣơng pháp thống kê Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics plus 16.0. Sự khác biệt giữa các trung bình được kiểm định theo phép thử LSD và Duncan. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng lên men đến quá trình sản xuất enzyme L- asparaginase Hoạt tính enzyme L-asparaginase và hàm lượng protein được xác định dựa vào đường chuẩn amonium sulfate và BSA. Phương trình đường chuẩn của amonium sulfate: y = 0,3782x + 0,006; với hệ số tương quan R2 = 0,9915 (Hình 1a). Trong khi đó, Phương trình đường chuẩn của BSA: y = 1,1791x + 0,043; với hệ số tương quan R2 = 0,9969 (Hình 1b). 217
Kết quả nghiên cứu cho thấy, môi trường lên men ảnh hưởng đến quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase cũng như hàm lượng protein và sinh khối của nấm (Hình 2). Hoạt tính enzyme L-asparaginase có sự khác biệt giữa các môi trường lên men khác nhau (Hình 3a). Hoạt tính enzyme L-asparaginase thể hiện cao nhất (23,91 U/g) ở môi trường Czapek‘s Dox broth cải tiến và thể hiện thấp nhất (9,19 U/g) ở môi trường Glucose Asparagine Broth. Tương tự, hàm lượng protein đạt cao nhất (2,72 mg/g) ở môi trường Glucose Asparagine Broth và chỉ đạt 2,40 mg/g ở môi trường Czapek‘s Dox broth cải tiến (Hình 2a). 1 0,7 y = 1,1791x + 0,043 y = 0,3782x + 0,006 R² = 0,9969 R² = 0,9915 0,6 0,8 (a) (b) Độ hấp thu 750 nm 0,5 Độ hấp thu 0,6 0,4 0,3 0,4 0,2 0,2 0,1 0 0 0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Nồng độ Amonium sulfate (µmol/mL) Nồng độ BSA (mg/mL) Hình 1. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của (NH4)2SO4 (a) và BSA (b). Bên cạnh đó, hoạt độ riêng enzyme L-asparaginase có sự khác biệt giữa các môi trường lên men khác nhau (Hình 2b). Hoạt độ riêng enzyme L-asparaginase đạt cao nhất (9,96 UI/mg) ở môi trường Czapek‘s Dox broth cải tiến, ngược lại ở môi trường Glucose Asparagine Broth đạt thấp nhất (3,38 UI/mg). Cuối cùng, sinh khối nấm giữa các môi trường lên men khác nhau dao động trong khoảng 9,57 - 9,92 g/keo (Hình 2b). Cụ thể, sinh khối nấm ở môi trường Inorganic Salts Starch Asparagine đạt cao nhất (9,92 g/keo) và thấp nhất ở môi trường Glucose Asparagine Broth (9,57 g/keo). Môi trường Czapek‘s Dox broth cải tiến thích hợp nhất cho sản xuất enzyme L- asparaginase so với các môi trường khác (Glucose Asparagine Broth, Asparagine Dextrose Salts Broth và Inorganic Salts Starch Asparagine) có thể là do trong môi trường Czapek‘s Dox broth có chứa nguồn nitrogen là sucrose giúp nấm dễ sử dụng và kích thích quá trình sản xuất enzyme. Đồng thời, môi trường Czapek‘s Dox broth cải tiến có chứa natri nitrate là nguồn nitrogen thích hợp hơn so với peptone và yeast extract do mỗi loại nấm sẽ sử dụng một nguồn nitrogen khác nhau và cũng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất (Abeer et al., 2017). 218
30 Hoạt tính enzyme (U/g) Hàm lƣợng protein (mg/g) 3 15 Hoạt độ riêng enzyme (UI/mg) Sinh khối nấm (g/keo) 12 2,72 Hoạt độ riêng enzyme (UI/mg) 9,66 9,88 9,92 25 2,54 23,91 2,46 9,57 10 Sinh khối nấm (g/keo) 12 Hàm lƣợng protein (mg/g) Hoạt tính enzyme (U/g) 2,5 9,96 20 2,4 8 (a) 17,98 9 (b) 7,31 15 13,18 2 6 6 5,19 10 9,19 4 1,5 3,38 3 5 2 0 1 0 0 GAB ADS CD ISSA GAB ADS CD ISSA Môi trƣờng lên men Môi trƣờng lên men Hình 2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng lên men đến hàm lƣợng protein và hoạt tính của enzyme L-asparaginase (a); hoạt độ riêng của enzyme L-asparaginase và sinh khối nấm (b). 3.2. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến quá trình sản xuất enzyme L- asparaginase Hoạt động của các enzyme vi sinh vật phụ thuộc vào sự thay đổi hiện diện trên bề mặt của các amino acid. Bất kỳ sự thay đổi pH môi trường đều ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Do đó pH có thể ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của vi sinh vật. Sự tăng trưởng của mỗi loài vi sinh vật đều có giới hạn pH xác định. Độ pH ban đầu ảnh hưởng đến hệ thống enzyme và sự vận chuyển enzyme qua màng tế bào (Mohana et al., 2008). Điện tích của các amino acid thay đổi theo pH của môi trường và hằng số phân ly của chúng. Sự thay đổi pH có thể ảnh hưởng đến điện tích và cấu hình của vị trí hoạt động. Do đó thay đổi làm hoạt tính, tính ổn định cấu trúc hoặc độ hòa tan của các enzyme. Hoạt tính enzyme L-asparaginase có sự khác biệt giữa các pH khác nhau của môi trường (Hình 3a). Hoạt tính enzyme L-asparaginase thể hiện cao nhất (37,19 U/g) ở pH = 8 và thấp nhất (9,18 U/g) ở pH = 4. Tương tự, hàm lượng protein khác nhau ở các pH môi trường khác nhau (Hình 3a). Cụ thể, hàm lượng protein đạt cao nhất (3,11 mg/g) ở pH = 7 và đạt thấp nhất (2,78 mg/g) ở pH = 8. Bên cạnh đó, hoạt độ riêng enzyme L-asparaginase có sự khác biệt giữa các pH khác nhau của môi trường (Hình 3b). Hoạt độ riêng enzyme L-asparaginase đạt cao nhất (13,38 UI/mg) khi pH = 8 và đạt thấp nhất (3,15 UI/mg) khi pH = 4. Sinh khối nấm ở các pH khác nhau của môi trường dao động trong khoảng 9,15 - 10,08 g/keo (Hình 3b). Cụ thể, sinh khối nấm đạt cao nhất (10,08 g/keo) ở pH = 9 và thấp nhất (9,15 g/keo) ở pH = 4. 219
50 4 15 Hoạt độ riêng enzyme (UI/mg) Sinh khối nấm (g/keo) 12 Hoạt tính enzyme (U/g) Hàm lƣợng protein (mg/g) 13,38 Hoạt độ riêng enzyme (UI/mg) 9,87 10,08 9,15 9,33 9,48 10 Sinh khối nấm (g/keo) 40 37,19 12 Hàm lƣợng protein (mg/g) Hoạt tính enzyme (U/g) 2,95 3,01 2,99 9,98 2,91 3,11 2,78 3 8 30 9 7,73 23,11 7,04 6 (a) 21,89 (b) 20 17,65 6 5,86 2 4,13 4 12,19 9,18 3,15 10 3 2 0 1 0 0 pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8 pH = 9 pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8 pH = 9 pH môi trƣờng pH môi trƣờng Hình 3. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến hàm lƣợng protein và hoạt tính của enzyme L-asparaginase (a); hoạt độ riêng của enzyme L-asparaginase và sinh khối nấm (b). Kết quả nghiên cứu tương tự Varalakshmi và Raju (2013) cho rằng, nấm Aspergillus terreus sản xuất enzyme L-asparaginase cao nhất ở điều kiện pH = 8, đạt hàm lượng 191,3 U/g. Hơn nữa Thirumurugan et al. (2011) cũng cho rằng, nấm Aspergillus terreus sản xuất enzyme L-asparaginase cao nhất ở điều kiện tối ưu pH = 8. Trong khi đó, sản xuất L-asparaginase của Aspergillus terreus KLS 2 đạt cao nhất ở pH = 4,5 khi vỏ carob được sử dụng làm chất nền (Siddalingeshwara et al., 2010). Do đó, nấm phân lập từ các nguồn khác nhau có pH tối ưu khác nhau cho quá trình sản xuất L-asparaginase. Bên cạnh đó, Pallem et al. (2011); Hosamani và Kaliwal (2011), pH = 7 phù hợp nhất cho sản xuất L-asparaginase từ nấm Fusarium oxysporum và Fusarium Equiseti khi cám lúa mì và bột đậu nành được sử dụng làm chất nền. Tuy nhiên, hoạt động của enzyme giảm khi độ pH của chất nền vượt quá pH = 7. Điều này có thể là do sự biến tính enzyme bằng cách phá hủy amino acid đặc trưng ở pH cao hơn. Theo nghiên cứu của Swathi et al. (2014), pH = 9 là tối ưu sản xuất L- asparaginase từ nấm Beauveria bassiana (MSS 18/41) khi cám lúa mì được sử dụng làm chất nền. Điều này có thể là do các chủng nấm có phản ứng rõ rệt với sự thay đổi pH của môi trường để sản xuất enzyme bằng cách điều chỉnh pH sinh lý lý tưởng cho sự tăng trưởng và phát triển hoặc ảnh hưởng đến hoạt động, sự ổn định cấu trúc và độ hòa tan của enzyme. 3.3. Ảnh hƣởng của cơ chất lên men đến quá trình sản xuất enzyme L- asparaginase Lên men bán rắn là một phương pháp có chi phí thấp cho quá trình sản xuất của các enzyme vì lên men bán rắn giúp kiểm soát quá trình lên men tốt hơn, năng suất cao hơn… (Prabhakar, 2005). Lựa chọn chất nền (cơ chất) thích hợp để sản xuất enzyme là rất quan trọng trong quá trình lên men bán rắn vì nó phụ thuộc vào một số yếu tố chủ yếu liên quan đến chi phí, giá trị dinh dưỡng và tính sẵn có của chất nền (Pandey, 2002). Do tầm quan trọng của enzyme trong sản xuất dược phẩm cũng như trong các ngành công nghiệp thực phẩm, nhiều nghiên cứu quan tâm phát triển các phương pháp lên men để giảm chi phí sản xuất enzyme. 220
60 Hoạt tính enzyme (U/g) Hàm lƣợng protein (mg/g) 4 20 Hoạt độ riêng enzyme (UI/mg) Sinh khối nấm (g/keo) 15 Hoạt độ riêng enzyme (UI/mg) 50,28 17,46 50 (a) (b) Sinh khối nấm (g/keo) 2,88 12 Hàm lƣợng protein (mg/g) Hoạt tính enzyme (U/g) 2,73 3,01 3 15 9,92 10,08 9,91 2,51 10,02 40 2,49 9,44 10,61 9 30,08 10,27 9,99 28,97 30 25,78 2 10 7,71 6 19,21 20 1 5 3 10 0 0 0 0 Bột bắp Vỏ lựu Bột đậu nành Cám gạo Bã mía Bột bắp Vỏ lựu Bột đậu nành Cám gạo Bã mía Cơ chất lên men Cơ chất lên men Hình 4. Ảnh hƣởng của cơ chất lên men đến hàm lƣợng protein và hoạt tính của enzyme L-asparaginase (a); hoạt độ riêng của enzyme L-asparaginase và sinh khối nấm (b). Hoạt tính enzyme L-asparaginase có sự khác biệt giữa các cơ chất lên men khác nhau (Hình 4a). Kết quả cho thấy, hoạt tính enzyme L-asparaginase thể hiện cao nhất (50,28 U/g) ở cơ chất lên men bã đậu nành và thể hiện thấp nhất (19,21 U/g) ở cơ chất lên men bột bắp. Tương tự, hàm lượng protein khác nhau ở các cơ chất lên men khác nhau (Hình 4a). Cụ thể, hàm lượng protein đạt cao nhất (3,01 mg/g) ở cơ chất lên men bã mía và chỉ đạt 2,49 mg/g ở cơ chất lên men bột bắp. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, hoạt độ riêng enzyme L-asparaginase có sự khác biệt giữa các cơ chất khác nhau được sử dụng trong quá trình lên men (Hình 4b). Hoạt độ riêng enzyme L-asparaginase đạt cao nhất (17,46 UI/mg) ở cơ chất lên men bột đậu nành; ngược lại ở cơ chất lên men bột bắp, hoạt độ riêng enzyme L- asparaginase đạt thấp nhất (7,71 UI/mg). Sinh khối nấm thu được giữa các cơ chất lên men khác nhau dao động trong khoảng 9,44 - 10,08 g/keo (Hình 4b). Đạt cao nhất (10,08 g/keo) ở cơ chất là cám gạo và thấp nhất (9,44 g/keo) ở cơ chất là bột bắp. Các chất nền khác nhau như cám lúa mì, cám gạo, bã mía, trấu, bánh dầu dừa, bánh dầu lạc, bánh dầu hạt bông, lõi ngô, vỏ ngô, rơm bột ngô và chất thải từ trà cũng đã được nhiều công trình nghiên cứu minh chứng là chất nền phù hợp cho sản xuất L- asparaginase (Elshafei và El-Ghonemy, 2015). Tuy nhiên, trong nghiên cứu này cho thấy bột đậu nành là chất nền phù hợp nhất để tăng cường quá trình sản xuất L- asparaginase đồng thời còn giúp giảm chi phí sản xuất. Bột đậu nành cũng được sử dụng như môi trường để sản xuất các enzyme như lipase, xlyanase, cellulase và polygalacturonase (Coffman et al., 2014). Hơn nữa, hàm lượng protein của bột đậu nành cao (48 - 60%) và hàm lượng lignin thấp làm cho bột đậu nành trở thành chất nền lý tưởng trong sản xuất enzyme L-asparaginase (Anil và Janakiraman, 2017). 3.4. Ảnh hƣởng của độ mịn cơ chất lên men đến quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase Trong số các yếu tố quan trọng đối với sự phát triển của vi sinh vật và quy trình sản xuất enzyme theo phương pháp lên men bán rắn (độ ẩm, độ mịn chất nền và lượng giống chủng) là những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự tăng trưởng, sinh tổng hợp và chuyển hóa các chất (Ellaiah, 2002). Trong quá trình lên men bán rắn, diện tích 221
bề mặt của chất nền đóng vai trò quan trọng đối với sự gắn kết của vi sinh vật, vận chuyển sinh khối, chất dinh dưỡng và sản xuất enzyme (Anil et al., 2017). Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính enzyme L-asparaginase có sự khác biệt giữa các độ mịn cơ chất khác nhau (Hình 5a). Hoạt tính enzyme L-asparaginase thể hiện cao nhất (74,85 U/g) ở độ mịn cơ chất 2 mm và thấp nhất (48,11 U/g) ở độ mịn cơ chất 0,1 mm. Tương tự, hàm lượng protein đạt cao nhất (3,52 mg/g) ở độ mịn cơ chất 2 mm; và chỉ đạt 2,98 mg/g ở độ mịn cơ chất 1 mm (Hình 5a). Hoạt độ riêng enzyme L-asparaginase cũng có sự khác biệt giữa các độ mịn cơ chất khác nhau (Hình 5b). Hoạt độ riêng enzyme L-asparaginase đạt 21,26 UI/mg ở độ mịn cơ chất 2 mm đạt thấp nhất (14,36 UI/mg) ở độ mịn cơ chất 0,1 mm. Sinh khối nấm thu được giữa các độ mịn cơ chất khác nhau dao động trong khoảng 9,65 - 10,21 g/keo. Cụ thể, sinh khối nấm thu được cao nhất 10,21 g/keo ở độ mịn cơ chất 5 mm và thấp nhất 9,65 g/keo ở độ mịn cơ chất 1 mm (Hình 5b). 100 4 35 Hoạt độ riêng enzyme (UI/mg) 12 Hoạt tính enzyme (U/g) Hàm lƣợng protein (mg/g) Sinh khối nấm (g/keo) Hoạt độ riêng enzyme (UI/mg) 10.17 10.21 3,52 9.85 3,35 30 9.65 2,98 3,25 Sinh khối nấm (g/keo) 80 Hàm lƣợng protein (mg/g) 74,85 Hoạt tính enzyme (U/g) 9 25 (a) 60,09 3 (b) 21.26 60 50,29 20 18.49 48,11 16.88 6 14.36 40 15 2 10 3 20 5 0 1 0 0 ɸ = 0,1 mm ɸ = 1 mm ɸ = 2 mm ɸ = 5 mm ɸ = 0,1 mm ɸ = 1 mm ɸ = 2 mm ɸ = 5 mm Kích thƣớc cơ chất (mm) Kích thƣớc cơ chất (mm) Hình 5. Ảnh hƣởng của kích thƣớc cơ chất đến hàm lƣợng protein và hoạt tính của enzyme L-asparaginase (a); hoạt độ riêng của enzyme L-asparaginase và sinh khối nấm (b). Kết quả cho thấy, độ mịn chất nền 2 mm cho hiệu quả sản xuất L-asparaginase cao nhất. Do vậy, 2 mm < độ mịn chất nền < 2 mm đều làm giảm quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase. Điều này được giải thích là do sự liên kết của hạt với không khí và diện tích bề mặt hạn chế tạo thuận lợi cho vi sinh vật bám vào (Anil et al., 2017). 3.5. Ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng đến quá trình sản xuất enzyme L- asparaginase Độ ẩm ban đầu đóng vai trò quan trọng trong sản xuất enzyme bằng phương pháp lên men bán rắn. Tối ưu hóa độ ẩm có thể được sử dụng để điều chỉnh và thay đổi hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. Độ ẩm của chất nền cao dẫn đến giảm độ xốp, khuếch tán oxy thấp hơn, tăng nguy cơ nhiễm vi khuẩn, tăng cường hình thành sợi nấm, giảm thể tích khí, giảm trao đổi khí và thay đổi chất lượng của lignin. Ngược lại, độ ẩm thấp có thể dẫn đến giảm độ hòa tan các chất dinh dưỡng vào cơ chất, mức độ trương thấp hơn và độ căng của nước cao hơn (Varalakshmi và Raju, 2013). Độ ẩm khác nhau của cơ chất làm thay đổi hoạt tính enzyme L-asparaginase, thể hiện cao nhất (85,67 U/g) ở độ ẩm 70% và thấp nhất (45,36 U/g) ở độ ẩm 30%. Tương 222
tự, hàm lượng protein thay đổi ở các độ ẩm khác nhau của cơ chất, đạt cao nhất (3,34 mg/g) ở độ ẩm 90% và thấp nhất (3,09 mg/g) ở độ ẩm 70% (Hình 6a). Hoạt độ riêng enzyme L-asparaginase có sự khác biệt ở các độ ẩm khác nhau (Hình 6b). Hoạt độ riêng enzyme L-asparaginase đạt 27,72 UI/mg ở độ ẩm 70%; đạt thấp nhất (14,54 UI/mg) ở độ ẩm 30%. Sinh khối nấm thu được giữa các mức độ ẩm khác nhau dao động trong khoảng 9,99 - 10,15 g/keo, cao nhất ở độ ẩm 90% (Hình 6b). Kết quả nghiên cứu tương tự Varalakshmi và Raju (2013) cho rằng, nấm Aspergillus terreus sản xuất enzyme L-asparaginase cao nhất ở điều kiện độ ẩm 70%, đạt hàm lượng 185,3 U/g. Hơn nữa, Mishra (2006) cho rằng, độ ẩm 70% là tối ưu cho quá trình sản xuất L-asparaginase bởi nấm Aspergillus niger. Hơn nữa, Hosamani và Kaliwal (2011) cho rằng, độ ẩm 70% là tối ưu cho quá trình sản xuất L-asparaginase bởi nấm Fusarium equiseti. 100 Hoạt tính enzyme (U/g) Hàm lƣợng protein (mg/g) 4 35 Hoạt độ riêng enzyme (UI/mg) Sinh khối nấm (g/keo) 15 Hoạt độ riêng enzyme (UI/mg) 85,67 30 27,72 3,12 3,22 (b) Sinh khối nấm (g/keo) 3,09 80 10,15 12 Hàm lƣợng protein (mg/g) 3,34 9,78 Hoạt tính enzyme (U/g) 25 10,02 70,16 61,38 3 60 (a) 20 9,99 18,38 9 21,79 45,36 14,54 15 6 40 2 10 20 3 5 0 1 0 0 30% 50% 70% 90% 30% 50% 70% 90% Độ ẩm cơ chất (%) Độ ẩm cơ chất (%) Hình 6. Ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng đến hàm lƣợng protein và hoạt tính của enzyme L-asparaginase (a); hoạt độ riêng của enzyme L-asparaginase và sinh khối nấm (b). 3.6. Ảnh hƣởng của mật số tế bào đến quá trình sản xuất enzyme L- asparaginase Trong quá trình lên men bán rắn, mật số tế bào ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến quá trình sản xuất enzyme (Anil et al., 2017). Hoạt tính enzyme L-asparaginase có sự khác biệt giữa các mật số tế bào ban đầu khác nhau (Hình 7a), thể hiện cao nhất (98,69 U/g) ở mật số tế bào ban đầu 107 tế bào/mL và thấp nhất (45,36 U/g) ở độ ẩm 30%. Tương tự, hàm lượng protein thay đổi ở các mật số tế bào ban đầu khác nhau, đạt cao nhất (3,76 mg/g) ở mật số tế bào ban đầu 108 tế bào/mL và thấp nhất (3,34 mg/g) ở mật số tế bào ban đầu 104 tế bào/mL (Hình 7a). Hoạt độ riêng enzyme L-asparaginase có sự khác biệt ở các mật số tế bào ban đầu (Hình 7b). Hoạt độ riêng enzyme L-asparaginase đạt 29,28 UI/mg khi mật số tế bào ban đầu 107 tế bào/mL; đạt thấp nhất (14,30 UI/mg) ở mật số tế bào ban đầu 104 tế bào/mL. Sinh khối nấm thu được giữa các mật số tế bào ban đầu khác nhau dao động trong khoảng 9,59-10,11 g/keo g/keo, cao nhất ở mật số tế bào ban đầu 106 tế bào/mL (Hình 7b). Kết quả nghiên cứu cho thấy, mật số tế bào ban đầu 107 tế bào/mL cho quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase cao nhất nhưng khi gia tăng mật số tế bào ban đầu 223
làm giảm quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase. Điều này có thể là do sự suy giảm các chất dinh dưỡng trong một thời gian ngắn hơn, dẫn đến giảm hoạt động trao đổi chất (Kashyap et al., 2002). Nhìn chung, mật số tế bào ban đầu thấp hơn đòi hỏi thời gian dài hơn để các tế bào nhân lên và có thể không đủ để bắt đầu tăng trưởng vi sinh vật và sản xuất enzyme, trong khi đó việc tăng mật số tế bào ban đầu sẽ đảm bảo tăng sinh nhanh chóng và tổng hợp enzyme tiếp theo (Sabu et al., 2005). 120 4 35 Hoạt độ riêng enzyme (UI/mg) 15 Hoạt tính enzyme (U/g) Hàm lƣợng protein (mg/g) Sinh khối nấm (g/keo) Hoạt độ riêng enzyme (UI/mg) 98.69 30 29,28 100 3.76 Sinh khối nấm (g/keo) (a) (b) 12 Hàm lƣợng protein (mg/g) Hoạt tính enzyme (U/g) 10,11 10,09 3.69 25 80 67.98 10,02 9,98 9 3.59 20 9,59 18,08 58.49 62.13 17,31 60 15,85 14,30 47.75 3.37 15 6 40 3.34 10 3 20 5 0 3 0 0 10ˆ⁴ 10ˆ⁵ 10ˆ⁶ 10ˆ⁷ 10ˆ⁸ 10ˆ⁴ 10ˆ⁵ 10ˆ⁶ 10ˆ⁷ 10ˆ⁸ Mật số tế bào (tế bào/mL) Mật số tế bào (tế bào/mL) Hình 7. Ảnh hƣởng của mật số tế bào đến hàm lƣợng protein và hoạt tính của enzyme L-asparaginase (a); hoạt độ riêng của enzyme L-asparaginase và sinh khối nấm (b). 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian lên men lên men đến quá trình sản xuất enzyme L-asparaginase Thời gian lên men là một yếu tố quan trọng khác để tối ưu hóa quá trình sản xuất lovastatin trong quá trình lên mem bán rắn. Thời gian lên men ngắn có thể góp phần hiệu quả để tăng lợi nhuận khi sản xuất ở quy mô công nghiệp (Sadia et al., 2017). Hoạt tính enzyme L-asparaginase có sự khác biệt giữa các thời gian lên men khác nhau (Hình 8a), thể hiện cao nhất (147,74 U/g) ở thời gian lên men là 4 ngày và thấp nhất (52,19U/g) ở thời gian lên men là 3 ngày. Tương tự, hàm lượng protein thay đổi ở các thời gian lên men khác nhau, đạt cao nhất (4,19 mg/g) ở thời gian lên men là 4 ngày và thấp nhất (3,01 mg/g) ở thời gian lên men 7 ngày (Hình 8a). Hoạt độ riêng enzyme L-asparaginase có sự khác biệt ở các thời gian lên men khác nhau (Hình 8b). Hoạt độ riêng enzyme L-asparaginase đạt 35,26 UI/mg khi thời gian lên men là 4 ngày; đạt thấp nhất (15,77 UI/mg) ở thời gian lên men 3 ngày. Sinh khối nấm thu được giữa các thời gian lên men khác nhau dao động trong khoảng 8,92- 10,03 g/keo, cao nhất ở thời gian lên men 5 ngày (Hình 8b). Quá trình lên men sau 5 ngày lên men cho thấy sự giảm sản xuất enzyme L- asparaginase, có thể là do sự bất hoạt của enzyme do sự hiện diện của một loại hoạt động phân giải protein hoặc sự tăng trưởng của sinh vật có thể đã đạt đến giai đoạn mà nó không thể cân bằng được nữa, tăng trưởng ổn định với sự sẵn có của chất dinh dưỡng trong môi trường. Hơn nữa, hoạt động của enzyme giảm có thể là do cạn kiệt chất dinh dưỡng, tích lũy các sản phẩm độc hại không mong muốn (Varalakshmi và Raju, 2013) và do sự biến tính của enzyme do tương tác với các thành phần khác trong môi trường hoặc do sự suy giảm các chất dinh dưỡng kích thích sản xuất các chất 224
chuyển hóa thứ cấp, dẫn đến sản lượng enzyme thấp hơn (Ramachandran et al., 2004). Kết quả nghiên cứu tương tự Varalakshmi và Raju (2013) cho rằng, nấm Aspergillus terreus sản xuất enzyme L-asparaginase cao nhất ở thời gian lên men là 4 ngày, đạt hàm lượng 169,46 U/g. Mishra (2006) và Kumar et al. (2013) cho rằng, nấm Aspergillus niger và Cladosporium sp. sản xuất enzyme L-asparaginase cao nhất vào ngày 4 và 5 sau khi lên men. Hơn nữa, Anil et al. (2017), nấm Fusarium culmorum sản xuất enzyme L-asparaginase cao nhất vào ngày 6 sau khi lên men. 200 Hoạt tính enzyme (U/g) Hàm lƣợng protein (mg/g) 5 50 Hoạt độ riêng enzyme (UI/mg) Sinh khối nấm (g/keo) 12 Hoạt độ riêng enzyme (UI/mg) 4.19 9,86 (a) 3.89 (b) 9,35 9,26 Sinh khối nấm (g/keo) 160 147.74 4 40 10,03 Hàm lƣợng protein (mg/g) Hoạt tính enzyme (U/g) 3.34 35,26 9 8,92 3.31 120 3.01 3 30 23,25 23,31 6 85.2 21,90 77.65 80 70.15 2 20 15,77 52.19 3 40 1 10 0 0 0 0 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày Thời gian lên men (ngày) Thời gian lên men (ngày) Hình 8. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hàm lƣợng protein và hoạt tính của enzyme L-asparaginase (a); hoạt độ riêng của enzyme L-asparaginase và sinh khối nấm (b). 4. Kết luận Nấm Aspergillus terreus SF-981 là nguồn sản xuất enzyme L-asparaginase trong tự nhiên và điều kiện thích hợp cho quá trình lên men bán rắn của nấm là môi trường Czapek‘s Dox broth cải tiến, pH = 8, cơ chất bã đậu nành, độ mịn cơ chất 2 mm, độ ẩm lên men 70%, mật số tế bào 107 tế bào/mL và thời gian lên men (4 ngày) cho hoạt tính enzyme, hàm lượng protein, hoạt độ riêng enzyme và sinh khối nấm đạt cao nhất lần lượt là 147,74 U/g; 4,19 mg/g; 35,26 IU/mg và 11,19 g/keo. Nghiên cứu đánh giá hiệu quả sinh học của enzyme L-asparagianse trong điều kiện in vitro và in vivo. Lời cảm ơn Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang đã hỗ trợ và tạo điều kiện để nhóm nghiên cứu thực hiện. Tài liệu tham khảo Abeer, A.E., Heba, A.E., Mona, S.S., Rania, Z. and Mostafa, H. (2017). Statistical optimization of L-asparaginase production by using Fusarium solani. Egyptian Pharmaceutical Journal, 16: 16-23. Anil, K.M., and Janakiraman, S. (2017). Solid state fermentation: An effective fermentation strategy for the production of L-asparaginase by Fusarium culmorum (ASP-87). Biocatalysis and Agricultural Bio 11: 124-130. 225
Carlos, R.S., Eduardo S., Costa, L.F. and Junior, A. (2017). Recent developments and innovations in solid state fermentation. Biotechnology research and Innovation, 1: 52-71. Coffman, A.M., Li, Q. and Ju, L.K. (2014). Effect of natural and pretreated soybean hulls on enzyme production by Trichoderma reesei. J. Am. Oil Chem. Soc. 91: 1331-1338. El-Shafei, A.M. and El-Ghonemy, DH. (2005). Screening and media optimization for enhancing L-asparaginase production, an anticancer agent from different filamentous fungi in solid state fermentation. Br Biotechnol J, 9: 1-15. Hosamani, R. and Kaliwal, B.B. (2011). Isolation, molecular identification and optimization of fermentation parameters for the production of L-asparaginase, an anticancer agent by Fusarium equiseti., Int J Microbiol Res, 3 (2): 108-119. Imada, A., Igarasi, S., Nakahama, K. and Isono, M. (1973). Lasparaginase and glutaminase activities of Microorganisms. Journal of General Microbiology, 76: 85-99. Jian, C. and Yang, Z. (2013). Solid State Fermentation for Foods and Beverages. CRC Press. Kashyap, P., Sabu, A., Pandey, A. and Szakacs, G. (2002). Extra-cellular L- glutaminase production by Zygosaccharomyces rouxii under solid state fermentation. Process Biochem. 38: 307-312. Kumar, M.N.S., Ravi, R. and Manonmani, H.K. (2013). Production and optimization of L-asparaginase from Cladosporium sp. using agricultural residues in solid substrate fermentation. Ind. Crops Prod. 43: 150-158. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1): 265-275. Mishra, A. (2006). Production of L-Asparaginase, an anticancer agent, from Aspergillus niger using agricultural waste in solid state fermentation. Applied Biochemistry and Biotechnology, 135: 33-42. Mohana, S., Shah, A., Divecha, J. and Madamwar, D. (2008). Xylanase production by Burkholderia sp. DMAX strain under solid state fermentation using distillery spent wash. Bioresour. Technol, 99: 7553-7564. Nathiya, K., Nath, S.S. and Angayarkanni, J. (2011). Screening of a high glutaminolytic producing strain and its extracellular production by solid state fermentation. Int J Pharm Biosci, 2: 297- 302. Pallem, C., Nagarjun. V. and Srikanth, M. (2011). Production of a tumor inhibitory enzyme, L-asparaginase through solid state fermentation using Fusarium oxysporum. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 7 (2): 189-192. Pandey, A. (2002). Synthesis of alpha-amylase by Aspergillus oryzae in solid state fermentation. J. Basic Microbiol. 42: 320-326 226
Prabhakar, A., Krishnaiah, K., Janaun, J. and Bono, A. (2005). An overview of engineering aspects of solid state fermentation. Malays. J. Microbiol. 1: 10-16 Ramachandrana, A., Patel, K., Francis F., Nagy, V. and Pandey, A. (2004). Coconut oil cake-a potential raw material for the production of α-amylase. Bioresource Technology, 93 (2): 169-174. Sabu, A., Pandey, A., Daud, M.J. and Szakacs, G. (2005). Tamarind seed powder and palm kernel cake: two novel agro residues for the production of tannase under solid state fermentation by Aspergillus niger ATCC 16620. Bioresour. Technol. 96: 1223-1228. Sadia, J., Meraj, M., Mahmood, S., Hameed, A., Naz, F., Hassan S. and Irfan, R. (2017). Biosynthesis of lovastatin using agro-industrial wastes as carrier substrates. Tropical Journal of Pharmaceutical Research February, 16 (2): 263- 269. Sanjotha, G. and Manawadi, S.I. (2017). Isolation, screening, optimization and production of Anti Asparaginase by fungi from karwar coastal region. Research Journal of Recent Sciences, 6 (3): 1-7. Siddalingeshwara, K.G. and Lingappa, K. (2010). Screening and optimization of L- asparaginase, a tumour inhibitor from Aspergillus terreus through solid state fermentation. J. Adv. Sci. Res. 1: 55-60. Subhan, M., Faryal, R. and Macreadie, I. (2016). Exploitation of Aspergillus terreus for the Production of Natural Statins. J Fungi. 2: 13-19, doi: 10.3390/jof2020013. Swathi, N., Kamalakumari, P.V., Girija, S.G. and Prabhakar, T. (2014). Production of L-asparaginase by solid substrate fermentation using marine fungus. BioMed. Res. Biochem. 1: 1-9. Thirumurugan, G., Moses, J. R., Leelavathy, R.,Vanapalli V. and Rajarammohan S, . (2011). Effect of Inducers and Physical Parameters on the Production of L- Asparaginase Using Aspergillus Terreus. J Bioprocess Biotechniq 1:110 doi:10.4172/2155- 9821.1000110. Varalakshmi, V. and Raju, K.J. (2013). Optimization of l-asparaginase production by Aspergillus terreus MTCC 1782 using bajra seed flour under solid state fermentation. International Journal of Research in Engineering and Technology, 2 (9): 121-129. 227