Khoá luận tốt nghiệp: Nghiên cứu vi nhân giống cây Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:45

Thêm vào BST

Báo xấu

28
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khoá luận "Nghiên cứu vi nhân giống cây Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich)" được hoàn thành với mục tiêu nhằm xác định điều kiện khử trùng và môi trường thích hợp đểvi nhân giống cây Trân châu xanh. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khoá luận tốt nghiệp: Nghiên cứu vi nhân giống cây Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH: SƯ PHẠM SINH HỌC Nghiên cứu vi nhân giống cây Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich) SINH VIÊN: NGUYỄN THỊ XUÂN THÙY
Bình Dương, tháng 5 năm 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CAO ĐẲNG NIÊN KHÓA 2014 - 2018 NGHIÊN CỨU VI NHÂN GIỐNG CÂY TRÂN CHÂU XANH (Nervilia aragoana Gaudich) Ngành: Sư phạm Chuyên ngành: Sư phạm sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS. NGUYỄN THANH THUẬN Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ XUÂN THÙY MSSV: 111C840072 Lớp : C11SH02 Bình Dương, tháng 5 năm 2014
MỤC LỤC MỤC LỤC .......................................................................................................... i DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... iii DANG MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................... iv DANH MỤC HÌNH ........................................................................................... v MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Lý do lựa chọn đề tài .................................................................................... 1 2. Mục tiêu đề tài.............................................................................................. 2 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................ 2 3.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 2 3.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................... 3 4. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 5 1.1. Lược sử phát triển của nuôi cấy mô và tế bào thực vật ............................. 5 1.2. Những ưu điểm và hạn chế của công nghệ nhân giống vô tính in vitro ..... 9 1.2.1. Ưu điểm của nhân giống vô tính in vitro ................................................ 9 1.2.2. Hạn chế của nhân giống vô tính in vitro ............................................... 10 1.3. Ứng dụng của nhân giống vô tính in vitro ở một số cây dược liệu ........ 10 1.4. Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài........................................... 11 Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................... 14 2.1. Phương pháp nghiên cứu tài liệu ............................................................ 14 2.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm .................................. 14 2.2.1. Điều kiện và môi trường nuôi cấy......................................................... 14 2.2.2. Nghiên cứu khả năng khử trùng của mẫu.............................................. 15 2.2.3. Nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro .................. 16 2.2.4. Nghiên cứu khả năng tạo củ của cây Trân châu xanh trong điều kiện in vitro .............................................................................................. 16
2.2.5. Nghiên cứu khả năng tạo lá của cây Trân châu xanh trong điều kiện in vitro ...................................................................................... 17 2.3. Phương pháp xử lý thống kê số liệu........................................................ 17 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................... 19 3.1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu ................................................................ 19 3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo cụm chồi của mẫu .......................................................................................... 20 3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BAP kết hợp với nước dừa lên khả năng tạo cụm chồi từ chồi đỉnh ........................................................ 22 3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của BAP kết hợp với nước dừa lên khả năng tạo cụm chồi từ chồi nách ........................................................ 24 3.5. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu khả năng tạo củ của cây Trân châu xanh trong điều kiện in vitro ........................................................................... 26 3.6. Thí nghiệm 6: Nghiên cứu khả năng tạo lá của cây Trân châu xanh trong điều kiện in vitro ........................................................................... 27 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ................................................................... 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 33
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Ý nghĩa BAP Benzyl amino purine DNA Deoxyribonucleotid acid WPM Woody plant medium IAA β – indolacetic acid INRA Institut National dela Recherche Agronomique
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Thành phần môi trường cơ bản WPM (Woody plant medium) .. 14 Bảng 3.1 Tỉ lệ (%) mẫu được vô trùng và nảy chồi sau 8 tuần nuôi cấy ... 19 Bảng 3.2 Sự thành lập cụm chồi từ chồi đỉnh của cây con in vitro............ 20 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BAP kết hợp với nước dừa lên khả năng tạo cụm chồi của chồi đỉnh............................................................................. 22 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BAP kết hợp với nước dừa lên khả năng tạo cụm chồi của chồi nách ............................................................................ 24 Bảng 3.5Khả năng tạo củ của cây trân châu xanh ở các môi trường nuôi cấy ........................................................................................................... 26 Bảng 3.6Khả năng tạo lá của cây trân châu xanh ở các môi trường nuôi cấy ........................................................................................................... 28
DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Củ và lá cây Trân châu xanh ............................................................ 3 Hình 3.1 Cây chồi in vitrotừ củ Trân châu xanh ........................................... 20 Hình 3.2 Chồi in vitro hình thành sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 0,5mg/l BAP ................................................................................... 22 Hình 3.3 Chồi in vitro hình thành từ đỉnh chồi sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l BAPvà 15% nước dừa ................................. 24 Hình 3.4 Chồi in vitro hình thành từ chồi nách sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l BAPvà 15% nước dừa ................................. 26 Hình 3.5Củ Trân châu xanh được hình thành sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp với 15% nước dừa .................. 27 Hình 3.6 Lá Trân châu xanh được hình thành sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp với 15% nước dừa .................. 29
MỞ ĐẦU 1. Lý do lựa chọn đề tài Ngày nay, các nguồn dược liệu quý hiếm đã và đang bị khai thác quá mức dẫn đến cạn kiệt nguồn dược liệu phục vụ công tác phòng và trị bệnh, thậm chí nhiều loài thực vật dược quý hiếm đang đứng trước nguy bị tuyệt chủng. Do đó, công tác bảo tồn và phát triển các nguồn dược liệu quý hiếm là một yêu cầu cấp bách. Nó không chỉ đáp ứng nhu cầu tạo nguồn dược liệu ổn định phục vụ công tác phòng trị bệnh mà còn góp phần bảo tồn các nguồn gen quý, ngoài ra nó còn góp phần to lớn vào sự phát triển kinh tế xã hội. Một trong những vấn đề khó khăn là nguồn nguyên liệu để thực hiện nhân giống các loài thực vật dược liệu quý hiếm hiện nay rất khan hiếm. Do đó, một số phương pháp nhân giống truyền thống như nhân giống hữu tính, nhân giống vô tính bằng chiết, ghép, giâm cành … gặp nhiều hạn chế về nguồn nguyên liệu cũng như khả năng nhân nhanh một số lượng lớn cây thuốc quý. Kỹ thuật nhân giống in vitro là một liệu pháp nhất tốt cho việc giải quyết vấn đề này, nó không những cho hiệu quả kinh tế cao trong việc nhân nhanh tạo ra một số lượng lớn cây con đồng điều, sạch bệnh mà còn giữ được những tính trạng quý của bố mẹ và cho phép chủ động cung cấp nguồn giống cũng như vật liệu vô trùng cho mọi thí nghiệm chọn dòng tế bào vào thời điểm bất kì trong năm. Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich) (tên khác: Thanh thiên quỳ xanh, Lan một lá) thuộc họ Lan (Orchidaceae) là một loại địa lan nhỏ, cao từ 10 - 20 cm. Thân rất ngắn, củ tròn to, có thể nặng tới 15 - 20 g. Thẳng từ củ, chỉ mọc lên có một lá riêng lẻ sau khi hoa tàn. Lá hình tim tròn, xếp theo các gân lá hình chân vịt, đường kính 10 - 25 cm, mép uốn lượn. Ra hoa khoảng tháng 3 - 4. Cụm hoa có cán dài 20 - 30 cm. Hoa thưa 15 - 20 cái, màu trắng hay màu vàng hơi xanh lục. Ra quả tháng 5 - 6. Loài phân bố ở Nam Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam. Ở nước ta, cây mọc trên núi đá, chỗ ẩm mát dưới bóng cây to hoặc dưới đám cỏ dày đặc ở các tỉnh từ Hoà Bình, Lạng Sơn, Kon Tum đến Sông Bé.
Ngoài giá trị về thẩm mỹ, đây còn là một loài thực vật dược quý hiếm có công dụng lợi phổi, chữa lao phổi, ho, mụn nhọt, giải độc. Bộ phận dùng là toàn bộ cây hay củ, có khi chỉ dùng lá [4]. Do đó, loài này đã bị khai thác quá mức, dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên cao trong một tương lai không xa. Theo ghi nhận của Sách đỏ Việt Nam, Trân châu xanh ở mức V – sẽ nguy cấp (có thể bị đe dọa tuyệt chủng) [15]. Một nghiên cứu mới đây của Reddy và cộng sự cho thấy cao chiết N. aragoana bằng dung môi ethyl acetate có tác dụng kháng nấm và chống oxi hóa [22]. Từ những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu vi nhân giống cây Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich)”. 2. Mục tiêu đề tài Xác định điều kiện khử trùng và môi trường thích hợp đểvi nhân giống cây Trân châu xanh 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Cây Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich) thu nhận trong tự nhiên thuộc: Chi: Nervilia Lớp: Monocoty Họ: Orchidaceae Bộ: Orchidalesledonae Ngành: Magnoliophyta
Hình 3.1 Củ và lá cây Trân châu xanh 3.2 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu điều kiện khử trùng và môi trường tối ưu nhân giống vô tính in vitro cây Trân châu xanh. Quá trình nghiên cứu được diễn ra tại phòng thực hành Sinh học, khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Thủ Dầu Một. 4. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu điều kiện và môi trường nuôi cấy Môi trường WPM có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau tuỳ theo mục đích của từng thí nghiệm.Nguồn carbon là đường saccharose.Môi trường được làm đặc bằng agar. Môi trường nuôi cấy được khử trùng ở 121oC trong 18 phút. - Nghiên cứu điều kiện khử trùng
Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất khử trùng cũng như nồng độ và thời gian khử trùng để thu được các mẫu vô trùng có khả năng sinh trưởng tốt nhất và tỷ lệ sống cao nhất. - Nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, kết hợp với nước dừa lên khả năng tạo cụm chồi in vitro của mẫu. - Nghiên cứu khả năng tạo củ của chồi in vitro Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nước dừa, nguồn mẫu cho việc tạo củ của chồi in vitro. - Nghiên cứu khả năng tạo lá của chồi in vitro Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nước dừa, nguồn mẫu cho việc tạo lá của chồi in vitro.
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lược sử phát triển của nuôi cấy mô và tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật nhanh chóng đi vào thực tiễn cuộc sống. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật được bao hàm trong ứng dụng của công nghệ Sinh học. Nó bao gồm nhân giống và nhân nhanh giống, sản xuất sinh khối các sản phẩm sinh hóa, sản xuất và chuyển hóa sinh học các dược liệu tự nhiên, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý, cải thiện và tạo giống cây trồng, nghiên cứu bệnh học thực vật, làm sạch virus...[5]. Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm "tế bào - Cell". Anton Van Leuwen Hoek (1632 - 1723) thiết kế kính hiển vi khuyếch đại được 270 lần, lần đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn, tế bào tinh trùng trong tinh dịch người và động vật. Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là Học thuyết tế bào: + Mọi cơ thể sống được cấu tạo bởi một hoặc nhiều tế bào. + Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức nhỏ nhất của sự sống. + Tế bào chỉ được tạo ra từ tế bào tồn tại trước đó. Năm 1898, Haberlandt tiến hành nuôi cấy tế bào đơn tính, các tế bào này tách từ nhu mô lá, tượng tầng của tầng biểu bì và lông hút của nhiều loài thực vật, kết quả thu được là không thành công. Năm 1902, Haberlandt để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào ông đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật. Theo ông, mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào điều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành
một cá thể hoàn chỉnh. Điều đó, theo kiến thức sinh học hiện đại có nghĩa là: Mỗi tế bào riêng lẻ của một cơ thể đa bào chứa đầy đủ toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh. Tuy nhiên, Haberlandt đã không thành công trong thí nghiệm chứng minh toàn năng của tế bào do ông đã chọn cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, mặt khác do ông lại dùng các tế bào đã mất hết khả năng tái sinh. Một nguyên nhân khác nữa của sự thất bại là do vào thời kỳ đó những hiểu biết khoa học về nhu cầu dinh dưỡng của mô thực vật còn rất hạn chế nên ông đã không tìm ra được môi trường dinh dưỡng tối thích cho sự phân chia của tế bào [1, 13, 14]. Phải mất hàng chục năm sau mới có những thí nghiệm thành công để chứng minh cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào. Nổi bật là các công trình sau: Năm 1922, Kotte và cs đã nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ của cây hòa thảo và đã tạo được một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Nhưng sau một thời gian ngắn thì hệ rễ này phát triển chậm dần và ngừng lại [24]. Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, 1 hoocmon thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào [21]. Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục [6]. Năm 1941, Overbeek và cs đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cây cà rốt Datura. Năm 1951, Nitsch đã khắc phục được tính không giao hợp tiền giao tử khi nghiên cứu và thành công trong nuôi cấy mô quả bầu non, cà chua, dưa chuột và lần đầu tiên tạo được hạt trong quả cà chua in vitro có khả năng nảy mầm (hạt có sức sống). Sau này có rất nhiều nhà khoa học thành công trong nuôi cấy hạt
phấn, các quá trình sinh trưởng của ống phấn, thụ tinh và tạo thành quả trong điều kiện in vitro. Năm 1955, Miller và cs đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy. Đến năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi). Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/ nồng độ kinetin) nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô có xu hướng tạo chồi. Ngược lại khi nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và càng lớn, mô có xu hướng tạo rễ. Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hoá cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh. Năm 1958, Reinert và Steward tạo được phôi và cây cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy trong dung dịch. Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật. Cũng trong năm 1960, Cocking lần đầu tiên sử dụng enzym phân giải thành tế bào và đã tạo ra số lượng lớn tế bào trần. Kỹ thuật này sau đó đã được hoàn thiện để tách nuôi tế bào trần ở nhiều cây trồng khác nhau. Năm 1962, Kante và cs. Thông báo về khả năng thụ phấn trong điều kiện in vitro của cây thuốc phiện (Papaver inoxia). Năm 1966, ông tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. Năm 1967, nhóm Bourgin và Nitsch lại thành công khi tạo cây đơn bội từ túi phấn thuốc lá. Những thành công này đã khiến giới khoa học bắt đầu chú ý đến việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn. Việc này đã đóng góp rất nhiều kiến thức cho lĩnh vực di truyền thực vật và thực tiễn chọn giống. Năm 1966, Morel hoàn thành quy trình nhân nhanh cây hoa lan thuộc chi Cymbidium. Ý tưởng của ông được thai ngén từ năm 1960 khi ông ngẫu nhiên quan sát sự sinh trưởng và phát triển của chồi ngọn cây lan trong lúc cố tìm cách để làm sạch bệnh cây lan giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật..
Năm 1970, Nagata và Takebe đã sử dụng kỹ thuật tế bào của Bergman để nuôi cấy protoplast của cây thuốc lá và tái sinh được cây hoàn chỉnh. Cho đến nay, kỹ thuật protoplast đã được thực tế xác nhận sau nhiều công bố lai thành công giữa các loài, một việc không thể thực hiện được bằng lai hữu tính cổ điển. Protoplast giúp cho sự nghiên cứu hiện tượng nhiễm sắc thể hòa hợp của các tế bào khác loài sau khi dung hợp, giúp cho việc nghiên cứu vai trò của các DNA trong các cơ quan tử và quan hệ của chúng với DNA trong phân bào. Tính đến ngày 1/1/1985 kỹ thuật dung hợp protoplast đã thu được 104 trường hợp lai, bao gồm con lai trong loài, con lai giữa các loài, con lai giữa các chi và con lai giữa các chi phụ. Đến 1995, con số trên đã gấp hai lần. Điều đó chứng tỏ kỹ thuật dung hợp protoplast đã trợ giúp rất hiệu quả cho công tác chọn tạo giống. Từ năm 1980 đến nay là giai đoạn thành công của lĩnh thực công nghệ gene thực vật. Đó là kỹ thuật đưa một gene cần thiết có nguồn gốc từ vi sinh vật, thực vật và động vật hay một gene tổng hợp vào các giống cây trồng muốn cải tạo. Chỉ trong một thời gian ngắn hàng loạt phương pháp đưa gene ngoại lai vào thực vật được công bố. Ngoài phương pháp chuyển gene thông qua vi khuẩn Agrobacterium, các phương pháp chuyển gene trực tiếp như kỹ thuật sử dụng điện (electroporation), kỹ thuật vi tiêm (microinjection), sử dụng siêu âm (ultrasonic gene transfer), sử dụng súng bắn gene (gene gun) đang được các phòng thí nghiệm trên thế giới phát triển mạnh và đạt được kết quả rất chắc chắn. Sau khi đưa được gene ngoại lai vào tế bào người ta sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật để nuôi cấy các tế bào đã được chuyển nạp. Sau đó cho tái sinh lại thành cây nguyên vẹn mang những đặc tính sinh học mới. Chúng sinh trưởng, phát triển, ra hoa, kết hạt bình thường và được coi như một giống cây trồng mới. Lĩnh vực công nghệ gene đã có những thành công to lớn không chỉ trên đối tượng thực vật mà còn thành công trên đối tượng động vật và vi sinh vật. Đối với thực vật, theo thống kê của Tạp chí Sinh học, thuộc mạng lưới công nghệ Sinh học Châu Á – Thái Bình Dương, tính đến tháng 12/1995 đã có hơn 50 giống cây trồng khác nhau được chuyển các gene quý như chống chịu sâu bệnh, virus và cỏ dại, chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường, gene giữ cho
quả chậm chín để vận chuyển, gene giúp cho hoa quả chống lại sự hư hại và các hạt trở nên mẩy hơn, đầy dinh dưỡng và như vậy mang lại lợi ích kinh tế phong phú hơn. Năm 1988, Toriyama thành công khi chuyển gene kháng bệnh vàng lụi (Tungro) vào protoplast lúa nhóm Japonica và tái sinh cây hoàn toàn từ protoplast chuyển gene. Năm 1991, Burbank đã thành công trong việc ghép gene miễn dịch đối với loài gián cánh cứng Colorado cho khoai tây và đã trồng thử ở một vài nơi ở Maine Oregar. Kết quả khoai tây có thể miễn dịch đặc biệt với loài gián cánh cứng [11]. Ở viện nghiên cứu Nông nghiệp Pháp (INRA), các nhà khoa học đã chuyển thành công gene Capsul vào cây thuốc lá. Các nhà khoa học của viện lúa Quốc tế (IRRI) đã chuyển thành công các gene khác nhau vào cây lúa, cụ thể là gene Bt (gene chống sâu đục thân ở lúa), gene chitinase chống bệnh do nấm gây ra như đạo ôn, khô vằn. Các giống cây trồng chuyển gene hiện đang được khảo nghiệm và trồng trong điều kiện nhà kính tại Công ty Di truyền chọn giống và sản xuất hạt giống tại Bruxell (Bỉ). Ở Mỹ đã sản xuất hai loại cây trồng là cà chua cứng quả và bảo quản lâu hơn 45 ngày, loại thứ hai là giống ngô chống sâu đục thân và có năng suất cao. Thực vật chuyển gene thực tế đã trở thành hàng hóa trên thị trường. Năm 1996, người ta đã ứng dụng cho trồng trọt khoảng 18.000 km2 từ Ả Rập đến Bắc Mỹ và sản phẩm được đem bán trên thị trường với những ưu việt như bí ngô chống chịu được virus, khoai tây và bông không bị côn trùng phá hoại, bông và đậu tương chống chịu được với chất diệt cỏ. Ngô chuyển gene cũng đã được trồng đại trà và được bán rộng rãi trên thị trường châu Âu [13]. Nói tóm lại, sự phát triển như vũ bão của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật cùng với sự ra đời của công nghệ gene thực vật đã mở ra một hướng mới cho nền nông nghiệp thế giới. Với các giống cây trồng được tạo ra bằng các phương pháp này, nền nông nghiệp thế giới đang bước vào “Cuộc cách mạng xanh lần thứ hai”, góp phần không nhỏ vào đảm bảo an toàn lương thực và nhu cầu của con người. Các nhà nông học sẽ có thêm một phương pháp mới trong việc cải tạo tự nhiên.
1.2 Những ưu điểm và hạn chế của công nghệ nhân giống vô tính in vitro 1.2.1 Ưu điểm của nhân giống vô tính in vitro - Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kì đều có thể tạo ra một quần thể đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền. - Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ nhân giống vô tính in vitro đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong vòng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây. - Sản phẩm cây giống đồng nhất: Nhân giống vô tính in vitro về cơ bản là công nghệ nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đồng điều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gene dị hợp hay đồng hợp. - Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống. - Nâng cao chất lượng cây trồng: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để loại trừ virus, nấm, vi khuẩn khỏi các cây trồng đã nhiễm bệnh. Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng nuôi cấy mô thường tăng năng suất 15-30% so với giống gốc. - Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác nhau có thể tạo ra từ hệ thống nhân giống vô tính in vitro như cây con in vitro hoặc trong bầu đất. Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay là thân củ. - Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác định là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các quy định về sinh thực vật quốc tế.
- Sản xuất quanh năm: Quátrình sản xuất có thể được tiến hành vào bất kì thời gian nào, không phụ thuộc vào mùa vụ [12]. 4.2.1 Hạn chế của nhân giống vô tính in vitro - Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng nhân giống vô tính in vitro. Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gene. Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải quyết. - Chi phí sản xuất cao: Nhân giống vô tính in vitro đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo. Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt. - Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỉ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài làm tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền [12]. 1.3 Ứng dụng của nhân giống vô tính in vitro ở một số cây dược liệu Hiện nay, việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nhân nhanh các loại cây trồng đã được áp dụng rộng rãi, nhưng chủ yếu phổ biến ở các loại cây ăn quả cũng như các loại hoa kiểng. Gần đây, việc ứng dụng các thành tựu công nghệ sinh học trong nhân giống, tạo dược liệu in vitro ở các loài cây thuốc quý đang được quan tâm và đã đạt một số thành tựu [5]. Sau gần 2 năm nghiên cứu, Dương Tấn Nhựt, Phó viện trưởng Viện Sinh học Tây Nguyên (Đà Lạt, Lâm Đồng) đã thành công trong việc nhân giống sâm
Ngọc Linh bằng phương pháp phát sinh phôi vô tính. Từ mô tế bào của lá, thân, củ, rễ được nuôi cấy sau khi đem cấy trong phòng thí nghiệm thời gian 2 – 3 tháng sẽ cho những cây con cao khoảng 10cm. Lúc đó có thể đem ra môi trường tự nhiên để trồng. Mỗi phôi nuôi cấy sẽ tạo được nhiều cây con. Không chỉ tạo ra cây giống sâm con từ kỹ thuật phát sinh phôi vô tính, Dương Tấn Nhựt còn tạo ra dược liệu từ cây sâm, mà không cần phải lấy từ củ sau nhiều năm trồng. Tuy nhiên, vẫn cần nhiều thời gian để kiểm chứng khả năng tác dụng của sâm nhân giống bằng phương pháp này với sâm có nguồn gốc tự nhiên [18]. Kỹ thuật nhân giống in vitro ở Đại học Huế cũng giúp bảo tồn và tạo ra nhiều cây dược liệu. Điển hình là cây qua lâu - một loài dược liệu quý chứa nhiều hợp chất hóa học có giá trị như các loại protein có thể kháng virus. Mẫu cây qua lâu để nhân giống được lấy từ Vườn Quốc gia Bạch Mã rồi khử trùng, sau đó đưa vào môi trường nuôi cấy. Sau 4 tuần nuôi cấy, tỷ lệ cây nảy chồi tới 88%. Cây con giống qua lâu đã được trồng phổ biến trên đất thịt, cát cho tỷ lệ sống và năng suất cao. Ngoài ra, kỹ thuật nhân giống in vitro còn thành công với các cây dược liệu khác như nha đam (lô hội) cho tỷ lệ sống đến 75%; đặc biệt là sử dụng kỹ thuật nhân giống in vitro để tái sinh chồi và cụm chồi trong nuôi cấy cây hà thủ ô đỏ...[19] Ngoài ra, việc ứng dụng kỹ thuật này còn góp phần chuẩn hóa nguồn giống và nguyên liệu làm giống cây dược liệu, đáp ứng yêu cầu của tiêu chuẩn GAP (Good Agriculture Practices): Đúng giống cây trồng (danh pháp, giống trồng trọt), chất lượng giống được đảm bảo theo tiêu chuẩn ngành (có xuất xứ, nơi sản xuất, tiêu chuẩn đạt yêu cầu). Tự sản xuất giống có hồ sơ đầy đủ quá trình sản xuất và đánh giá giống theo tiêu chuẩn ngành. Quản lý và kiểm soát được nguồn bệnh trong quá trình sản xuất, lưu trữ và lưu thông giống [6]. Trong bối cảnh ngành Dược đang xây dựng tiêu chuẩn GMP (Good Manufacturing Practices) cho các nhà máy sản xuất dược phẩm thì vấn đề tiêu chuẩn hóa nguyên liệu thuốc đặc biệt là dược liệu trở nên cấp bách hơn bao giờ hết.
Những thành tựu như thế này sẽ mở ra những hướng đi đầy hứa hẹn trong tương lai, góp phần giải quyết những vấn đề bức thiết trong việc tạo nguồn dược liệu, bảo tồn thiên nhiên, cũng như thúc đẩy phát triển kinh tế xã hội. 1.4 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài Nuôi cấy mô thực vật (nuôi cấy thực vật in vitro) là quá trình nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các kỹ thuật nuôi cấy các bộ phận khác nhau (tế bào, mô, cơ quan...) trong môi trường nhân tạo dưới điều kiện vô trùng. Kỹ thuật in vitro dựa trên nguyên lý là tế bào thực vật có tính toàn năng, nghĩa là từ một mô, một cơ quan hay một tế bào của bất kỳ bộ phận nào của cây đều có thể phát triển thành một cây hoàn chỉnh nếu được nuôi trong môi trường thích hợp [16]. Năm 1960, Morel trong lúc tìm cách làm sạch bệnh cho cây hoa lan bằng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh đỉnh đã nhận thấy khả năng sinh sản, đâm chồi một cách tự nhiên của các mô phân sinh ngọn của một số loại hoa lan. Và cuối cùng, Morel (1966) đã thành công trong việc nhân nhanh in vitro cây hoa lan thuộc chi Cymbidium. Trên thế giới, nhiều loài lan thuộc các chi như Cymbidium, Dendrobium, Epidendrum, Laeliocattleya, Acampe… đã được nhân giống vô tính in vitro thành công. Đối với chi Nervilia, có nhiều báo cáo của các tác giả Trung Quốc thành công trong việc nhân giống vô tính như He Fuchang và cs (1990), Pan Xue feng và cs (2001), Chen Jenn-Yih và cs (2002), Du Qin và cs (2005), Li Bin (2008) [17, 18, 19, 20]. Năm 2009, báo cáo của Li ShouLing và cộng sự cho thấy môi trường MS có bổ sung 2.0 mg/l 6-BA, 0.1 mg/l NAA, 10% nước dừa và 0.1% than hoạt tính thích hợp để tạo chồi, còn môi trường MS bổ sung 2.0 mg/l 6-BA và 0.5 mg/l NAA thích hợp để tạo rễ [23]. Ngày nay, bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã nhân giống và phục tráng hàng loạt các cây trồng có giá trị như khoai tây, thuốc lá, dứa, các cây lương thực, cây ăn quả, cây cảnh, cây dược liệu... Việc nhân giống này đã trở thành công nghệ và đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới.