Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen, Araliaceae) trồng ở Việt Nam trước và sau chế biến

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:216

Thêm vào BST

Báo xấu

15
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Dược học "Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen, Araliaceae) trồng ở Việt Nam trước và sau chế biến" nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến hấp nhiệt đến hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất; Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất; Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của cao định lượng sau hấp nhiệt.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen, Araliaceae) trồng ở Việt Nam trước và sau chế biến

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU BÙI THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG U THỰC NGHIỆM CỦA RỄ CỦ TAM THẤT (PANAX NOTOGINSENG (BURK.) F.H. CHEN, ARALIACEAE) TRỒNG Ở VIỆT NAM TRƯỚC VÀ SAU CHẾ BIẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU BÙI THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG U THỰC NGHIỆM CỦA RỄ CỦ TAM THẤT (PANAX NOTOGINSENG (BURK.) F.H. CHEN, ARALIACEAE) TRỒNG Ở VIỆT NAM TRƯỚC VÀ SAU CHẾ BIẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 972.02.05 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Vũ Mạnh Hùng GS. TS. Nguyễn Thanh Hải HÀ NỘI, NĂM 2022
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án “Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen, Araliaceae) trồng ở Việt Nam trước và sau chế biến” là công trình nghiên cứu của tôi với sự hướng dẫn khoa học của tập thể thầy hướng dẫn. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và được công bố trong các bài báo khoa học của nhóm nghiên cứu. Luận án chưa từng được công bố, không trùng lặp với luận văn, luận án hoặc bất kỳ công trình nghiên cứu khoa học của các tác giả nào khác. Nếu có điều gì sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, ngày 25 tháng 7 năm 2022 Tác giả Bùi Thị Thu Hà
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện Luận án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, động viên từ các thầy cô giáo, các đồng nghiệp, gia đình và bạn bè. Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn PGS. TS. Vũ Mạnh Hùng - nguyên Chủ nhiệm Bộ môn Dược lý, Học viện Quân y và GS. TS. Nguyễn Thanh Hải - Phó Hiệu trưởng trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo, định hướng, giúp đỡ tôi ngay từ những ngày đầu tiên trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn các cán bộ, nhân viên Khoa phân tích-tiêu chuẩn, Viện Dược liệu; các cán bộ, kỹ thuật viên Bộ môn Dược lý - Học viện Quân y, đã hết lòng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập, công tác. Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện Dược liệu, Thủ trưởng Bệnh viện 19-8 và Bệnh viện Y học Cổ truyền - Bộ Công an đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án. Từ đáy lòng mình, xin cảm ơn gia đình, cảm ơn chồng, các con, bố mẹ hai bên cùng toàn thể gia đình đã luôn tin tưởng, động viên, chia sẻ, ủng hộ và giúp đỡ trong mọi lúc, mọi nơi. Xin cảm ơn tất cả những người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã ủng hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án này. Xin trân trọng cảm ơn! Bùi Thị Thu Hà
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1 ........................................................................................................... 3 TỔNG QUAN ........................................................................................................ 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH UNG THƯ........................................................... 3 1.1.1. Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam ........................................... 3 1.1.2. Ung thư với đáp ứng miễn dịch ................................................................. 4 1.2. TỔNG QUAN VỀ TAM THẤT .................................................................. 11 1.2.1. Tổng quan thực vật................................................................................... 11 1.2.2. Hóa thực vật rễ củ Tam thất .................................................................... 14 1.2.3. Các tác dụng dược lý của Tam thất ......................................................... 16 1.2.3.1. Tác dụng chống ung thư ........................................................................ 16 1.2.3.2.Tác dụng tăng cường miễn dịch .............................................................. 18 1.2.3.3. Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan ....................................... 19 1.2.3.4. Các tác dụng khác .................................................................................. 21 1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG U .............................................................................................. 22 1.3.1. Các mô hình nghiên cứu in vitro .............................................................. 22 1.3.2. Các mô hình nghiên cứu in vivo ............................................................... 26 CHƯƠNG 2 ........................................................................................................ 31 CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 31 2.1. CHẤT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU........................................ 31 2.1.1. Chất liệu nghiên cứu................................................................................. 31
2.1.2.Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 35 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụngtrong nghiên cứu ............................ 35 2.1.3.1. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu .............................................. 35 2.1.3.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu .......................................................... 37 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 39 2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến bằng hấp nhiệt đến hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất............................................................. 39 2.2.1.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các saponin chính có trongcác mẫu Tam thất hấp và không hấp. ....................................................................... 39 2.2.1.2. Nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng hoạt chất trong Tam thất trước và sau khi hấp ở các điều kiện khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). ............................................................................................................................. 40 2.2.1.3. Định lượng hàm lượng saponin trong 2 mẫu cao NP(O) và NP(H) bằng HPLC ............................................................................................................................. 42 2.2.2. Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất. ................................................ 42 2.2.2.1. Đánh giá tác dụng kháng u của 6 saponin đã phân lập và cao định lượng NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người ....................................... 42 2.2.2.2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào và khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180. ............................................................... 44 2.2.2.3. Nghiên cứu tác dụng ức chế phát triển u của các cao định lượng NP(H) và NP(O) trên chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180. .................. 48 2.2.2.4. Đánh giá tác dụng của các cao định lượng NP(H) và NP(O) lên hệ miễn dịch của chuột mang khối u rắn sarcoma TG180. .............................................. 50
2.2.2.5. Đánh giá tác dụng chống oxy hoá của các cao định lượng NP(H) và NP(O) trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG180. ......................................... 52 2.2.2.6. Xác định thời gian sống thêm của chuột mang khối u rắn sarcoma TG180.53 2.2.3. Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của cao định lượng NP(H)……………………………………………………………………………...54 2.2.3.1. Đánh giá độc tính cấp của cao định lượng NP(H) trên chuột nhắt trắng ............................................................................................................................. 54 2.2.3.2. Đánh giá độc tính bán trường diễn của cao định lượng NP(H) trên chuột cống trắng............................................................................................................ 55 2.3. XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................................................... 56 2.4. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU .................................................. 56 CHƯƠNG 3 ......................................................................................................... 59 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................................... 59 3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến đến hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất ............................................................................... 59 3.1.1. Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các saponin chính có trong các mẫu Tam thất hấp và không hấp ...................................................... 59 3.1.1.1. Phân lập các saponin từ rễ củ Tam thất (dược liệu không xử lý hấp) ... 59 3.1.1.2. Phân lập các saponin rễ Tam thất sau khi hấp ở nhiệt độ cao .............. 61 3.1.1.3. Đặc trưng vật lý và dữ liệu phổ các hợp chất phân lập được ................. 64 3.1.1.4. Biện giải cấu trúc các hợp chất phân lập từ rễ củ Tam thất .................. 72 3.1.2. Kết quả nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng hoạt chất trong Tam thất khi hấp ở các điều kiện khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ……………………………………………………………………………...78 3.1.2.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký ...................................................................... 78 3.1.2.2. Xây dựng đường chuẩn .......................................................................... 79
3.1.2.3. Kết quả định lượng các saponin chính từ Tam thất hấp ở các điều kiện khác nhau ..................................................................................................................... 82 3.1.3. Hiệu suất chiết cao và kết quả định lượnghàm lượng saponin trong 2 mẫu cao định lượng NP(O) và NP(H) bằng HPLC. ......................................... 86 3.1.3.1. Hiệu suất chiết cao từ các mẫu dược liệu .............................................. 86 3.1.3.2. Định lượng các mẫu cao chiết ................................................................ 87 3.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất. .......................................... 88 3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng kháng u của 6 saponin đã phân lập và cao định lượng NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người ................. 88 3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào và khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180. ...................................................... 91 3.2.2.1. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào của cao định lượng NP(H) . 91 3.2.2.2. Kết quả đánh giá khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180. ........................................................................................ 94 3.2.3. Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng u của các cao định lượng NP(H) và NP(O) trên chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180..................... 97 3.2.3.1. Kết quả tạo mô hình khối u sarcoma TG 180 trên chuột ....................... 97 3.2.3.2. Ảnh hưởng của cao định lượng NP(H) và NP(O) đến trọng lượng cơ thể của chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180. ..................................................... 98 3.2.3.3. Ảnh hưởng của cao định lượng NP(H) và NP(O) đến sự phát triển khối u rắn sarcoma TG 180......................................................................................... 99 3.2.4. Kết quả đánh giá tác dụng của cao định lượng NP(H) và NP(O) lên miễn dịch trên chuột mang khối u rắn Sarcoma TG180 ......................................... 103
3.2.4.1. Kết quả đánh giá số lượng và công thức bạch cầu trong máu chuột .. 103 3.2.4.2. Kết quả đánh giá nồng độ IL-2 và TNF-α máu. ................................... 104 3.2.4.3. Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu huyết học .......................................... 105 3.2.4.4. Kết quả đánh giá cân nặng của lách và tuyến ức ................................ 107 3.2.5. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa củacao định lượngNP(H) và NP(O)trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180. ..................................... 108 3.2.5.1. Hàm lượng MDA, GSH, SOD và CAT trong gan chuột mang khối u rắn sarcoma TG180. ................................................................................................ 108 3.2.5.2. Hoạt độ các enzym ALT, AST trong máu chuột mang khối u rắn sarcoma TG180. ................................................................................................ 110 3.2.5.3. Ảnh hưởng của cao định lượng NP(H) và NP(O) đối với hình thái đại thể và vi thể của gan chuột trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180. ...... 111 3.3.6. Kết quả đánh giá tác dụng kéo dài thời gian sống thêm của cao định lượng NP(H) và NP(O) trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180. ......... 113 3.4. Kết quả đánh giá độc tính của cao định lượng NP(H) ............................. 116 3.4.1. Kết quả xác định độc tính cấp (LD50) của NP(H) ................................ 116 3.4.2. Kết quả đánh giá độc tính bán trường diễn của NP(H)........................ 117 CHƯƠNG 4 ....................................................................................................... 126 BÀN LUẬN ....................................................................................................... 126 4.1. Về ảnh hưởng của phương pháp chế biến hấp nhiệt đến hàm lượng các saponin của rễ củ Tam thất ............................................................................. 128 4.1.1. Hàm lượng saponin của Tam thất chưa hấp ......................................... 128 4.1.2. Hàm lượng saponin của Tam thất sau hấp ........................................... 129 4.1.3. Ảnh hưởng của các điều kiện hấp nhiệt đến hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất ............................................................................................................ 130
4.2. Về tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất. ............................................................... 132 4.2.1. Về tác dụng kháng u của 6 saponin đã phân lập và cao định lượng NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người ................................... 132 4.2.2. Về kết quả đánh giá khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180. ..................................................................................... 134 4.2.3. Về kết quả nghiên cứu tác dụng kháng u của các cao định lượng NP(H) và NP(O) trên chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180. ............. 136 4.2.3.1. Về mô hình nghiên cứu ........................................................................ 136 4.2.3.2. Về liều dùng của cao định lượng NP(H) và NP(O).............................. 138 4.2.4. Về tác dụng của cao định lượng NP(H) và NP(O) lên miễn dịch trên chuột mang khối u rắn Sarcoma TG180 ......................................................... 141 4.2.5. Về kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180................................................................................................ 145 4.2.6. Về tác dụng kéo dài thời gian sống thêm của chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180................................................................................................ 147 4.3. Về kết quả đánh giá độc tính của cao định lượng NP(H). ....................... 153 4.3.1. Về độc tính cấp của cao định lượng NP(H). .......................................... 153 4.3.2. Về độc tính bán trường diễn của cao định lượng NP(H). ..................... 154 KẾT LUẬN ........................................................................................................ 159 KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 161 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Viết tắt Viết đầy đủ tiếng nước ngoài Viết đầy đủ tiếng Việt 1 ALT Alanine aminotransferase 2 AST Aspartate aminotransferase 3 AKP Alkaline Phosphatase 4 CAT Catalase 5 CC Column chromatography Sắc kí cột 6 CHO Cholesterol 7 ĐCSH Đối chứng sinh học Electron Spray Ionization Mass Phổ khối lượng phun mù 7 ESI-MS Spectrometry điện tử 8 GC Gas Chromatography Sắc kí khí 9 GSH Glutathione reductase High-density lipoprotein Cholesterol trọng lượng phân 10 HLD cholesterol tử cao 11 HE Haematoxylin and eosin High Performance Liquid 12 HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao Chromatography 13 IL-2 Interleukin-2 14 IR Infra red Phổ hồng ngoại 15 LD50 Lethal dose, 50% Liều gây chết trung bình Low-density lipoprotein Cholesterol trọng lượng phân 16 LDL cholesterol tử thấp 17 LTN Lô uống thuốc tham chiếu 18 MDA Malondialdehyde Major Histocompatibility Phức hợp kháng nguyên phù 19 MHC Complex hợp tổ chức của người
20 MP Melting point Điểm nóng chảy 21 MS Mass spectrometry Khối phổ 22 NK Natural killer cell Tế bào tiêu diệt tự nhiên 23 NMR Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 24 OA Oleanolic acid 25 OD Optical Density Mật độ quang học 26 OT Otillol 27 PPD Protopanaxadiol 28 ROS Reactive oxygen species 29 SL Lô chứng sinh lý 30 SOD Superoxide dismutase 31 SRB Sulforhodamine B 32 TC Triglycerid 33 TCL Cytotoxic T lymphocyte Tế bào T gây độc 34 TLCT Trọng lượng cơ thể 35 TG Total Cholesterol Cholesterol toàn phần 36 TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng 37 TNF α Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u 38 UT Lô gây u không điều trị 39 UV-VIS Ultraviolet-Visible Tử ngoại – Khả kiến
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng 1.1 Thống kê tóm tắt năm 2020 về tình hình ung thư tại Việt Nam 4 Bảng 2.1 Dải nồng độ thử nghiệm của chế phẩm NP(H) 45 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng kích thích apoptosis của Bảng 2.2 NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG 46 180 Bảng 2.3 Thang đánh giá hiệu lực kháng u của H. Itokawa 50 Kết quả thu được sau khi tiến hành sắc kí cột thô của cắn n- Bảng 3.1 60 BuOH Một số tính chất vật lý, dữ kiện phổ khối của các hợp chất Bảng 3.2 64 PN1-PN6 Bảng 3.3 Dữ kiện phổ 1H và 13C-NMR của các hợp chất PN1, PN2, PN6 64 Bảng 3.4. Dữ kiện phổ 1H và 13C-NMR của các hợp chất PN3, PN4, PN5 68 Bảng 3.5 Kết quả xây dựng đường chuẩn. 80 Kết quả định lượng saponin trong mẫu Tam thất khô, hấp ở Bảng 3.6 82 mức nhiệt 1000C tại các thời điểm hấp khác nhau Kết quả định lượng saponin trong mẫu Tam thất tươi, hấp ở Bảng 3.7 83 mức nhiệt 100°C tại các thời điểm hấp khác nhau Kết quả định lượng saponin trong mẫu Tam thất khô, hấp ở Bảng 3.8 84 mức nhiệt 120°C tại các thời điểm hấp khác nhau Kết quả định lượng saponin trong mẫu Tam thất tươi, hấp ở Bảng 3.9 85 120°C tại các thời điểm hấp khác nhau Bảng 3.10 Hiệu suất chiết cao từ các mẫu dược liệu 87 Hàm lượng các saponin trong 2 mẫu cao định lượng NP(O) và Bảng 3.11 88 NP(H) (Mean ± SD) IC50 của 6 mẫu saponin và 2 cao định lượng NP(O), NP(H) Bảng 3.12 89 trên 6 dòng tế bào ung thư người đã được thử nghiệm Tỷ số tăng sinh (A%) và giá trị IC50 các mẫu nghiên cứu trên Bảng 3.13 94 dòng Sarcoma TG 180 Bảng 3.14 Tỷ lệ % tế bào Apoptosis 95 Bảng 3.15 Tỷ lệ tế bào Appotosis sớm 96
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng 3.16 Tỷ lệ tế bào Appotosis muộn 97 Trọng lượng cơ thể chuột và thể tích khối u trong giai đoạn Bảng 3.17 98 gây u (5 ngày đầu). (Mean ± SD, n =10) Trọng lượng cơ thể chuột trong giai đoạn uống thuốc Bảng 3.18 (Mean ± SD, n =10) 99 Thể tích trung bình khối u của chuột trong giai đoạn uống Bảng 3.19 100 thuốc (từ ngày 7 đến ngày 21) (Mean ± SD, n =10) Hiệu lực kháng u tại ngày 21 sau tiêm gây u ở các lô điều trị (n Bảng 3.20 102 =10) Bảng 3.21 Số lượng và công thức bạch cầu chuột (Mean ± SD, n =10) 104 Kết quả đánh giá nồng độ IL-2 và TNF-α máu (n = 10, Mean ± Bảng 3.22 105 SD) Bảng 3.23 Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu huyết học (n = 10, x ± SD) 106 Cân nặng tương đối của lách và tuyến ức chuột các lô chuột Bảng 3.24 107 nghiên cứu (n = 10, Mean ± SD) Hàm lượng MDA, GSH, SOD và CAT trong mô gan chuột Bảng 3.25 109 (n = 10, Mean ± SD) Bảng 3.26 Hoạt độ các enzym ALT, AST trong máu chuột (n = 10) 110 Bảng 3.27 Số chuột sống sót ở các lô nghiên cứu 113 Thời gian sống trung bình (n = 20, Mean ± SD) và thời gian sống Bảng 3.28 115 kéo dài thêm của chuột (%) Bảng 3.29 Độc tính cấp theo đường uống của NP(H) 116 Bảng 3.30 Trọng lượng cơ thể chuột ở các lô nghiên cứu 117 Ảnh hưởng của cao định lượng NP (H) đối với các chỉ số của Bảng 3.31 118 hồng cầu Ảnh hưởng của cao định lượng NP (H) đối với số lượng bạch Bảng 3.32 119 cầu và số lượng tiểu cầu Bảng 3.33 Ảnh hưởng của NP (H) đối với hoạt độ enzym AST và ALT 120 Bảng 3.34 Ảnh hưởng của NP (H) đối với nồng độ albumin máu 121 Bảng 3.35 Ảnh hưởng của NP (H) đối với nồng độ cholesterol máu 121 Bảng 3.36 Ảnh hưởng của NP(H) đối với nồng độ creatinin máu 122
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Một số hình ảnh về Tam thất Lào Cai (tự chụp) 13 Hình 1.2 Sơ đồ sự biến đổi các saponin của Tam thất do hấp nhiệt 15 Hình 1.3 Các đặc điểm phân tích chết tế bào theo chương trình (Apoptosis) 24 Hình 2.1 Mẫu Tam thất khô, hấp ở 100ºC (A) 31 Hình 2.2 Mẫu Tam thất khô, hấp ở 120ºC (B) 32 Hình 2.3 Mẫu Tam thất tươi, hấp ở 100ºC (C) 32 Hình 2.4 Mẫu Tam thất tươi, hấp ở 120ºC (D) 32 Hình 2.5 Cao định lượng NP(O) và cao định lượng NP (H) 33 Hình 2.6 Các saponin phân lập từ Tam thất 34 Khối u ở đùi chuột tạo ra sau cấy ghép dòng tế bào ung thư sarcoma Hình 2.7 49 TG 180 Hình 3.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất 1,2,3,4 từ Tam thất không hấp 61 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất 5,6 từ Tam thất hấp nóng 63 Các hợp chất phân lập từ thân rễ Tam thất (PN1, PN2, PN6) và Hình 3.3 74 phổ HMBC chọn lọc của hợp chất PN1 Các hợp chất phân lập từ thân rễ Tam thất (P. notoginseng) (PN3, Hình 3.4 78 PN4, PN5) và phổ HMBC chọn lọc của hợp chất PN4 Hình 3.5 Sắc ký đồ một số mẫu dịch chiết Tam thất 79 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của các saponin đối chiếu 81 Đồ thị biểu diễn sự biến đổi hàm lượng Rh1 và Rg3 theo thời Hình 3.7 86 gian trong 4 điều kiện khảo sát Hình 3.8 Sắc ký đồ các cao Tam thất 87 Hình 3.9 Hình thái tế bào Sarcoma TG 180 91 Hình thái tế bào Sarcoma TG 180 dưới tác dụng của cao định Hình 3.10 92 lượng NP(H) và thuốc chứng dương Taxol tại thời điểm 48 giờ Hình 3.11 Hình ảnh mô bệnh học khối u sarcoma TG 180 ở đùi chuột. 103
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Trang Hình 3.12 Hình ảnh đại thể gan chuột ở các lô nghiên cứu 111 Hình 3.13 Hình ảnh vi thể gan chuột ở các lô nghiên cứu (HE x 400) 112 Hình 3.14 Biểu đồ tỷ lệ chuột sống sót theo thời gian 114 Hình 3.15 Hình ảnh đại thể gan, lách, thận của chuột ở các lô nghiên cứu 123 Hình 3.16 Hình ảnh vi thể gan của chuột ở các lô nghiên cứu 123 Hình 3.17 Hình ảnh vi thể lách của chuột ở các lô nghiên cứu 124 Hình 3.18 Hình ảnh vi thể thận của chuột ở các lô nghiên cứu 124 Hình 4.1 Sơ đồ biến đổi một số saponin trong Tam thất 130
ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư và bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới, trong đó ung thư đang dần có xu hướng vượt bệnh tim mạch trở thành nguyên nhân hàng đầu gây tử vong sớm ở hầu hết các quốc gia [1]. Theo thống kê của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế, năm 2020 ước tính thế giới có 19,3 triệu ca ung thư mới và gần 10 triệu ca tử vong do ung thư [2]. Tại Việt Nam, trong năm 2020 ước tính số ca ung thư mới là 182563 (0,19 % dân số) và số người chết ước tính là 122690 (0,13% dân số) [3]. Gánh nặng ung thư ở Việt Nam đã tăng gấp ba lần trong 30 năm qua [4]. Do tính chất ác tính của bệnh, những tác dụng phụ của hóa trị liệu và xạ trị, giá thành cao của các thuốc điều trị ung thư, việc điều trị ung thư là một gánh nặng lớn cho bệnh nhân, gia đình và xã hội. Tam thất (Panax notoginseng) từ lâu được biết đến là một dược liệu quý với công năng chủ yếu là tán ứ, hoạt huyết, chỉ huyết [5]. Tam thất còn có tên kim bất hoán, nhân sâm tam thất, sâm tam thất. Tên kim bất hoán (vàng không đổi), ý nói là vị thuốc Tam thất rất quý, vàng cũng không thể đổi được [6]. Các nghiên cứu dược lý hiện đại đã chứng minh Tam thất có nhiều tác dụng quý trong điều trị ung thư, rối loạn tim mạch, huyết ứ, giảm viêm, phù nề và giảm đau...[7]. Tác dụng chống ung thư của các hoạt chất trong Tam thất gần đây được quan tâm nghiên cứu, cho thấy tiềm năng tốt trong điều trị ung thư [8], [9]. Đặc biệt, một số tác giả báo cáo việc hấp hơi rễ Tam thất làm tăng hoạt tính chống ung thư [10], [11], [12]. Ở Việt Nam, cây Tam thất đã được di thực từ những năm 1964 từ Trung Quốc. Cây được nhập trồng ở tỉnh Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai nhưng chưa được quan tâm phát triển nên dược liệu Tam thất ở nước ta vẫn chủ yếu nhập từ Trung Quốc. Là một trong những cây thuốc quan trọng của vùng Tây Bắc, Tam thất gần đây đang được quan tâm và khôi phục lại việc trồng trọt và phát triển ở một số vùng dược liệu trong nước, đặc biệt là ở huyện Si Ma Cai, tỉnh Lào Cai. Việc nghiên cứu tác dụng định hướng điều trị ung thư của dược liệu quý này góp phần nâng cao giá 1
trị và tạo đầu ra cho dược liệu Tam thất trồng tại vùng Tây Bắc Việt Nam. Hơn nữa, thực tế về gánh nặng điều trị bệnh ung thư hiện nay rất cần những sản phẩm từ dược liệu có hiệu quả tốt trong điều trị ung thư, ít tác dụng phụ, giá thành phù hợp. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu một cách bài bản, có hệ thống về các thông số trong quá trình hấp hơi nóng tác động đến hàm lượng các saponin và các hoạt tính định hướng điều trị ung thư của Tam thất trồng tại Việt Nam. Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam thất (Panax notoginseng, (Burk.) F.H. Chen, Araliaceae) trồng ở Việt Nam trước và sau chế biến”, với mục tiêu: 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến hấp nhiệt đến hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất. 2. Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất. 3. Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của cao định lượng sau hấp nhiệt. 2
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH UNG THƯ 1.1.1. Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam Ung thư được xếp là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu và là rào cản quan trọng đối với việc tăng tuổi thọ ở mọi quốc gia trên thế giới [1]. Theo thống kê của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế [2], trên toàn thế giới ước tính có khoảng 19,3 triệu trường hợp ung thư mới (18,1 triệu trường hợp không bao gồm ung thư da không tế bào hắc tố) và gần 10 triệu trường hợp tử vong do ung thư (9,9 triệu trường hợp không bao gồm ung thư da không phải ung thư biểu mô) xảy ra vào năm 2020. Ung thư vú đã vượt qua ung thư phổi là loại ung thư được chẩn đoán phổ biến nhất, với ước tính có khoảng 2,3 triệu ca mới (11,7%), tiếp theo là ung thư phổi (11,4%), đại trực tràng (10,0%), tuyến tiền liệt (7,3%) và dạ dày (5,6%). Ung thư phổi vẫn là nguyên nhân gây tử vong do ung thư hàng đầu, với ước tính 1,8 triệu ca tử vong (18%), tiếp theo là ung thư đại trực tràng (9,4%), gan (8,3%), dạ dày (7,7%) và ung thư vú ở nữ (6,9%). Gánh nặng ung thư toàn cầu dự kiến sẽ là 28,4 triệu ca vào năm 2040, tăng 47% so với năm 2020, với sự gia tăng lớn hơn ở các quốc gia đang phát triển (64% lên 95%) so với các quốc gia phát triển (32% lên 56%). Sự đa dạng bất thường của bệnh ung thư tiếp tục cung cấp bằng chứng cho những nguyên nhân cơ bản nhưng cũng củng cố nhu cầu về nỗ lực ngày càng leo thang trên toàn cầu để kiểm soát căn bệnh này [13], [14]. Tại Việt Nam, gánh nặng ung thư đã tăng gấp ba lần trong 30 năm qua và tình trạng này có thể được giải thích một phần là do sự gia tăng của các yếu tố nguy cơ cũ và mới [4], [15]. Bên cạnh virus viêm gan B, nhiều yếu tố nguy cơ quan trọng khác như virus u nhú ở người, sử dụng thuốc lá, lười vận động và chế độ ăn uống không hợp lý vẫn chưa được kiểm soát ở Việt Nam. Tại Việt Nam, trong năm 2020 ước tính số ca ung thư mới là 182563 (0,19% dân số), và số người chết ước tính là 122690 (0,13% dân số) [3]. Những ung thư mắc tỷ lệ cao là ung thư gan, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư đại tràng và ung thư tiền liệt tuyến (Bảng 1.1). 3
Bảng 1.1. Thống kê tóm tắt năm 2020 tình hình ung thư tại Việt Nam (nguồn Global Cancer Observatory -Vietnam Population fact sheets [3]) Nam Nữ Cả 2 giới Dân số 48 598 254 48 740 329 97 338 583 Số ca ung thư mới mắc 98 916 83 647 182 563 Tỷ lệ mắc được chuẩn hóa theo độ tuổi (thế giới) 191,5 135,5 159,7 Nguy cơ phát triển ung thư trước 75 tuổi (%) 19,5 13,6 16,3 Số ca chết do ung thư 74481 48209 122690 Tỷ lệ chết được chuẩn hóa theo độ tuổi (thế giới) 144,5 74,8 106,0 Nguy cơ chết ung thư trước 75 tuổi (%) 15,0 8,0 11,2 Số ca hiện mắc trong 5 năm 162 822 191 004 353 826 5 loại ung thư có số ca mắc cao nhất ngoại trừ Gan Vú Gan ung thư da không hắc tố Phổi Phổi Phổi Dạ dày Đại tràng Vú Đại tràng Dạ dày Dạ dày Tiền liệt tuyến Gan Đại tràng 1.1.2. Ung thư với đáp ứng miễn dịch Hệ miễn dịch là hàng rào bảo vệ cơ thể trước bất kỳ một kẻ lạ mặt nào xuất hiện trong cơ thể, bao gồm vi khuẩn, virus, nấm, ký sinh trùng, hóa chất, thức ăn, cũng những tế bào do cơ thể sinh ra như tế bào ung thư [16]. Đáp ứng miễn dịch là một quá trình bảo vệ quan trọng và phức tạp của cơ thể sinh vật. Ở người, đáp ứng miễn dịch chia hai loại: đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng miễn dịch thích ứng. Miễn dịch bẩm sinh (innate immunity) là khả năng tự bảo vệ sẵn có và mang tính di truyền trong các cơ thể cùng một loài. Cơ thể loại trừ các kháng nguyên (vi khuẩn, virus…) gây bệnh thông qua hàng rào vật lý, hoá học, tế bào, thể chất. Miễn dịch thích ứng (adaptive immunity) là trạng thái miễn dịch xuất hiện do kháng thể đặc hiệu tương ứng với từng kháng nguyên được tạo ra sau khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên (KN). Miễn dịch thích ứng gồm hai phương 4