Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV)

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:173

Thêm vào BST

Báo xấu

49
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài “Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV)” được thực hiện nhằm mục đích đánh giá hiệu quả của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi trên lan Dendrobium để tạo ra khả năng kháng với virus CyMV, từ đó tiến đến tạo ra các dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus, phục vụ cho việc nâng cao năng suất và sản lượng hoa lan.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN XUÂN DŨNG ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi ĐỂ TẠO D NG N Dendrobium CÓ KHẢ N NG HÁNG VI U HẢ VÀNG Cymbidium mosaic virus) LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP TP. HỒ CHÍ MINH- 2017 i
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN XUÂN DŨNG ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi ĐỂ TẠO D NG N Dendrobium CÓ KHẢ N NG HÁNG VI U HẢ VÀNG Cymbidium mosaic virus) Chuyên ngành: D Mã số: 62.62.01.11 LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Dươ Hoa Xô 2. PGS. TS. C H H TP. HỒ CHÍ MINH- 2017 ii
LỜI C ĐO N Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Kết quả nghiên cứu hoàn toàn trung thực, khách quan. Các số liệu được trình bày trong công trình này một phần đã được công bố trên các Tạp chí Khoa học-công nghệ cùng các đồng tác giả, phần còn lại chưa được công bố bởi bất kỳ ai trong bất kỳ công trình nào. TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Nguyễn Xuân Dũng i
LỜI CẢ ƠN Để hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu của mình, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ từ gia đình, thầy cô, đồng nghiệp, bạn bè và sự ủng hộ, tạo điều kiện của các cơ quan và tổ chức. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Dương Hoa Xô - Giám đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh, là người hướng dẫn chính cho công trình nghiên cứu này. Thầy đã truyền đạt ý tưởng, định hướng nghiên cứu, cũng như kiến thức và kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận án. Ngoài ra, với tư cách là thủ trưởng đơn vị, thầy đã chấp thuận và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được tham gia chương trình đào tạo nghiên cứu sinh. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS. TS. Chu Hoàng Hà - Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người hướng dẫn thứ hai cho công trình nghiên cứu này. Thầy đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, tạo điều kiện hỗ trợ về mặt kỹ thuật cũng như đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng gởi lời cảm ơn đến: - Ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh đã chấp thuận, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập. - Ban lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam đã hết sức giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập. - Ban lãnh đạo Sở Khoa học và Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ một phần kinh phí cho tôi để thực hiện công trình nghiên cứu này. - PGS.TS. Phạm Văn Toản và tất cả cán bộ thuộc Ban Đào tạo sau đại học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và Phòng Quản lý Khoa học và Hợp tác Quốc tế- Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập. ii
- GS. TS. Bùi Chí Bửu và tất cả quý thầy cô (đã giảng dạy và tham gia Hội đồng đánh giá đề cương, chuyên đề nghiên cứu của nghiên cứu sinh) đã truyền đạt kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Những lời cảm ơn chân thành của tôi cũng xin được gởi đến: - Các cán bộ, sinh viên đã và đang làm việc trong nhóm nghiên cứu chuyển gen thực vật thuộc Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật, Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh, đã nhiệt tình tham gia, giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình làm việc và thực hiện luận án. - Các cán bộ nghiên cứu thuộc phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và hỗ trợ về mặt kỹ thuật trong quá trình thực hiện luận án. - Quý thầy cô giáo đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi qua các giai đoạn học tập, các anh chị em đồng nghiệp và bạn bè thân hữu đã cùng cộng tác và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu. Cuối cùng, xin gởi lời tri ân sâu sắc và những tình cảm ấm áp nhất đến Ba, Mạ (người mẹ đã khuất) và tất cả những người thân yêu trong gia đình đã hết lòng động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình trưởng thành, học tập và nghiên cứu. TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Nguyễn Xuân Dũng iii
MỤC LỤC Trang LỜI C ĐO N ...................................................................................................... i LỜI CẢ ƠN ........................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iv DANH SÁCH BẢNG .............................................................................................. xi DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................. xiii MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết ............................................................................................................... 1 2. Mục tiêu và yêu cầu .................................................................................................... 3 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .............................................................................. 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................................... 3 5. Đóng góp mới của luận án .......................................................................................... 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................5 1.1. Sơ lược về hoa lan .................................................................................................... 5 1.1.1. Giới thiệu về họ hoa lan ....................................................................................5 1.1.2. Giống lan Dendrobium ......................................................................................5 1.1.3. Sơ lược về PLBs (Protocorm like bodies) ........................................................6 1.2. Sơ lược về Cymbidium mosaic virus ....................................................................... 7 1.2.1. Phân loại, hình dạng phân tử và cấu trúc bộ gen ..............................................7 1.2.2. Sự lây nhiễm và di chuyển của virus CyMV trong cây ....................................9 1.2.3. Triệu chứng bệnh do virus CyMV gây ra .........................................................9 1.2.4. Tình hình bệnh do virus CyMV gây ra trên các giống lan ở Việt Nam ..........10 1.3. Phương pháp chọn giống hoa lan........................................................................... 11 1.3.1. Chọn giống bằng phương pháp cổ điển ..........................................................11 1.3.2. Chọn giống bằng phương pháp chuyển gen ....................................................11 1.3.3. Phương pháp chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens ..........11 1.3.3.1. Sơ lược về phương pháp ..............................................................................11 1.3.3.2. Các dạng Agrobacterium tumefaciens dùng cho chuyển gen ......................13 iv
1.3.3.3. Cơ chế chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens ................13 1.3.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở hoa lan ..........................................................14 1.4. Sự can thiệp RNA (RNAi) và vai trò của nó trong chọn giống cây trồng ........... 19 1.4.1. Lịch sử phát hiện RNAi ..................................................................................20 1.4.2. Cơ chế của RNAi ............................................................................................23 1.4.3. Sự khởi đầu và khuếch đại tín hiệu RNAi ......................................................25 1.4.4. Sự di chuyển của các tín hiệu RNAi ...............................................................27 1.4.5. Mối liên hệ giữa virus gây bệnh cây trồng và RNAi ......................................29 1.4.6. Vai trò của RNAi trong chọn giống cây trồng kháng virus ............................30 CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................36 2.1. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 36 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................36 2.1.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................39 2.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................ 40 2.2.1. Xây dựng quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia ..........................40 2.2.1.1. Xác định các điều kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen ....40 2.2.1.2. Xác định nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS), thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs ................41 2.2.1.3. Xác định điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn và sàng lọc PLBs chuyển gen....42 2.2.2. Phân lập và xác định trình tự gen CP của virus CyMV ..................................43 2.2.2.1. Thu thập mẫu lan nhiễm virus......................................................................43 2.2.2.2. Phân lập gen CP ...........................................................................................44 2.2.2.3. Nhân dòng gen CP .......................................................................................44 2.2.2.4. Giải trình tự gen CP và phân tích sự tương đồng của các trình tự ...............46 2.2.3. Thiết kế vector chuyển gen RNAi và biến nạp vào A. tumefaciens ................46 2.2.3.1. Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP hoặc ORF2-4+CP ..........46 2.2.3.2. Thiết kế vector chuyển gen RNAi mang đoạn gen CP và ORF2-4+CP bằng hệ thống Gateway .........................................................................................47 v
2.2.3.3. Tạo chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi pK7GWIWG2(II)/CP hoặc pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP........................48 2.2.4. Tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen CP và ORF2-4+CP .......48 2.2.4.1. Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn .........................................................................48 2.2.4.2. Chuyển cấu trúc RNAi của đoạn gen CP hoặc ORF2-4+CP vào PLBs qua trung gian vi khuẩn A. tumefaciens ...............................................................49 2.2.4.3. Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển ...................................................49 2.2.4.4. Kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển trong PLBs giả định chuyển gen ....50 2.2.4.5. Thu nhận cây lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển và kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu trong cây ...................................................................50 2.2.5. Đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan chuyển gen bằng lây nhiễm virus nhân tạo trong điều kiện in vitro ..............................................51 2.2.5.1. Lây nhiễm virus CyMV vào cây lan chuyển gen trong điều kiện in vitro ...51 2.2.5.2. Đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan chuyển gen .................52 2.2.6. Phân tích và xử lý số liệu ................................................................................52 2.2.7. Điều kiện nuôi cấy ..........................................................................................53 2.2.8. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................53 CHƯƠNG 3. ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................54 3.1. Xây dựng quy trình chuyển gen vào PLBs............................................................ 54 3.1.1. Các điều kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen ......................54 3.1.1.1. Nồng độ chất khử trùng thích hợp để tạo mẫu cấy in vitro..........................54 3.1.1.2. Môi trường thích hợp để tạo PLBs từ mô cấy in vitro .................................55 3.1.1.3. Môi trường thích hợp cho sự tăng sinh và phát triển PLBs .........................57 3.1.2. Nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs .............................................................58 3.1.2.1. Trường hợp chủng C58 ................................................................................58 3.1.2.2. Trường hợp chủng EHA105.........................................................................59 3.1.2.3. Trường hợp chủng LBA4404 .......................................................................60 3.1.2.4. Về mức độ biểu hiện gen GUS ....................................................................61 vi
3.1.3. Các điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn và sàng lọc PLBs chuyển gen........62 3.1.3.1. Nồng độ cefotaxime thích hợp để loại vi khuẩn từ PLBs ............................62 3.1.3.2. Nồng độ hygromycin và kanamycin thích hợp để sàng lọc PLBs chuyển gen ...63 3.2. Phân lập và xác định trình tự gen CP của virus CyMV ........................................ 66 3.2.1. Phân lập gen CP ..............................................................................................66 3.2.2. Tạo dòng gen CP .............................................................................................67 3.2.3. Giải trình tự gen CP và phân tích sự tương đồng của các trình tự ..................69 3.3. Thiết kế vector chuyển gen RNAi mang đoạn gen CP và CP + ORF2-4 ............ 71 3.3.1. Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP hoặc ORF2-4+CP .....................72 3.3.1.1. Khuếch đại gen CP từ vector nhân dòng và gen ORF2-4+CP từ vector pBSK/ORF2-4+CP .......................................................................................72 3.3.1.2. Gắn đoạn gen CP và ORF2-4+CP vào vector pENTR ................................72 3.3.1.3. Thiết kế vector chuyển gen RNAi bằng kỹ thuật Gatewway.......................76 3.3.1.4. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi ..........78 3.4. Tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen CP và ORF2-4+CP........... 79 3.4.1. Chuyển cấu trúc RNAi của đoạn gen CP hoặc ORF2-4+CP vào PLBs qua trung gian vi khuẩn A. tumefaciens ..............................................................79 3.4.1.1. Giai đoạn đồng nuôi cấy ..............................................................................79 3.4.1.2. Giai đoạn khử khuẩn ....................................................................................81 3.4.2. Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển ......................................................82 3.4.3. Kiểm tra sự hiện diện gen chuyển trong PLBs giả định chuyển gen ..............83 3.4.4. Thu nhận cây lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển ...............................85 3.5. Khả năng kháng CyMV của cây lan chuyển gen trong điều kiện in vitro ........... 90 3.5.1. Về biểu hiện triệu chứng nhiễm virus CyMV .................................................90 3.5.2. Về sự hiện diện của virus trong cây lan ..........................................................92 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................95 1. Kết luận ...................................................................................................................... 95 2. Đề nghị ...................................................................................................................... 96 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ ...................................................97 vii
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................98 Tài liệu tiếng Việt .......................................................................................................... 98 Tài liệu tiếng Anh .......................................................................................................... 99 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Môi trường nuôi cấy thực vật và vi khuẩn Phụ lục 2. Một số triệu chứng nghi nhiễm virus trên các mẫu lan thu thập Phụ lục 3. Quy trình chuyển gen vào PLBs của lan Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phụ lục 4. Kết quả so sánh trình tự gen CP và gen ORF2-4 của CyMV Phụ lục 5. Kết quả xử lý thống kê viii
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT BA Benzyladenine BGMV Bean golden mosaic virus BYMV Bean yellow mosaic virus CBP Cap binding protein CGMMV Cucumber green mottle mosaic virus CMV Cucumber mosaic virus CP Coat protein gene CPMR Coat protein-mediated resistance CyMV Cymbidium mosaic virus 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid DCL Dicer like protein DNA Deoxyribo nucleic acid dsRBD Double-stranded RNA binding domain GFP Green fluorescent protein HCPro Helper component-proteinase hpRNA Hairpin RNA ihpRNA Intron hairpin RNA LB Lysogeny broth MCS Multi cloning site miRNA MicroRNA mRNA Messenger RNA MS Murashige and Skoog LS Linsmaier and Skoog NAA Naphthaleneacetic acid NCR Noncoding region NMV Narcissus mosaic virus ORF Open reading frame ix
ORSV Odontoglossum ringspot virus PAMV Potato aucuba mosaic virus RdRp RNA-dependent RNA polymerase RISC RNA-induced silencing complex RNA Ribonucleic acid RNAi RNA interference siRNA Small interfering RNA SMYEaV Strawberry mild yellow edge-associated virus SMV Soybean mosaic virus sRNA Small RNA TGB Triple-gene-block TMV Tobacco mosaic virus TRV Tobacco rattle virus TRSV Tobacco ringspot virus TYLCV Tomato yellow leaf curl virus WCMV White clover mosaic virus x
DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1.1. Kết quả ứng dụng RNAi trên nhiều loại virus thực vật khác nhau ................31 Bả 3.1. Tỷ lệ đoạn thân mang chồi ngủ lan Dendrobium Sonia sống vô trùng sau 14 ngày nuôi cấy.........................................................................................54 Bả 3.2. Tỷ lệ mẫu lát cắt mỏng mô thân cây lan Dendrobium Sonia in vitro cảm ứng với môi trường sau 4 tuần nuôi cấy. .................................................55 Bả 3.3. Sự thay đổi trọng lượng PLBs trên các môi trường ........................................57 Bả 3.4. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58. ................59 Bả 3.5. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105. ........60 Bả 3.6. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404........61 Bả 3.7. Khả năng diệt khuẩn của cefotaxime ở các nồng độ khác nhau trên PLBs ..63 Bả 3.8. Tỷ lệ PLBs chết do tác động của hygromycin ở các nồng độ khác nhau theo thời gian nuôi cấy......................................................................................64 Bả 3.9. Tỷ lệ PLBs chết do tác động của kanamycin ở các nồng độ khác nhau, theo thời gian nuôi cấy......................................................................................65 Bả 3.10. Tỷ lệ tương đồng giữa các trình tự gen CP của virus CyMV phân lập ở các khu vực khác nhau tại Việt Nam ............................................................70 Bả 3.11. Tỷ lệ tương đồng giữa các trình tự gen CP của virus CyMV phân lập ở các khu vực tại Việt Nam và một số khu vực trên thế giới .........................71 Bả 3.12. Kích thước các phân đoạn thu được khi cắt vector tái tổ hợp pK7GWIWG2(II)/CP; pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP bằng XbaI và HindIII .............................................................................................................. 77 xi
Bả 3.13. Tỷ lệ PLBs giả định chuyển gen thu được sau giai đoạn sàng lọc với kanamycin. ........................................................................................................82 Bả 3.14. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu trong PLBs chuyển gen...85 Bả 3.15. Tần suất xuất hiện của các dạng kiểu hình cây lan Dendrobium Sonia thu được từ cụm PLBs chuyển gen. .......................................................................87 Bả 3.16. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu trong cây lan phát triển từ PLBs chuyển gen. .............................................................................................89 Bả 3.17. Kết quả đánh giá khả năng kháng virus của cây lan phát triển từ PLBs chuyển gen sau 4 tuần lây nhiễm virus. ...........................................................93 xii
DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.1. Hoa lan Dendrobium Sonia ................................................................................ 6 Hình 1.2. Hình dạng của CyMV ......................................................................................... 7 Hình 1.3. Cấu trúc bộ gen của virus CyMV....................................................................... 8 Hình 1.4. Triệu chứng khảm vàng lá và khảm màu hoa lan Dendrobium .....................10 Hình 1.5. Sự phục hồi (kháng lại virus) ở cây thuốc lá bị nhiễm virus TRSV. .............20 Hình 1.6. Hoa dã yên thảo với các gen quy định sắc tố hoa đã bị im lặng bởi RNAi ...22 Hình 1.7. Cơ chế hoạt động của RNAi.............................................................................24 Hình 1.8. Hoạt động của protein RdRp trong việc khuếch đại tín hiệu RNAi [20]. .....26 Hình 1.9. Ảnh hưởng của đột biến RdRp lên sự truyền tín hiệu RNAi ở cây A. thaliana . ......................................................................................................29 Hình 3.1. Chồi ngủ lan Dendrobium Sonia tăng trưởng trên môi trường MS sau 4 (A) và 8 (B) tuần nuôi cấy. .....................................................................54 Hình 3.2. Sự hình thành PLBs từ lát cắt mỏng thân Dendrobium Sonia trên môi trường MS bổ sung BA và NAA ở các nồng độ khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy ......56 Hình 3.3. Sự tăng sinh PLBs của lan Dendrobium Sonia trên môi trường MS bổ sung BA và NAA ở các nồng độ khác nhau, sau 10 tuần nuôi cấy ........................57 Hình 3.4. Các mức độ biểu hiện gen GUS của PLBs chuyển gen .................................61 Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại gen CP ..................................66 Hình 3.6. Kết quả điện di kiểm tra gen CP trong các dòng vi khuẩn với cặp mồi F-CCP và R-CCP định vị trên gen ...................................................................67 Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra gen CP trong các dòng vi khuẩn với cặp mồi pJET1.2 định vị trên vector ..............................................................................68 Hình 3.8. Kết quả điện di sự kiểm tra gen CP trong các dòng vi khuẩn bằng phản ứng cắt với enzyme BamHI và EcoRI.....................................................................68 xiii
Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự gen CP với các trình tự được công bố trên ngân hàng gen NCBI..................................................................................................69 Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sản phẩm khuếch đại gen CP (A) và ORF2-4+CP (B). ...72 Hình 3.11. Sơ đồ tạo vector tái tổ hợp pENTR/CP và pENTR/ORF2-4+CP ................73 Hình 3.12. Kết quả kiểm tra phân đoạn gen CP trong các dòng vi khuẩn biến nạp vector pENTR/CP với cặp mồi M13 ...............................................................74 Hình 3.13. Kết quả kiểm tra phân đoạn gen ORF2-4+CP trong các dòng vi khuẩn biến nạp vector pENTR/ORF2-4+CP với mồi M13. ..............................................74 Hình 3.14. Sơ đồ vector pENTR/CP và pENTR/ORF2-4+CP với vị trí cắt của enzyme NotI và SalI ..................................................................................75 Hình 3.15. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của phân đoạn gen CP (A) và ORF2-4+CP (B) trong các dòng vi khuẩn bằng enzyme SalI và NotI.................................75 Hình 3.16. Kết quả kiểm tra gen CP (A) và gen ORF2-4+CP (B) trong các dòng khuẩn lạc với cặp mồi của đoạn gen. .........................................................................76 Hình 3.18. Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt vector pK7GWIWG2(II)/CP và pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP bằng enzyme XbaI và HindIII ....................78 Hình 3.19. Khuẩn lạc A. tumefaciens C58 phát triển trên môi trường chứa 50mg/l ampicilin, 100mg/l spectinomycin và 50mg/l rifamycin sau khi được biến nạp với vector pK7WIWG2(II)/CP/ORF2-4+CP. ..........................................79 Hình 3.20. PLBs của lan Dendrobium Sonia tăng trưởng trên môi trường đồng nuôi cấy sau 3 ngày lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens. .......................................80 Hình 3.21. PLBs của Dendrobium Sonia tăng trưởng trên môi trường khử khuẩn sau 7 ngày (A) và 14 (B) ngày nuôi cấy.................................................................81 Hình 3.22. PLBs lan Dendrobium Sonia nuôi cấy trên môi trường sàng lọc sau 60 ngày...............................................................................................................82 Hình 3.23. Kết quả kiểm tra gen CP trong cụm PLBs giả định chuyển gen..................84 xiv
Hình 3.24. Kết quả kiểm tra gen ORF2-4+CP trong cụm PLBs giả định chuyển gen .........................................................................................................84 Hình 3.25. Sự tăng trưởng của PLBs lan Dendrobium Sonia chuyển gen trên môi trường ½ MS. (A). Tăng sinh PLBs, (B). Tăng trưởng chồi. .................86 Hình 3.26. Kiểu hình cây lan Dendrobium Sonia thu được từ PLBs chuyển gen sau 6 tháng nuôi cấy trên môi trường ½ MS. ..........................................................87 Hình 3.27. Kết quả kiểm tra gen CP trong cây lan chuyển gen. .....................................88 Hình 3.28. Kết quả kiểm tra gen ORF2-4+CP trong cây lan chuyển gen......................89 Hình 3.29. Các triệu chứng nhiễm virus trên cây lan in vitro sau 3 tuần lây nhiễm nhân tạo với virus CyMV ..........................................................................................91 Hình 3.30. Cây lan in vitro sau 4 tuần lây nhiễm nhân tạo với virus CyMV ................91 Hình 3.31. Kết quả kiểm tra virus CyMV trong các cây lan giả định chuyển gen được lây nhiễm virus trong điều kiện in vitro sau 4 tuần.........................................92 Hình 3.32. Cây lan Dendrobium Sonia chuyển gen (dòng 36-176) tăng trưởng trong điều kiện nhà kính. ............................................................................................94 xv
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Dendrobium là giống lan được trồng phổ biến ở Việt Nam. Đây là một giống chiếm ưu thế trong họ hoa lan, bao gồm nhiều loài có hoa đẹp, có thể sử dụng cho mục đích sản xuất hoa cắt cành và hoa chậu. Dendrobium đã thực sự trở thành một giống lan chủ lực đối với ngành sản xuất hoa lan ở Việt Nam trong nhiều năm qua. Tại Thành phố Hồ Chí Minh, một trong những trung tâm sản xuất hoa lan lớn nhất cả nước, cùng với lan Mokara, Dendrobium là một trong hai giống lan đóng góp chính vào tổng sản lượng thu hoạch 6,7 triệu chậu và 68,9 triệu cành hoa lan (đạt giá trị 613,9 tỷ đồng) của ngành sản xuất hoa lan thành phố trong năm 2015 [10]. Tuy nhiên, hiện tại việc sản xuất lan Dendrobium nói riêng và hoa lan nói chung tại Thành phố Hồ Chí Minh cũng như cả nước vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu trong nước. Hoa lan vẫn được nhập khẩu từ các nước như Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc để cung cấp cho thị trường trong nước. Nghiên cứu nâng cao năng suất và sản lượng hoa lan là một trong những vấn đề có ý nghĩa quan trọng đối với ngành sản xuất hoa lan Việt Nam. Có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến năng suất và sản lượng hoa lan, trong đó bệnh hại là một trong những yếu tố gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất. Nhiều loại bệnh khác nhau gây hại trên lan Dendrobium cũng như hoa lan nói chung đã được ghi nhận, nhưng đáng chú ý nhất là bệnh do virus gây ra. Hiện có hai loại virus gây hại phổ biến trên hoa lan đó là virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV) và virus đốm vòng (Odontoglossum ringspot virus - ORSV) [88]. Trong đó, tỷ lệ nhiễm virus CyMV cao hơn so với virus ORSV trên các giống lan ở Việt Nam [2], [5], [7], và đặc biệt là lan Dendrobium được trồng ở một số khu vực thuộc Thành phố Hồ Chí Minh chỉ bị nhiễm virus CyMV, với tỷ lệ lên đến 67,5%, mà không bị nhiễm virus ORSV [2]. Như vậy, có thể thấy virus CyMV hiện đang lây nhiễm rất nghiêm trọng trên giống lan Dendrobium ở Việt Nam. 1
Cây lan nhiễm virus thường bị giảm sức sống, giảm số lượng và chất lượng hoa, từ đó ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng thu hoạch. Quan trọng hơn, do virus có khả năng phát triển tiềm ẩn và lan truyền nhanh chóng qua các dụng cụ làm vườn, nên thiệt hại thường diễn ra trên phạm vi lớn với mức độ rất nghiêm trọng. Đến nay, biện pháp duy nhất để kiểm soát bệnh virus vẫn là phòng tránh thông qua loại trừ các tác nhân lây nhiễm trong quá trình sản xuất giống và canh tác. Việc triển khai các quy trình kiểm soát bệnh gây tiêu tốn nhiều thời gian, chi phí và không phải lúc nào cũng mang lại hiệu quả như mong muốn. Do vậy, các biện pháp hiệu quả hơn vẫn đang được nghiên cứu, mà một trong số đó là tạo ra khả năng kháng virus cho cây bằng kỹ thuật chuyển gen dựa trên cơ chế can thiệp RNA (RNAi). Cho đến nay, nhiều giống cây trồng kháng virus đã được tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gen RNAi trên thế giới [34]. Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo giống cây trồng kháng bệnh virus cũng đã được triển khai ở Việt Nam, trên một số loại cây trồng, để tạo ra khả năng kháng với các loại virus khác nhau như thuốc lá kháng virus TMV [12], virus CMV [11] và kháng đồng thời cả hai loại virus TMV và CMV [3]; cà chua kháng virus TYLCV [13]; đu đủ kháng virus PRSV [4], đậu tương kháng virus SMV và BYMV [9]. Tuy nhiên, hiện vẫn chưa có nghiên cứu nào được triển khai trên lan Dendrobium để tạo ra khả năng kháng với virus CyMV, trong khi tình trạng nhiễm virus CyMV vẫn đang diễn ra rất nghiêm trọng trên giống lan này. Đề tài “Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV)” được thực hiện nhằm mục đích đánh giá hiệu quả của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi trên lan Dendrobium để tạo ra khả năng kháng với virus CyMV, từ đó tiến đến tạo ra các dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus, phục vụ cho việc nâng cao năng suất và sản lượng hoa lan. 2
2. Mục tiêu và yêu cầu Nghiên cứu áp dụng và đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi trong việc tạo ra khả năng kháng virus CyMV cho cây lan Dendrobium Sonia trong điều kiện nuôi cấy in vitro: - Nghiên cứu chọn được vùng trình tự bảo thủ của gen CP và ORF2-4 từ virus CyMV phục vụ cho thiết kế vector chuyển gen RNAi. - Nghiên cứu xây dựng được quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium để tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen CP hoặc ORF2-4+CP. - Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan chuyển gen trong điều kiện in vitro. 3. Đ ượng và phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu được thực hiện trên lan Dendrobium Sonia và virus CyMV gây bệnh trên lan. Các dòng lan chuyển gen được tạo ra qua việc chuyển cấu trúc RNAi của gen CP hoặc ORF2-4+CP của virus CyMV vào PLBs lan bằng kỹ thuật chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. - Các thí nghiệm khảo sát, đánh giá trong nghiên cứu, bao gồm việc đánh giá khả năng kháng virus của cây chuyển gen, được giới hạn trong điều kiện in vitro. 4. Ý ĩa k a c và thực tiễn *Ý ĩa k a - Góp phần làm sáng tỏ vấn đề về mức độ bảo thủ của trình tự gen CP phân lập từ virus CyMV tại Việt Nam. - Góp phần hoàn thiện kỹ thuật chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên đối tượng lan Dendrobium. - Tạo tiền đề quan trọng cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo ra khả năng kháng virus cho lan Dendrobium cũng như hoa lan nói chung. 3