Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Định lượng đồng thời paracetamol, clopheninamin maleat và vitamin B1 trong thuốc Pabemin, Baby plex, Paracetamol F.B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:110

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung của Luận văn là nghiên cứu phương pháp sắc lý lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) để định lượng các thuốc đa thành phần vì: các phương pháp này có độ nhạy tương đối cao, có khả năng định lượng tốt, tiết kiệm hóa chất, tốn ít thời gian, thích hợp cho việc tách các chất bay hơi hoặc dễ bị phân hủy bởi nhiệt, cho kết quả nhanh và chính xác. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Định lượng đồng thời paracetamol, clopheninamin maleat và vitamin B1 trong thuốc Pabemin, Baby plex, Paracetamol F.B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HOÀNG THỊ NGỌC XUÂN ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL, CLOPHENINAMIN MALEAT VÀ VITAMIN B1 TRONG THUỐC PABEMIN, BABY PLEX, PARACETAMOL F.B BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VÀ QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ Hóa phân tích Mã ngành: 8 44 01 18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Hướng dẫn khoa học: PGS.TS Mai Xuân Trường THÁI NGUYÊN - NĂM 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất cứ một công trình nào. Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, tháng 04 năm 2018 Tác giả luận văn Hoàng Thị Ngọc Xuân Xác nhận của giáo viên hướng dẫn Xác nhận của trưởng khoa chuyên môn PGS.TS Mai Xuân Trường PGS.TS Nguyễn Thị Hiền Lan i
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tác giả đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ của các thầy giáo, cô giáo, bạn bè và gia đình. Tác giả bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Khoa Hóa học, Phòng Đào tạo - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã cung cấp những kiến thức giúp tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Mai Xuân Trường người đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận văn. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp những người đã luôn bên tôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Với khối lượng công việc lớn, thời gian nghiên cứu có hạn, khả năng nghiên cứu còn hạn chế, chắc chắn luận văn không thể tránh khỏi những thiếu sót. Tác giả rất mong nhận được các ý kiến đóng góp từ các thầy giáo, cô giáo và bạn đọc. Xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 04 năm 2018 Tác giả Hoàng Thị Ngọc Xuân ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN............................................................................................ ... i LỜI CẢM ƠN.................................................................................................. ..ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................iv DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ..................................................................... v DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................vi MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 1 1.1. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ..................... 2 1.1.1. Khái niệm ........................................................................................... 2 1.1.2. Nguyên tắc.......................................................................................... 2 1.1.4. Một số đại lượng đặc trưng trong phân tích sắc ký........................... 4 1.1.5. Hệ thống máy HPLC .......................................................................... 8 1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử .......................................... 8 1.2.1. Định luật Bughe – Lămbe – Bia......................................................... 9 1.2.2. Các bước tiến hành phép đo UV-Vis ............................................... 11 1.3. Phương pháp lọc Kalman ............................................................... 12 1.4. Tổng quan về các chất phân tích trong thuốc Pabemin, Baby Plex và Paracetamol F.B ........................................................................... 13 1.4.1. Paracetamol ..................................................................................... 13 1.4.2. Clopheninamin maleat ..................................................................... 15 1.4.3. Vitamin B1........................................................................................ 17 1.5. Một số loại chế phẩm chứa paracetamol, clopheninamin maleat và vitamin B1 ......................................................................................... 20 1.5.1. Thuốc Paracetamol F.B ................................................................... 20 1.5.2. Thuốc Babyplex ................................................................................ 20 1.5.3. Thuốc Pabemin ................................................................................ 21 iii
1.6. Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC và theo phương pháp UV- Vis…………………………………………………. 21 1.6.1. Một số kết quả xác định thành phần theo phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ................................................................................................ 21 1.6.2. Một số kết quả xác định thành phần theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................................................................................... 25 Chương 2: THỰC NGHIỆM ............................................................................ 32 2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 32 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 32 2.2.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ......................................... 32 2.2.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ....................................... 33 2.3. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................. 33 2.3.1. Các phương pháp để xử lý kết quả phân tích. ................................ 33 2.3.2. Các đại lượng đặc trưng để xử lý kết quả phân tích. ..................... 34 2.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ......................................................... 35 2.4.1. Thiết bị ............................................................................................. 35 2.4.2. Dụng cụ ............................................................................................ 36 2.4.3. Hóa chất ........................................................................................... 36 2.5. Chuẩn bị các dung môi để hòa tan mẫu và thuốc ............................ 38 2.6. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn cho phương pháp HPLC ................. 38 2.7. Chuẩn bị dung dịch thuốc cho phương pháp HPLC ........................ 39 2.8. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn cho phương pháp UV-Vis ............... 40 2.9. Chuẩn bị các dung dịch thuốc cho phương pháp UV-Vis ............... 40 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 40 3.1. Phương pháp HPLC ....................................................................... 43 3.1.1. Xây dựng các điều kiện để xác định đồng thời 3 chất PRC, CPM và vitamin B1 .................................................................................................... 43 3.1.2. Đánh giá phương pháp định lượng .................................................. 46 iv
3.1.3. Khảo sát độ đúng của phép xác định PRC, CPM và B1 theo phương pháp thêm chuẩn ................................................................................. 51 3.1.4. Xác định PRC, CPM và B1 trong thuốc Paracetamol F.B, Baby Plex, Pabemin................................................................................................... 51 3.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ........................................ 60 3.2.1. Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của paracetamol, clopheninamin maleat và vitamin B1 ........................................................................................ 61 3.2.2. Kiểm tra tính cộng tính độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp . 62 3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính tuân theo định luật Bughe – Lămbe – Bia của PRC, CPM và B1 và xác định chỉ số LOD và LOQ ........................... 65 3.2.4. Khảo sát và đánh giá độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu trên các mẫu tự pha .......................................................................................... 71 3.2.6. Xác định hàm lượng PRC, B1 và CPM trong thuốc Baby Plex và đánh giá độ đúng của phép phân tích theo phương pháp thêm chuẩn ............ 82 3.2.7. Xác định hàm lượng PRC, CPM và B1 trong thuốc Pabemin và đánh giá độ đúng của phép phân tích theo phương pháp thêm chuẩn ............ 87 KẾT LUẬN ...................................................................................................... 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 93 PHỤ LỤC 1: Độ hấp thụ quang của PRC, B1 và hỗn hợp ở một số bước sóng .................................................................................................................. 97 PHỤ LỤC 2: Độ hấp thụ quang của PRC, CPM và hỗn hợp ở một số bước sóng................................................................................................................... 98 PHỤ LỤC 3: Độ hấp thụ quang của B1, CPM và hỗn hợp ở một số bước sóng.. 99 PHỤ LỤC 4: Độ hấp thụ quang của hỗn hợp PRC, B1 và CPM ở một số bước sóng ....................................................................................................... 100 v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tiếng Việt Tiếng Anh Viết tắt Paraxetamon Paracetamol PRC Clopheninamin maleat Chlorpheniramine maleate CPM Vitamin B1 Thiamine nitrat (clorua) B1 Phương pháp sắc kí lỏng High Performance Liquid HPLC hiệu năng cao Chromatography Giới hạn phát hiện Limit Of Detection LOD Giới hạn định lượng Limit Of Quantity LOQ Sai số tương đối Relative Error RE Độ thu hồi Recovery Rev Độ lệch chuẩn Standard Deviation S hay SD iv vi
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 3. 1. Giá trị các đại lượng đặc trưng …………………………………..47 Bảng 3. 2. Kết quả khảo sát thời gian lưu …………………………………...47 Bảng 3. 3. Kết quả khảo sát diện tích pic ........................................................ 47 Bảng 3. 4. Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của PRC, CPM và B1…………………………………………..………………………..………46 Bảng 3. 5. Kết quả khảo sát độ lặp lại......................................................48 Bảng 3. 6. Kết quả phân tích thuốc Paracetamol F.B……………….……….49 Bảng 3. 7. Kết quả phân tích thuốc Baby Plex ………………………………59 Bảng 3. 8. Kết quả phân tích thuốc Pabemin………………………………..51 Bảng 3. 9. Kết quả khảo sát độ đúng. ............................................................. 53 Bảng 3. 10. Kết quả khảo sát độ đúng…………...…………………………..55 Bảng 3. 11. Kết quả khảo sát độ đúng……………………………………….56 Bảng 3. 12. Độ hấp thụ quang của dung dịch PRC ở các giá trị nồng độ …...66 Bảng 3. 13. Kết quả xác định LOD và LOQ của PRC.................................... 68 Bảng 3. 14. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của CPM theo nồng độ ................... 69 Bảng 3. 15. Kết quả tính LOD và LOQ của CPM .......................................... 69 Bảng 3. 16. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của B1 theo nồng độ ..................... 70 Bảng 3. 17. Kết quả tính LOD và LOQ của B1 .............................................. 67 Bảng 3. 18. Pha chế các dung dịch hỗn hợp PRC và CPM ............................ 68 Bảng 3. 19. Kết quả tính nồng độ, sai số của PRC và CPM trong hỗn hợp……………………………………………………………….…………69 Bảng 3. 20. Pha chế các dung dịch hỗn hợp PRC và B1 ................................ 70 Bảng 3. 21. Kết quả tính nồng độ, sai số của PRC và B1 trong hỗn hợp…………………………………………………………………………..71 Bảng 3. 22. Pha chế các dung dịch hỗn hợp CPM và B1 ............................... 72 Bảng 3. 23. Kết quả tính nồng độ, sai số của CPM và B1 trong hỗn hợp…...76 Bảng 3. 22. Pha các dung dịch chuẩn PRC, B1, CPM và hỗn hợp………74 Bảng 3. 25. Kết quả tính nồng độ, sai số của PRC, CPM và B1 .................... 77 v vii
Bảng 3. 26. Kết quả tính nồng độ, sai số PRC, B1 và CPM trong mẫu thuốc Paracetamol F.B .............................................................................................. 79 Bảng 3. 27. Thành phần các dung dịch chuẩn PRC, B1 và CPM thêm vào dung dịch mẫu thuốc Paracetamol F.B ........................................................... 78 Bảng 3. 28. Kết quả xác định độ thu hồi của PRC, CPM và B1 trong mẫu thuốc Paracetamol F.B……………………………………………………..79 Bảng 3. 29. Kết quả tính nồng độ, sai số PRC, CPM và B1 trong mẫu thuốc Baby Plex ........................................................................................................ 80 Bảng 3. 30. Thành phần các dung dịch chuẩn PRC, B1 và CPM thêm vào dung dịch mẫu thuốc Baby Plex………………………………………..…82 Bảng 3. 31. Kết quả xác định độ thu hồi của PRC, CPM và B1 trong mẫu thuốc Baby Plex………………………………….………………………..83 Bảng 3. 32. Kết quả tính nồng độ, sai số PRC, B1 và CPM trong mẫu thuốc Pabemin ........................................................................................................... 84 Bảng 3. 33. Thành phần các dung dịch chuẩn PRC, B1 và CPM thêm vào dung dịch mẫu thuốc Pabemin ........................................................................ 86 Bảng 3. 34. Kết quả xác định độ thu hồi của PRC, B1 và CPM trong mẫu thuốc Pabemin………………………………………….……….……...……87 viii
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. 1. Thời gian lưu của cấu tử phân tích.................................................. 5 Hình 1. 2. Hiệu quả tách của cột ....................................................................... 6 Hình 1. 3. Sơ đồ hệ thống HPLC ...................................................................... 8 Hình 1. 4. Máy quang phổ khả kiến (UV – Vis) ……………………………...9 Hình 1. 5. Dạng bào chế của paracetamol....................................................... 14 Hình 1. 6. Các dạng bào chế của clopheninamin maleat ................................ 17 Hình 1. 7. Các dạng bào chế của vitamin B1 .................................................. 19 Hình 3. 1. Sắc kí đồ của hỗn hợp PRC, CPM và B1 với pha động tỉ lệ 7:93 (a) và 87:13 (b) .................................................................................................... .44 Hình 3. 2. Sắc kí đồ của hỗn hợp PRC, CPM và B1 với bước sóng 216 nm và bước sóng 250 nm ........................................................................................... 44 Hình 3. 3. Sắc ký đồ của hỗn hợp PRC, CPM và B1 với tốc độ dòng 1,2 mL/phút ..................................................................................................... 45 Hình 3. 4. Sắc kí đồ của PRC (400 µg/mL) (a) và CPM (10 µg/mL) (b) ........ 46 Hình 3. 5. Sắc kí đồ của B1 (100 µg/mL) (a) và của hỗn hợp B1, CPM và PRC (b) ............................................................................................................ 46 Hình 3. 6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của PRC (a), B1 (b), CPM (c)……………………………….……….….47 Hình 3. 7. Phổ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn PRC (1), B1 (2) và CPM (3)……………………………………………………………....……..57 Hình 3. 8. Phổ hấp thụ quang của PRC ở các nồng độ 0,250,0 g/mL………..62 Hình 3. 9. Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào nồng độ của PRC (a), B1 (b), CPM (c)………………………..63 Hình 3. 10. Phổ hấp thụ quang của CPM ở các nồng độ 0,250,0 g/mL…...….64 Hình 3. 11. Phổ hấp thụ quang của B1 ở các nồng độ 0,2 50,0 g/mL………....66 viix
MỞ ĐẦU Trong ngành y dược cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kĩ thuật thì việc sử dụng các thuốc đa thành phần trở nên rất phổ biến. Các nhà sản xuất thường phối hợp paracetamol, clopheninamin maleat và vitamin B1 với nhiều dược chất trong một công thức bào chế, đặc biệt là trong các thuốc hạ nhiệt, giảm đau, ho, sổ mũi, . . . với mục đích phối hợp tác dụng dược lý của các dược chất để tăng hiệu quả điều trị đồng thời làm giảm tác dụng phụ và tiện sử dụng cho bệnh nhân. Việc định lượng paracetamol, clopheninamin maleat và vitamin B1 trong các loại thuốc hỗn hợp theo tiêu chuẩn của nhà sản suất là rất quan trọng vì chỉ cần thay đổi một lượng nhỏ thành phần hoạt tính của thuốc cũng có thể ảnh hưởng đến sức khỏe của hàng trăm, hàng nghìn người. Trên thế giới và ở Việt Nam hiện nay người ta thường sử dụng phương pháp sắc lý lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) để định lượng các thuốc đa thành phần vì: các phương pháp này có độ nhạy tương đối cao, có khả năng định lượng tốt, tiết kiệm hóa chất, tốn ít thời gian, thích hợp cho việc tách các chất bay hơi hoặc dễ bị phân hủy bởi nhiệt, cho kết quả nhanh và chính xác... Vì vậy chúng tôi lựa chọn đề tài: "Định lượng đồng thời paracetamol, clopheninamin maleat và vitamin B1 trong thuốc Pabemin, Baby plex, Paracetamol F.B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử” để tiến hành nghiên cứu. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1
1.1. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 1.1.1. Khái niệm HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). [1, 22]. 1.1.2. Nguyên tắc Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp tách hỗn hợp chất lỏng dựa trên sự phân bố giữa hai pha, một pha đứng yên gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển gọi là pha động. Do ái lực hấp phụ và giải hấp phụ khác nhau của các hợp phần có trong mẫu phân tích với pha tĩnh và pha động mà chúng di chuyển dọc theo pha tĩnh (cột sắc ký) với tốc độ khác nhau nên lần lượt đi ra khỏi cột. Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố. Hỗn hợp mẫu để phân tích và tách có thể tích rất nhỏ được đưa vào dòng pha động đang thấm qua cột. Những thành phần của mẫu đi qua cột với tốc độ khác nhau, đây là chức năng của những tương tác vật lý cụ thể với chất hấp phụ của cột (còn gọi là pha tĩnh). Tốc độ của từng thành phần phụ thuộc vào bản chất hoá học tự nhiên trên pha tĩnh và thành phần của pha động. Thời gian mà một chất phân tích rửa giải ra khỏi cột gọi là thời gian lưu. Thời gian lưu được đo trong những điều kiện đặc trưng và được xem là đặc điểm nhận biết của chất đem phân tích [1, 18]. 1.1.3. Phân loại Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại: - Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn. - Sắc ký phân bố. 2
- Sắc ký ion. - Sắc ký rây phân tử. Trong đó, sắc ký phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (
tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này [22]. 1.1.3.2. Pha động trong sắc ký pha đảo Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau: - Hòa tan mẫu phân tích. - Phù hợp với đầu dò. - Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh. - Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao. - Tinh khiết dùng cho sắc ký. Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy metanol (MeOH), axetonitril (ACN) và tetrahiđrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất. Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải. Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ, độ nhớt, nhiệt độ sôi, độ phân cực, độ rửa giải… Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các pic sắc ký [18,22]. 1.1.4. Một số đại lượng đặc trưng trong phân tích sắc ký 1.1.4.1. Hệ số phân bố Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình như sau: Xpha động Xpha tĩnh. Hằng số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số phân bố và được tính như sau: Cs K (1.1) CM Với Cs: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh; CM: nồng độ cấu tử trong pha động. Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích. 1.1.4.2. Thời gian lưu t 'R  t R - t 0 (1.2) 4
tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra khỏi cột. t0 : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết ( t 'R : thời gian lưu thật của một cấu tử). Hình 1. 1. Thời gian lưu của cấu tử phân tích 1.1.4.3. Thể tích lưu trữ Trong sắc ký lỏng, thay vì dùng thời gian lưu, đôi khi người ta sử dụng khái niệm thể tích lưu VR. Tương tự ta cũng có các khái niệm thể tích không lưu giữ Vo và thể tích lưu hiệu chỉnh V’R. Thể tích lưu và thời gian lưu quan hệ theo hệ thức sau: VR =F.t R (1.3) Trong đó: F : lưu lượng dòng pha động đi qua cột tính bằng mL/phút VR : tính bằng mL tR : thời gian lưu tính bằng phút Tương tự ta có: VR' =F.t V ; V0' =F.t V ' R ' 0 Ưu điểm của việc sử dụng thể tích lưu là đại lượng này không phụ thuộc vào lưu lượng dòng pha động và V0 chính là thể tích rỗng của cột. 5
1.1.4.4. Hệ số dung lượng Hệ số dung lượng còn được gọi là hệ số lưu giữ được định nghĩa là tỉ số giữa thời gian lưu hiệu chỉnh và thời gian không lưu giữ thể hiện khả năng lưu giữ của cột đối với cấu tử và được tính theo công thức sau: t 'R t R -t 0 V ' V -V k= = ; k' = R = R 0 (1.4) t0 t0 V0 V0 k là tỉ lệ thời gian mẫu nằm trong pha tĩnh so với thời gian nằm trong pha động. Hay nói cách khác k là tỉ lệ giữa số mol chất tan trong pha tĩnh với số mol chất tan trong pha động. Hệ số dung lượng k càng lớn thì thời gian phân tích càng lâu, k = 5 ¸ 7 là lý tưởng nhất. 1.1.4.5. Hiệu quả tách của cột Hiệu quả tách của cột hay còn gọi là hiệu năng, số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách pic sắc ký của các cấu tử trên cột. Được tính theo công thức: L N= (1.5) H Hình 1. 2. Hiệu quả tách của cột Với: L : chiều dài của cột. H : chiều cao của một đĩa lý thuyết. B H được tính theo phương trình VanDeemter: H  A   C.u . u Với: A : Mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán xoáy (eddy diffusion). B : biểu thị sự khuếch tán dọc theo cột. C : trở lực chuyển khối trong đó C  Cm  Cs . 6
u : tốc độ dài của pha động (cm/phút). Đường cong VanDeemter Với tốc độ dòng gần với tốc độ tối ưu (được nghiên cứu kỹ với từng chất trên cột đặc trưng) thì: H  2,8.d p ( d p : kích thước hạt hấp phụ). Tuy nhiên thực tế không phải chất nào cũng được nghiên cứu kỹ về tốc độ dòng tối ưu nên thường tính số đĩa lý thuyết theo sắc ký đồ. Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức sau: 2 2 t   t  2 t  N   R   16  R   5,54  R  (1.6)    wb   wh  Trong đó: Wh là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao pic (phút) Wb là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy pic (phút) Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ. Ý nghĩa của số đĩa lý thuyết N  N càng lớn khả năng tách càng tốt, các pic sắc ký càng hẹp và nhọn (tốt).  N nhỏ khả năng tách kém, sẽ cho các pic tù và xấu (không tốt). 1.1.4.6. Độ chọn lọc Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột. k 'B a= (k 'B > k ' A ) (1.7) k 'A Trong đó: k 'A , k 'B là hệ số dung lượng của chất A và B. Độ chọn lọc  cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký,  càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ. 1.1.4.7. Độ phân giải Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách. Độ phân giải của hai pic cạnh tranh được tính theo 1 trong 3 công thức sau: 2´ (tRB - tRA ) 1,18´ (tRB - tRA ) a - 1 k 'B N RS = = = ´ ´ (1.8) WA + WB W1/2(A) + W1/2( B ) a 1 + k 'B 4 7
Trong đó: tRA ; tRB : Thời gian lưu tương ứng của chất A, chất B. W1/2(A) ;W1/2( B ) : Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic của chất A, chất B. WA ;WB : Chiều rộng pic ở đáy pic của chất A, chất B. α: Hệ số chọn lọc. N: số đĩa lý thuyết [1, 18, 22]. 1.1.5. Hệ thống máy HPLC Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản như sau: Hình 1. 3. Sơ đồ hệ thống HPLC Trong đó: 1: Bình chứa pha động 2: Bộ phận khử khí 3: Bơm cao áp 4: Bộ phận tiêm mẫu 5: Cộ sắc ký (pha tĩnh) 6: Đầu dò 7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống 8: In dữ liệu [22]. 1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử hay phương pháp trắc quang là phương pháp phân tích định lượng dựa vào hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi phân tử tương tác với bức xạ điện từ. Vùng bức xạ được sử dụng trong phương pháp này là vùng tử ngoại gần hay khả kiến ứng với bước sóng khoảng từ 8
200÷900nm. Hiện tượng hấp thụ bức xạ điện từ tuân theo định luật Bughe – Lămbe – Bia. Ứng dụng phương pháp phổ đo quang, người ta có thể xác định nhiều hợp chất trong phạm vi nồng độ khá rộng nhờ các cải tiến quan trọng trong thủ tục phân tích. Đây là phương pháp phân tích được phát triển mạnh vì nó đơn giản, đáng tin cậy và được sử dụng nhiều trong kiểm tra sản xuất hoá học, luyện kim và trong nghiên cứu hoá sinh, môi trường và nhiều lĩnh vực khác. Hình 1. 4. Máy quang phổ khả kiến (UV – Vis) 1.2.1. Định luật Bughe – Lămbe – Bia 1.2.1.1. Định luật Bughe – Lămbe – Bia Giả sử tồn tại một môi trường đồng nhất có chiều dày là b chứa chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng. Cho tia sáng đơn sắc có bước sóng λ và cường độ Io đi qua môi trường đó (tia sáng này không bị phản xạ, khúc xạ và tán xạ). Sau khi bị môi trường hấp thụ, dòng sáng yếu đi và chỉ còn cường độ I. Quan hệ giữa Io và I được xác định theo định luật Bughe – Lămbe – Bia: I  10   .b.C (1.9) I0 Io: Cường độ tia sáng chiếu qua môi trường đồng nhất I: Cường độ tia sáng đi ra khỏi môi trường đồng nhất. Gọi ε là hệ số hấp thụ nồng độ, hệ số này chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất màu và bước sóng ánh sáng hấp thụ, nếu nồng độ C được tính bằng mol/lít thì ε là hệ số hấp thụ phân tử gam và thường không lớn hơn 2.105; nếu C tính bằng nồng độ % thì ε là hệ số hấp thụ %…, b là chiều dày của dung 9
dịch hấp thụ ánh sáng, đo bằng cm, C là nồng độ chất màu, có thể là nồng độ I M, %, mg/mL… Đặt A   lg và gọi là độ hấp thụ quang, thì A = εbC. I0 Như vậy, định luật Bughe – Lămbe – Bia phát biểu như sau: độ hấp thụ quang của dung dịch hấp thụ màu tỉ lệ thuận với chiều dày của dung dịch hấp thụ màu và nồng độ chất màu có trong dung dịch đó. Định luật Bughe – Lămbe – Bia còn được gọi là định luật cơ bản của độ hấp thụ quang A [9,14]. 1.2.1.2. Tính chất quang học của chất hấp thụ ánh sáng Tính chất quan trọng nhất đó là tính cộng tính. Tính cộng tính này được thể hiện theo 3 nội dung sau: - Tính cộng tính theo chiều dày của dung dịch hấp thụ màu Nếu có thể chia dung dịch hấp thụ màu thành n phần nhỏ thì tổng độ hấp thụ quang của các tiểu phần là độ hấp thụ quang của toàn bộ dung dịch màu. Ứng dụng tính chất này, có thể tăng độ hấp thụ quang của dung dịch màu loãng bằng việc sử dụng cuvet có kích thước hơn lớn hoặc giảm độ hấp thụ quang của dung dịch màu có nồng độ lớn bằng việc sử dụng cuvet có kích thước nhỏ hơn, để việc đo độ hấp thụ quang đạt độ chính xác cao. Trong thực tế, chỉ sản xuất các cuvet có độ dày từ 0,1 đến 10cm, thường là cuvet 1cm. Không dùng các loại cuvet nhỏ hơn 0,1cm, vì lúc này rất khó rót dung dịch vào cuvet; không dùng các loại cuvet lớn hơn 10cm, vì lúc này sự khúc xạ ánh sáng quá lớn gây sai số phân tích. - Tính cộng tính theo nồng độ chất hấp thụ màu Nếu có thể chia nồng độ chất hấp thụ màu thành n phần nhỏ thì tổng độ hấp thụ quang của các tiểu phần là độ hấp thụ quang của toàn bộ dung dịch màu. Ứng dụng tính chất này, có thể tăng độ hấp thụ quang của dung dịch màu loãng bằng việc cách cho thêm chất màu hoặc giảm độ hấp thụ quang của dung dịch màu có nồng độ lớn bằng cách pha loãng dung dịch màu hay lấy lượng chất màu ít hơn để phân tích. - Tính cộng tính theo thành phần các chất hấp thụ màu 10