Luận văn Thạc sĩ Hóa hữu cơ: Nghiên cứu tạo phức hợp bao của B-Cyclodextrin với một số Polyphenol định hướng ứng dụng trong y sinh

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:76

Thêm vào BST

Báo xấu

51
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là thiết xuất và tinh chế thành công rutin từ hoa hòe có hàm lượng cao; bán tổng hợp thành công quercetin từ rutin bằng phương pháp thủy phân trong môi trường acid; tổng hợp thành công phức chất rutin/β-cyclodextrin, quercetin/2- hydroxypropyl-β-cyclodextrin với kích thước nano có độ tan cao hơn độ tan của rutin và quercetin thuần.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Hóa hữu cơ: Nghiên cứu tạo phức hợp bao của B-Cyclodextrin với một số Polyphenol định hướng ứng dụng trong y sinh

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Long Khánh LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: HÓA HỮU CƠ NGHIÊN CỨU TẠO PHỨC HỢP BAO CỦA B-CYCLODEXTRIN VỚI MỘT SỐ POLYPHENOL ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG Y SINH Hà Nội – tháng 11 năm 2020
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Long Khánh Lớp: Hóa Hữu cơ, Khóa 2018B LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ NGHIÊN CỨU TẠO PHỨC HỢP BAO CỦA B-CYCLODEXTRIN VỚI MỘT SỐ POLYPHENOL ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG Y SINH Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số: 8440114 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: TS. Phạm Thị Lan Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Thị Ngoan Hà Nội - 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình của bản thân. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực, chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2020 Tác giả Phạm Long Khánh 1
LỜI CẢM ƠN -------- Đầu tiên, tôi xin chân thành biết ơn TS. Phạm Thị Lan và TS. Nguyễn Thị Ngoan đã truyền đạt những kinh nghiệm nghiên cứu và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện công trình nghiên cứu và hoàn tất luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giảng dạy tại Học viện Khoa học và Công nghệ đã truyền đạt những tri thức khoa học uyên bác, nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi trân trọng cảm ơn các đồng chí cán bộ công tác tại Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong nhiệm vụ đo đạc, phân tích mẫu nghiên cứu trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi chân thành cảm ơn Ban giám đốc Học viện Khoa học và Công nghệ, các bạn học lớp Hóa Hữu cơ đã đồng hành và giúp đỡ tôi trong suốt hai năm học qua. Thành quả này tôi xin kính tặng hai đấng sinh thành–một đời hy sinh vì con. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn anh, chị luôn cổ vũ, động viên tôi, là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt khóa học. Chân thành cảm ơn! PHẠM LONG KHÁNH 2
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT ......................................................... 5 DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................................. 6 DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................................ 7 MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 9 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 11 1.1. KHÁI QUÁT VỀ NHÓM FLAVONOID VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC ... 11 1.1.1. Khái niệm chung về nhóm flavonoid ......................................................... 11 1.1.2. Đặc điểm cấu tạo phân tử của nhóm chất quercetin ............................... 12 1.1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của quercetin và rutin .......................... 14 1.1.4. Các phương pháp chiết xuất rutin từ hoa hòe và điều chế quercetin............... 16 1.2. CYCLODEXTRIN VÀ PHỨC HỢP THÀNH PHẦN LỒNG NHAU ........ 17 1.2.1. Khái quát về các cyclodextrin và β-cyclodextrin ..................................... 17 1.2.2. Phức chất thành phần lồng nhau ............................................................... 21 1.2.3. Các phương pháp điều chế phức hợp thành phần lồng nhau (phức hợp bao)…………………………………………………………………………………23 1.2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về phức nano của β- cyclodextrin. ............................................................................................................. 25 1.3. PHỨC HỢP BAO CỦA Β-CYCLODEXTRIN VỚI NHÓM QUERCETIN ……………………………………………………………………………...30 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 32 2.1. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ ............................................................................ 32 2.1.1 Thiết bị ......................................................................................................... 32 2.1.2 Dụng cụ ........................................................................................................ 32 2.2. CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ RUTIN TỪ HOA HÒE ................................... 32 2.2.1 Phương pháp chiết xuất rutin. ................................................................... 33 2.2.2 Tinh chế rutin .............................................................................................. 34 2.3. BÁN TỔNG HỢP QUERCETIN ................................................................. 35 2.4. TỔNG HỢP PHỨC NANO CỦA Β-CYCLODEXTRIN VỚI RUTIN VÀ QUERCETIN............................................................................................................. 36 2.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 36 2.5.1 Phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi Fourier ....................................... 36 2.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC ......................................................... 37 3
2.5.3 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR ........... 38 2.5.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ....................................... 40 2.5.5 Phương pháp phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis ........................................... 40 2.5.6 Phương pháp nhiệt lượng quét vi sai DSC ............................................... 42 2.5.7 Phương pháp kính hiển vi điện tử quét (SEM) ........................................ 43 2.5.8 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa .............................................. 43 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 44 3.1.1 ĐẶC TRƯNG TÍNH CHẤT CỦA RUTIN VÀ QUERCETIN ................... 44 3.1.1 Kiểm tra và xác định cấu trúc rutin và quercetin ................................... 44 3.1.2 Kiểm nghiệm độ tinh sạch rutin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. ......... 52 3.2.1 HIỆU SUẤT TỔNG HỢP PHỨC CỦA β-CYCLODEXTRIN VỚI MỘT SỐ POLYPHENOL TRONG DUNG MÔI HỖN HỢP H2O-EtOH ............................... 53 3.3.1 PHÂN TÍCH MỘT SỐ TÍNH CHẤT LÝ HÓA ĐẶC TRƯNG VÀ HÌNH THÁI CẤU TRÚC CỦA PHỨC HỢP β-CYCLODEXTRIN-POLYPHENOL ....... 55 3.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại ............................................................ 55 3.3.2 Kết quả phân tích DSC ............................................................................... 58 3.3.3 Kết quả phân tích hình thái cấu trúc ........................................................ 60 3.3.4 Kết quả xây dựng giản đồ pha của quá trình hoà tan ............................. 61 3.3.5 Kết quả xác định độ hòa tan của rutin và phức hợp [RuTβCD] ............ 63 3.3.6. Kết quả xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH của rutin và phức hợp [RuT-HPβCD] .......................................................................................................... 64 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 66 4.1 KẾT LUẬN ................................................................................................... 66 4.2 KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 68 4
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT 1 H-NMR Phổ cộng hưởng từ proton. 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 βCD β-cyclodextrin d doublet dd doublet of doublet DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DSC Phân tích nhiệt quét vi sai FTIR Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier GC Sắc ký khí HPβCD 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin m multiplet nm nanomet PCL Poly(-Caprolactone) PEO Poly(ethylene oxide) PLA Polylactide PMMA Poly(methyl methacrylate) Quer Quercetin s singlet RuT Rutin TEM Transmission Electron Microscopy TLC Thin Layer Chromatography m Micromet WHO The World Health Organization δH Độ dịch chuyển hóa học của proton δC Độ dịch chuyển hóa học của carbon 5
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Đặc tính của Cyclodextrin……………………………………………...…22 Bảng 3.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của quercetin bán tổng hợp và mẫu quercetin so sánh.....................................................................................55 Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của rutin phân lập từ hoa hòe và mẫu rutin so sánh...........................................................................................58 Bảng 3.3: Hiệu suất tổng hợp phức cyclodextrin-polyphenol trong dung môi hỗn hợp EtOH-H2O.............................................................................................61 Bảng 3.4: Bảng 3.5: Phương trình tương quan giữa % bắt gốc tự do DPPH và nồng độ dược chất của rutin và phức hợp và giá trị IC50 tương ứng................................75 6
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Khung cấu tạo phân tử flavonoid.........................................................13 Hình 1.2: Phân loại các flavonoid.......................................................................14 Hình 1.3: Cấu tạo phân tử quercetin...................................................................15 Hình 1.4: Cấu tạo phân tử rutin..................................................................... . .16 Hình 1.5: phản ứng thủy phân rutin trong môi trường axit........................... . .20 Hình 1.6: Cấu trúc hóa học và hình dạng phân tử của β-cyclodextrin (βCD)....21 Hình 1.7: Một số cyclodextrin tự nhiên điển hình……………………………….....21 Hình 1.8: So sánh cấu trúc βCD (R=H) và HPβCD (R=OH).............................24 Hình 1.9: Ảnh SEM của các hợp chất: (A) – lycopene; (B) – phức nano lycopene/βcyclodextrin sử dụng DCM làm dung môi; (C) – β-cyclodextrin; (D) – phức nano lycopene/βcyclodextrin sử dụng DMSO làm dung môi............29 Hình 1.10: Độ tan tương đối của dexibuprofen thuần, phức hợp với β-cyclodextrin và nano hydrogel β-cyclodextrin trong các dung dịch có pH bằng 1,2; 6,8 và nước cất pha tiêm (WFI)....................................................................30 Hình 1.11: Ảnh FE-SEM của β-cyclodextrin (a) và hạt nano hydrogel β- cyclodextrin (b)....................................................................................................30 Hình 1.12: Sơ đồ tạo phức chất của curcumin và β-cyclodextrin........................32 Hình 1.13: Hình ảnh minh họa cơ chế tạo phức nano của β-cyclodextrin với alginat............................................................................................................33 Hình 1.14: Ảnh SEM của β-cyclodextrin (a), alginat/Ca2+(b) và alginat/Ca2+/βcyclodextrin (c).............................................................................34 Hình 1.15: Ảnh SEM (a) và TEM với độ phóng đại 30000 (b) lần và 100000 (c) lần phức của ketoprofen với hạt nano alginat/Ca2+/β-cyclodextrin....................35 Hình 2.1: Sơ đồ chiết xuất, tinh chế từ nụ hoa hòe.............................................38 Hình 2.2: Chiết xuất rutin trong Na2CO3 2%......................................................39 Hình 2.3: Các mẫu khảo sát tinh chế rutin bằng axit acetic (1: dung dịch rutin thô trong nước, rutin Đ/c : dung dịch rutin đối chứng trong nước)…………..…41 Hình 2.4: Quercetin thu được sau tinh chế..........................................................42 Hình 2.5: Cách tính giá trị Rf. .............................................................................43 7
Hình 2.6: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng..................................................44 Hình 2.7: Khoảng chuyển dịch hóa học của một số proton.................................45 Hình 2.8: Khoảng chuyển dịch hóa học các dạng carbon chọn lọc....................46 Hình 3.1: Sắc ký bản mỏng đối chứng rutin (a) và quercetin (b) (A: rutin thu được từ nghiên cứu; B: rutin đối chứng; 1: quercetin thu được từ nghiên cứu; 2: quercetin đối chứng)…………………………………………………………….…..51 Hình 3.2: Sắc ký khảo sát quá trình thủy phân rutin trong HCl 5%....................52 Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của quercetin.................................................................53 Hình 3.4: Phổ 13C-NMR của quercetin................................................................54 Hình 3.5: Phổ 1H-NMR của rutin........................................................................56 Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của rutin.......................................................................57 Hình 3.7: Phổ HPLC mẫu rutin tinh chế trong axit acetic ( a: nồng độ axit acetic 20%; b: nồng độ axit acetic 30%; c: nồng độ axit acetic 40%; d: nồng độ axit acetic 50%)..........................................................................................................58 Hình 3.8: Phổ hồng ngoại của rutin (a), phức chất [RuβCD](b) và βCD(c)......62 Hình 3.9: Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier của Quer (1), HPβCD (2) và phức hợp [QuerHPβCD]..............................................................................................64 Hình 3.10: Các đường cong DSC của rutin (a); phức chất nano rutin (b) và β-CD (c)..................................................................................................................66 Hình 3.11:Các đường cong DSC của Quer (1), HPβCD (2) và phức hợp (3....)67 Hình 3.12: Ảnh FESEM của các hạt RuT (a), Quer (b), [RuTβCD] (c) và [QuerHPβCD] (d)...............................................................................................68 Hình 3.13: Phổ UV-Vis của quercetin khi không có HPβCD (đường cong a) và khi có HPβCD với nồng độ tăng dần (đường cong 1-5)...............................70 Hình 3.14: Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ của cyclodextrin và độ tan của RuT (a) và Quer (b)...........................................................................71 Hình 3.15: Phần trăm hòa tan của RuT và phức [RuT-βCD] theo thời gian trong môi trường pH 7,4.....................................................................................72 Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa % bắt gốc tự do DPPH của rutin và phức [RuT-HPβCD] theo giá trị nồng độ của rutin..............................73 8
MỞ ĐẦU Hiện nay, việc nghiên cứu và bào chế dược phẩm từ các nguồn nguyên liệu thiên nhiên đang là hướng nghiên cứu hấp dẫn bởi tính ưu việt, đa dạng và ít tác dụng phụ. Flavonoid là nhóm chất phổ biến trong thực vật, có mặt trong hầu hết các bộ phận của các loài thực vật bậc cao và có nhiều tác dụng sinh học. Rutin và quercetin là hai trong số rất nhiều hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh nhờ những hoạt tính quý báu như hoạt tính chống oxi hóa, chống dị ứng, kháng viêm, chống ung thư và khối u. Tuy nhiên, rutin và quercetin lại kém tan trong nước, do đó, liều lượng cần để đưa vào cơ thể khá lớn, độc tính cao, nhưng sinh khả dụng lại không đủ. Hiện nay, với việc ứng dụng công nghệ nano trong ngành sản xuất dược phẩm, độ tan của nhiều dược chất đã được cải thiện đáng kể. Trong đó, cyclodextrin được biết đến với khả năng bao gói giúp độ tan của nhiều loại dược chất được tăng lên rõ rệt. Do đó, trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu tạo phức hợp bao của β- cyclodextrin với một số polyphenol định hướng ứng dụng trong y sinh” rutin sẽ được chiết xuất và tinh chế từ hoa hòe có hàm lượng và hiệu suất cao; sau đó quercetin sẽ được bán tổng hợp từ rutin bằng phương pháp thủy phân trong môi trường axit; quá trình tạo phức với cyclodextrin để làm tăng độ tan của dược chất sẽ được tiến hành. Sản phẩm của quá trình tạo phức sẽ được phân tích đặc trưng bằng một số phương pháp hóa-lý hiện đại, đồng thời hoạt tính chống oxi của các hoạt chất sẽ được khảo sát. Mục tiêu của đề tài - Chiết xuất và tinh chế thành công rutin từ hoa hòe có hàm lượng cao. - Bán tổng hợp thành công quercetin từ rutin bằng phương pháp thủy phân trong môi trường acid. - Tổng hợp thành công phức chất rutin/β-cyclodextrin, quercetin/2- hydroxypropyl-β-cyclodextrin với kích thước nano có độ tan cao hơn độ tan của rutin và quercetin thuần. Nội dung nghiên cứu 9
- Chiết xuất rutin từ hoa hòe sử dụng dung dịch kiềm loãng Na2CO3 2%. - Tinh chế rutin bằng hai phương pháp: phương pháp kết tinh trong cồn và phương pháp kết tủa bằng acid-base. - Bán tổng hợp quercetin từ rutin trong môi trường axit. - Tổng hợp phức hợp của rutin và quercetin với cyclodextrin có kích thước nanomet. - Đặc trưng sản phẩm tạo phức, xác định độ tan của dược chất bằng các phương pháp hóa–lý hiện đại: FTIR, DSC, SEM, DLS, UV-Vis… - Xác định hoạt tính chống oxi hóa của rutin và quercetin trước và sau khi tạo phức bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Kết quả nghiên cứu của đề tài có ý nghĩa quan trọng trong việc chọn lựa các điều kiện thích hợp để cải thiện độ tan của một số flavonoid trong nhóm quercetin bằng phương pháp tạo phức hợp bao với cyclodextrin; là cơ sở cho việc nghiên cứu hoàn thiện và phát triển sản phẩm rutin, quercetin bao gói bằng cyclodextrin ứng dụng trong công nghệ thực phẩm và dược phẩm ở Việt Nam. Bên cạnh đó, các kết quả nghiên cứu sẽ được sử dụng trong các bài giảng và phòng thí nghiệm trong các khóa học dành cho cử nhân và thạc sĩ chuyên ngành "Hóa lý và hóa lý thuyết", và “hóa hữu cơ”. 10
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. KHÁI QUÁT VỀ NHÓM FLAVONOID VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC 1.1.1. Khái niệm chung về nhóm flavonoid Flavonoid là nhóm chất phổ biến trong thực vật, có mặt trong hầu hết các bộ phận của các loài thực vật bậc cao và có nhiều tác dụng sinh học. Có thể mô tả khung công thức phân tử của flavonoid là: C6 (vị trí A) - C3 (vị trí C) - C6 (vị trí B), chúng còn được gọi là polyphenolic do các tiểu phần có cấu trúc từ vòng thơm benzen (hình 1.1). Flavonoid được ví von như “những người thợ sửa chữa sinh hóa của thiên nhiên” nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống dị ứng, virus và các chất gây ra ung thư. Nhờ vậy chúng mang lại những hoạt tính quý báu. Có thể nói hoạt tính chống oxi hóa là hoạt tính đặc trưng nhất của các hợp chất flavonoid nhờ vào các đặc điểm cấu trúc phân tử như sau [1]: - Chứa các nhóm hydroxy liên kết trực tiếp với vòng thơm có khả năng nhường hydro giúp các flavonoid có thể tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử, bắt giữ các gốc tự do. - Chứa các vòng thơm (vòng benzen, vòng dị nguyên tố) và các liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên hợp giúp bền hóa các gốc tự do được hình thành khi chúng bắt giữ các phần tử oxi hoạt động. - Chứa nhóm có thể tạo phức chuyển tiếp với các ion kim loại như catechol giúp làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxi hoạt động. Hình 1.1: Khung cấu tạo phân tử flavonoid. 11
Các flavonoid có thể được chia nhỏ thành các phân nhóm khác nhau tùy thuộc vào vị trí cacbon của vòng C mà vòng B gắn vào cùng mức độ không bão hòa và oxy hóa của vòng C (hình 1.2). Các flavonoid có vòng B được liên kết ở vị trí C-3 của vòng C được gọi là isoflavone. Những chất trong đó vòng B được liên kết ở vị trí C-4 được gọi là neoflavonoid, trong khi những chất trong đó vòng B được liên kết ở vị trí C-2 có thể được chia nhỏ hơn nữa thành nhiều nhóm con trên cơ sở đặc điểm cấu trúc của vòng C. Các phân nhóm này là: flavon, flavonols, flavanones, flavanonol, flavanols hoặc catechin, anthocyanins và chalcones [2]. Hình 1.2: Phân loại các flavonoid. 1.1.2. Đặc điểm cấu tạo phân tử của nhóm chất quercetin Quercetin được phân loại là flavonol, một trong sáu phân lớp của các hợp chất flavonoid. Theo IUPAC, công thức phân tử quercetin là 3,3',4',5,7- pentahydroxyflavanone (hoặc 3,3',4',5,7-pentahydroxy-2-phenylchromen-4-one). Trong cấu tạo, quercetin có 5 nhóm OH gắn ở các vị trí 3, 5, 7, 3’ và 4’ (hình 1.3) [3]. 12
Hình 1.3: Cấu tạo phân tử quercetin. Quercetin là một aglycone, không gắn thêm gốc đường. Quercetin có màu vàng, hoàn toàn không hòa tan trong nước lạnh, hòa tan kém trong nước nóng, nhưng hòa tan khá tốt trong rượu và lipid. Một glycoside quercetin được hình thành bằng cách gắn một nhóm glycosyl (đường như glucose, rhamnose, hoặc rutinose) để thay thế cho một trong các nhóm OH (thường ở vị trí C-3). Nhóm glycosyl kèm theo có thể thay đổi độ hòa tan, hấp thụ. Theo nguyên tắc chung, sự hiện diện của nhóm glycosyl (quercetin glycoside) làm tăng khả năng hòa tan trong nước so với quercetin aglycone [4]. Một số dẫn xuất quercetin cũng chứa disaccharide, chẳng hạn như rutinose, bao gồm rhamnose và nhóm glucose và được đặt tên là α-L- rhamnopyranosyl- (1→6)- β-D-glucopyranose. Avicularin chứa arabinofuranose gắn với quercetin 3-OH. Hyperoside có nhóm 3-O-galactoside (oxy liên kết với nhóm galactoside) ở vị trí C-3 chứ không phải là nhóm OH. Isoquercitin (được tìm thấy trong xoài) có 3-O-glucoside [5]. Hình 1.4: Cấu tạo phân tử rutin. 13
Rutin (3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavone-3-rhamnoglucoside) là một loại flavonoid thuộc nhóm flavon được phân lập lần đầu tiền vào năm 1842 từ cây Cửu lý hương (Ruta graveolen) bởi Veyss [6]. Rutin cũng được coi là một loại vitamin P dạng glycoside chính (một dạng 3- Orhamnoglucoside) của quercetin (hình 1.4). Bột rutin còn có đặc điểm là bột kết tinh màu vàng hoặc hơi vàng ánh xanh, để ngoài ánh sáng màu có thể hơi sẫm lại. Tinh thể rutin ngậm 3 phân tử nước, chuyển sang dạng khan khi sấy 12 giờ ở 100°C dưới áp suất giảm (10mmHg). Do cấu trúc là một glycoside nên rutin rất dễ bị thủy phân bởi các men có sẵn trong dược liệu hoặc bởi các axit. Với dung dịch kiềm nó rất ít bị ảnh hưởng, chỉ ở điều kiện dung dịch kiềm đặc và có nhiệt độ cao thì cấu trúc của rutin bị phá vỡ, cụ thể là vòng C sẽ mở tạo thành một dẫn chất acid thơm và một dẫn chất phenol [6]. 1.1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của quercetin và rutin Quercetin là một trong những bioflavonoid quan trọng có trong hơn 20 loại thực vật, được biết đến với tác dụng chống viêm, hạ huyết áp, giãn mạch, chống vi khuẩn và chống tăng cholesterol máu. Một số tác dụng có lợi khác bao gồm bảo vệ tim mạch, chống ung thư và khối u, chống loét, chống dị ứng, chống tiểu đường, tác dụng bảo vệ dạ dày, hạ huyết áp, điều hòa miễn dịch và chống nhiễm trùng. Người ta cũng phát hiện ra rằng quercetin và các chất chuyển hóa liên hợp của quercetin có thể bảo vệ hồng cầu khỏi tổn thương màng do hút thuốc gây ra [7], [8]. Quercetin kết hợp với axit ascorbic làm giảm tỷ lệ tổn thương do oxy hóa đối với các tế bào lympho và cấu trúc mạch thần kinh trên da và ức chế tổn thương tế bào thần kinh. Nó được biết là có tác dụng bảo vệ tế bào não chống lại oxy hóa, tác nhân làm tổn thương mô dẫn đến bệnh Alzheimer và các bệnh thần kinh khác [9]. Quercetin có đặc tính chống ung thư mạnh và được biết đến như là chất cảm ứng apoptosis, nhờ đó làm giảm sự phát triển của khối u trong não, gan, ruột kết và các mô khác và ức chế sự lây lan của các tế bào ác tính. Quercetin ức chế Cr[VI], 14
một biến đổi tế bào gây ung thư hóa học làm giảm khả năng hiển thị của tế bào, tạo ROS và tăng MicroRNA-21 (miR-21) trong ung thư ruột kết ở người [10], [11]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng quercetin ức chế tiết axit dạ dày và quá trình peroxy hóa lipid của tế bào dạ dày do đó đóng vai trò như chất bảo vệ dạ dày. Nó cũng ức chế sự lây nhiễm Helicobacter pylori [7]. Quercetin được biết là có tác dụng kháng khuẩn đối với hầu hết các chủng vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn ảnh hưởng đến hệ tiêu hóa, hô hấp, tiết niệu và da. Khả năng chống nhiễm trùng và chống tái phát của chúng có thể góp phần vào các đặc tính kháng vi-rút. Các loại virus thường phản ứng với quercetin là adenovirus, virus herpes simplex, virus viêm não Nhật Bản và virus hợp bào hô hấp [12], [13], [14]. Quercetin có tác dụng chống dị ứng bằng cách ức chế giải phóng histamine từ các tế bào mast và các chất dị ứng khác, do đó hoạt động như một chất kháng histamine tự nhiên. Khả năng ngăn ngừa các tác động dị ứng của quercetin có ý nghĩa to lớn trong việc điều trị và phòng ngừa bệnh hen suyễn và viêm phế quản [15]. Tương tự quercetin, rutin cũng đã được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong y học hiện đại. Rutin có tác dụng làm bền vững thành mạch, làm giảm tính thấm của mao mạch, tăng sự bền vững của hồng cầu. Rutin có hoạt tính của vitamin P bởi vì cấu trúc có 2 nhóm OH phenolic tự do. Rutin thể hiện hoạt tính chống đái tháo đường bằng cách ức chế các cytokine gây viêm, đồng thời cải thiện khả năng chống oxy hóa và lipid huyết tương trong chế độ ăn nhiều chất béo của người bệnh tiểu đường týp 2 do streptozotocin gây ra. Do đó, rutin hữu ích trong điều trị bệnh tiểu đường cùng với các loại thuốc trị tiểu đường tiêu chuẩn [16]. Rutin có thể đóng vai trò như một tác nhân tiềm năng để kiểm soát đường huyết thông qua việc tăng cường hoạt động kinase của thụ thể phụ thuộc insulin, từ đó tạo ra đường truyền tín hiệu insulin và làm tăng chuyển vị của chất vận chuyển glucose 4 và tăng hấp thu glucose [17]. Rutin bảo vệ chống lại các tác động thoái hóa thần kinh của sự tích tụ prion bằng cách tăng sản xuất các yếu tố hướng thần kinh và ức chế sự kích hoạt 15
apoptotic trong các tế bào thần kinh. Những kết quả này cho thấy rutin có thể có lợi ích lâm sàng đối với các bệnh prion và các rối loạn thoái hóa thần kinh khác [18]. Rutin hữu ích như một chất bổ trợ trong điều trị bằng chất phóng xạ, vì flavonoid này làm tăng sự hấp thụ iodide của tuyến giáp mà không ảnh hưởng nhiều đến chức năng tuyến giáp [19]. 1.1.4. Các phương pháp chiết xuất rutin từ hoa hòe và điều chế quercetin Rutin thường được chiết xuất bằng nước, dung dịch kiềm hoặc một số ancohol như ethanol, methanol... Chiết xuất rutin bằng dung dịch kiềm và axit loãng: Phương pháp của tác giả T.R.Seshadri: hoa hòe được chiết xuất bằng dung dịch nước chứa hỗn hợp NaOH và boric (tỉ lệ 1:2). Lọc, axit hóa dịch chiết thu được rutin với hiệu suất 13% [20]. Phương pháp của các tác giả Nguyễn Văn Đàn- Đỗ Tất Lợi: Cân 200g hoa hòe đã sấy khô ở 60-70oC, thêm vào 2L nước, đun sôi trong 1 giờ. Lọc nóng qua vải, bã còn lại đun với lượng nước mới và lọc (làm 3 lần). Gộp chung tất cả các dịch lọc, để nguội có rutin kết tủa vàng (thô). Kết tinh lại rutin thô bằng cách hòa tan trong nước sôi, lọc nóng, để nguội. Rutin kết tủa, lọc lấy sản phẩm, sấy khô ở 70oC thu được bột rutin màu vàng thẫm [20]. Phương pháp của nhóm tác giả thuộc viện Nghiên cứu và phát triển sản phẩm thiên nhiên (IRDOP) hoa hòe giã dập, rửa bằng HCl 0,5% rồi rửa bằng nước cho hết axit. Chiết bằng dung dịch Na2CO3 1% hoặc natri borat 1-3%. Rutin sẽ tan nhiều do có chức phenol trong phân tử. Rút dịch chiết ra và tiếp tục chiết cho đến khi hết rutin (3-4 lần). Gộp các dịch chiết lại, dùng HCl điều chỉnh đến pH=2 ta có rutin kết tủa. Lọc và rửa tủa bằng nước đến pH=4-5. Hoà tan, kết tinh lại trong cồn thu được rutin tinh khiết [20]. Chiết xuất rutin bằng ancohol: Phương pháp của nhóm tác giả Rusu, Mircea, Eugenia: Nụ hòe hoặc hoa hòe được chiết bằng MeOH-H2O, lọc bỏ bã thu được thể huyền phù. Sau đó cho hỗn 16
hợp isopropanol-dầu (1:1) vào, đem lọc thu được rutin thô. Rutin thô được xử lý bằng NaHCO3-NH3. Tinh chế lại lần nữa bằng EtOH [20]. Đun hồi lưu 1 kg hoa hòe sấy khô với 4L cồn 90 o trong 2 giờ. Rút dịch chiết, bã còn lại đun với 4L cồn mới và lọc (làm lại 3 lần). Gộp chung dịch lọc rồi cất thu hồi dung môi đến khi còn 5L cồn. Đề nguội thu được rutin thô. Kết tinh lại rutin thô trong cồn, tẩy màu bằng than hoạt ta có rutin tinh khiết. Phương pháp chiết bằng cồn cho hiệu suất cao, tỷ lệ rutin trong hoa hoè có thể lên đến 20-30% [21]. Điều chế quercetin bằng thủy phân rutin: Hình 1.5: phản ứng thủy phân rutin trong môi trường axit. Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Jinwoo Yang và cộng sự, rutin được hòa tan trong hỗn hợp dung môi axit và cồn (80% etanol và HCl 1,0 M trong nước). Dung dịch được lắc trong máy lắc cách thủy ở 75°C trong 5 giờ với sinh hàn hồi lưu. Khi phản ứng hoàn tất, sản phẩm phản ứng là quercetin được làm lạnh trong nước lạnh. Dung môi của sản phẩm phản ứng được loại bỏ bằng cách cô quay chân không và đông khô [22]. 1.2. CYCLODEXTRIN VÀ PHỨC HỢP THÀNH PHẦN LỒNG NHAU 1.2.1. Khái quát về các cyclodextrin và β-cyclodextrin Cyclodextrin là một nhóm các sản phẩm tự nhiên được hình thành trong quá trình tiêu hóa cellulose của vi khuẩn. Cyclodextrin có cấu trúc là các oligosaccarit tuần hoàn, bao gồm các đơn vị α-D-glucopyranose liên kết với nhau, tạo ra khoang trung tâm ưa dầu và bề mặt ngoài ưa nước. Do cấu tạo dạng ghế của các đơn vị glucopyranose, cyclodextrin có hình dạng giống một hình nón cụt hơn là hình trụ hoàn hảo. Các nhóm chức hydroxyl được định hướng ra bên ngoài hình nón, các nhóm hydroxyl chính của phần đường ở cạnh hẹp của hình nón và các nhóm 17
hydroxyl thứ cấp ở cạnh rộng hơn. Khoang trung tâm được nối bởi khung nguyên tử carbon và oxy thuộc nhóm ether của phần glucose, tạo cho nó một đặc tính lipophilic. Độ phân cực của khoang được ước tính tương tự như dung dịch etanolic. Các α-, β- và γ-cyclodextrin tự nhiên bao gồm lần lượt sáu, bảy và tám đơn vị glucopyranose tương ứng [23]. Hình 1.6: Cấu trúc hóa học và hình dạng phân tử của β-cyclodextrin (βCD). Các α- và β-cyclodextrin tự nhiên không giống như γ-cyclodextrin, không thể bị thủy phân bởi các amylase trong nước bọt và tuyến tụy của con người. Tuy nhiên, cả α- và β-cyclodextrin đều có thể được lên men bởi hệ vi sinh đường ruột. Cyclodextrin hydrophilic được coi là không độc hại ở liều uống thấp đến trung bình. Các dẫn xuất cyclodextrin lipophilic, chẳng hạn như cyclodextrin bị methyl hóa, ở một mức độ nào đó được hấp thụ từ đường tiêu hóa vào hệ tuần hoàn và đã được chứng minh là độc hại sau khi tiêm tĩnh mạch [20]. Hình 1.7: Một số cyclodextrin tự nhiên điển hình. 18