intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên cây Cam Hàm Yên - Tuyên Quang và tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của chúng

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:64

Thêm vào BST
Báo xấu
30
lượt xem 8
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục nhằm phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh trên rễ và cành trên các mẫu rễ và cành của cây cam Hàm Yên- Tuyên Quang; tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây cam Hàm Yên - Tuyên Quang có khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn và kháng nấm cao; nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên cây Cam Hàm Yên - Tuyên Quang và tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của chúng

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ........................ ĐÀO ÁNH VÂN NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY CAM HÀM YÊN - TUYÊN QUANG VÀ TIỀM NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG NẤM CỦA CHÚNG LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã ngành :60 42 01 03 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. PHAN THỊ HỒNG THẢO Hà Nội - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi .Các số liệu, kế t quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác . Tôi xin cam đoan rằ ng mo ̣i sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã đươ ̣c cảm ơn và các thông tin trić h dẫn trong Luận văn đã đươ ̣c chỉ rõ nguồ n gố c . Hà Nội, Ngày 25 tháng 11 năm 2015 Học viên Đào Ánh Vân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
  3. LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phan Thị Hồng Thảo – Trưởng phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam người đã truyền thụ cho tôi những kiến thức chuyên ngành, hướng dẫn, định hướng nghiên cứu và tận tình giúp đỡ tôitrong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình học tập Xin chân thành cảm ơn các cán bộ Phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Tôi xin cám ơn sự hỗ trợ kính phí thực hiện từ đề tài “Nghiên cứu sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trên cây có múi đặc sản ở miền Bắc Việt Nam và tiềm năng sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn và kích thích tăng trưởng thực vật của chúng” Mã số đề tài: VAST.ĐLT.12/15-16 thuộc cấp quản lý Viện Hàn lâm KHCNVN vàPhòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và cung cấp các thiết bị để tôi có thể tham gia thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn quan tâm giúp đỡ và động viên tôi để có được thành quả ngày hôm nay. Hà Nội, Ngày 25 tháng 11 năm 2015 Học viên Đào Ánh Vân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
  4. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Tên viết tắt Tên đây đủ 1 CFU Đơn vị hình thành khuẩn lạc 2 DNA Deoxyribosenucleoic Acid 3 EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid 4 HTKS Hoạt tính kháng sinh 5 ISP Internationl Streptomyces Project 6 KTCC Khuẩn ty cơ chất 7 KTKK Khuẩn ty khí sinh 8 PCR Polymerase Chain Reaction: Phản ứng khuếch đại gen 9 rDNA Ribosomal Deoxyribosenucleoic Acid 10 RNA Ribonucleic acid 11 rRNA Ribosomal Ribonucleic acid 12 SDS Sodium dodecyl sulfate 13 TAE Tris-acetat EDTA 14 VSV Vi sinh vật Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội cộng sinh 13 trên thực vật. 3.1 Kết quả phân lập xạ khuẩn nội sinh từ mẫu rễ Cam Hàm Yên Tuyên Quang 27 trên một số môi trường khác nhau 3.2 Tỷ lệ các xạ khuẩn phân lập chia theo đa dạng nhóm màu 30 3.3 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn 30 3.4 Số lượng các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập có khả năng đối kháng với 31 các chủng nấm và vi khuẩn kiểm tra 3.5 Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng sinh của 4 chủng xạ khuẩn lựa chọn được 32 nuôi cấy trên môi trường dịch thể ISP2 sau 5 ngày 3.6 Đặc điểm nuôi cấy của xạ khuẩn nội sinh C12 và R12-4 trên các môi trường 33 ISP 3.7 Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn sau 14 36 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30C 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl trong môi trường ban đầu đến khả năng sinh 37 trưởng và phát triển của 4 chủng xạ khuẩn tuyển chọn 3.9 Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến khả năng sinh trưởng của 4 37 chủng xạ khuẩn tuyển chọn 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu đến khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ 37 khuẩn tuyển chọn 3.11 khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của các chủng xạ khuẩn 38 3.12 So sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng R12-4 với gen tương ứng 39 của các chủng xạ khuẩn được đăng ký trên GenBank 3.13 Môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm của hai chủng 40 xạ khuẩn C12 và R12-4 3.14 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi đến sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm 41 3.15 Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm của hai chủng xạ 41 khuẩn lựa chọn 3.16 Lựa chọn dung môi để chiết hoạt chất kháng nấm từ dịch lên men và sinh 42 khối 3.17 Ảnh hưởng của các pH chiết khác nhau đến khả năng chiết chất kháng nấm 43 3.18 Xác định độ bền nhiệt đến hoạt tính kháng nấm của chủng R12-4 44 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
  6. Hình Tên hình Trang 3.1 Hình ảnh minh họa kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh trên 29 một số môi trường sau 6 tuần nuôi cấy 3.2 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân lập theo bộ phận của cây Cam Hàm Yên – 29 Tuyên Quang 3.3 Khả năng đối kháng của một số chủng xạ khuẩn phân lập với nấm 31 3.4 Xạ khuẩn C12 và R12-4 đối kháng với nấm 32 3.5 Khuẩn lạc xạ khuẩn C12 trên các môi trường ISP 34 3.6 Khuẩn lạc xạ khuẩn R12-4 trên các môi trường ISP 34 3.7 Cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử và hình da ̣ng bào tử của xạ khuẩn 35 nội sinh C12 3.8 Cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử và hình da ̣ng bào tử của xạ khuẩn 35 nội sinh R12-4 3.9 Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn R12-4 và C12 36 sau 14 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 28C 3.10 Điện di đồ DNA tổng số của hai chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 trên gel 38 agarose 1,0 %. 3.11 Điện di đồ sản phẩm PCR của chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 với cặp 38 mồi sử dụng 27F và 1492R trên gel agarose 1,0% 3.12 Mức độ tương đồng di truyền giữa chủng Streptomyces angustmyceticus 39 C12 với các loài xạ khuẩn có họ hàng gần dựa vào 16S rRNA 3.13 Độ bền của chất kháng nấm với nhiệt 44 3.14 Độ bền của chất kháng nấm với pH 45 3.15 Khả năng bền với pH của chất kháng nấm 45 3.16 Hoạt chất kháng nấm của kháng sinh tinh sạch 46 3.17 Hình ảnh quang phổ hấp thu điện tử UV VIS của kháng sinh tinh sạch 46 3.18 Hình ảnh phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh sạch 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
  7. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3 1.1. Xạ khuẩn nội sinh trong thực vật ......................................................................... 3 1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn .......................................................................... 3 1.1.2. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ......................................................................... 6 1.1.3. Mối quan hệ giữa thực vật và xạ khuẩn nội sinh .............................................. 8 1.1.4. Con đường xâm nhập của vi sinh vật vào cây chủ ........................................... 8 1.1.5. Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh ................................................. 9 1.1.6. Phân loại xạ khuẩn nội sinh .......................................................................... 10 1.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh và tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh .................................................................................................................................... 12 1.2.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh ........................................................ 12 1.2.2. Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh ................................................... 15 1.3. Cây có múi và khả năng thu nhận các thể nội sinh ............................................ 17 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 20 2.1. Vật liệu ................................................................................................................ 20 2.1.1. Mẫu cây ........................................................................................................ 20 2.1.2. Vi sinh vật kiểm định:.................................................................................... 20 2.1.3. Hóa chất và thiết bị ....................................................................................... 20 2.1.4. Môi trường nghiên cứu.................................................................................. 21 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 22 2.2.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh từ các mô sống của các mẫu thực vật 22 2.2.2. Đánh giá khả năng đối kháng của xạ khuẩn .................................................. 22 2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn ................................................. 23 2.2.4. Phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA ....................................................... 24 2.2.5.Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh ............................................ 24 2.2.6. Phương pháp xác định một số tính chất của chất kháng nấm và kháng khuẩn 26
  8. Phần III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 27 3.1. Phân lập và sàng lọc các chủng xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm trên cây Cam Hàm Yên – Tuyên Quang. .............................. 27 3.1.1. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây cam Hàm Yên – Tuyên Quang ..................................................................................................................... 27 3.1.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh chất kháng nấm, kháng khuẩn ........................................................................................................... 30 3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn ....... 32 3.2.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý và đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn lựa chọn........................................................................................................................ 32 3.2.2. Đặc điểm sinh học của hai chủng xạ khuẩn lựa chọn .................................... 35 3.3. Nghiên cứu môi trƣờng và điều kiện sinh tổng hợp chất kháng nấm của hai chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn ............................................................................. 40 3.3.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm ........................................................................................................................ 40 3.4. Nghiên cứu một số tính chất hoá lý của hoạt chất kháng nấm thu nhận từ chủng R12-4. .............................................................................................................. 42 3.4.1. Tách chiết chất kháng nấm ............................................................................ 42 3.4.2. Khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh ....................................................... 43 3.4.3. Khả năng bền với pH của chất kháng nấm .................................................... 45 3.4.4. Tinh sạch và thu nhận chất kháng sinh ......................................................... 46 PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 48 KẾT LUẬN .................................................................................................................... 48 KIẾN NGHỊ................................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 49 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 53
  9. Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân MỞ ĐẦU Cây có múi là tên gọi chung của nhóm cây cam, chanh, quýt, bưởi... cùng họ Rutaceae. Cây ăn trái có múi được trồng ở hơn 100 quốc gia. Đây là loại quả có tầm quan trọng hàng đầu thế giới, với sản lượng năm 2009 đạt hơn 120 triệu tấn, trong đó cam chiếm 54% [15, 42, 46], bao gồm cả Việt Nam, tại vùng cam nổi tiếng Hàm Yên - Tuyên Quang hiệu quả kinh tế thu về khá cao. Tuy nhiên, việc trồng cây có múi phải đối mặt với một số vấn đề là cây tăng trưởng chậm, côn trùng, sâu bệnh... [41].Bên cạnh đó, sự phát triển nhanh chóng các vùng trồng và sử dụng lượng hóa chất nông nghiệp thiếu kiểm soát trong nước dẫn đến những tác động tiêu cực về sản xuất, môi trường, chất lượng đất, sức khỏe con người, vật nuôi và ngày càng nhiều vi sinh vật gây bệnh có khả năng kháng các loại thuốc bảo vệ thực vật thông dụng. Vì vậy, việc tìm kiếm và ứng dụng các vi sinh vật để kiểm soát sinh học, kích thích tăng trưởng thực vật là một phương pháp thay thế để giảm sử dụng hoá chất nông nghiệp. Trong số các loài vi sinh vật, xạ khuẩn có vị trí quan trọng do sự đa dạng cao, khả năng sinh tổng hợp nhiều chất có hoạt tính sinh học như enzym, chất kích thích sinh trưởng thực vật, thuốc kháng sinh dùng trong nông nghiệp và y học... Đặc biệt là các loài xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật sống (lá, cành, rễ). Các loài xạ khuẩn sống nội sinh trong thực vật có khả năng tích hợp với cây chủ và sinh tổng hợp một số chất chuyển hóa thứ cấp có lợi cho cây chủ của mình. Đó là một trong những hệ sinh thái đặc biệt và khó tiếp cận, nơi mà xạ khuẩn nội sinh có vai trò quan trọng trong sự phát triển của cây chủ, chúng có thể ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây bằng con đường đồng hóa các chất dinh dưỡng, kích hoạt hệ thống miễn dịch và sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp, giúp cây chủ hạn chế bệnh và kích thích sinh trưởng cho cây[22, 23]. Trong mối quan hệ tương hỗ với cây chủ, vi sinh vật nội sinh cũng nhận được từ cây chủ các chất dinh dưỡng để sinh trưởng. Đến nay, đã có nhiều nghiên cứu công bố về khả năng sản sinh các chất thứ cấp tiêu diệt nhiều loài nấm bệnh và sinh tổng hợp các kháng sinh mới như munumbicin, kakadumycin và coronamycin của các loài xạ khuẩn nội sinh. Như vậy, xạ khuẩn nội sinh thực sự là những ứng cử viên tiềm năng trong kiểm soát sinh học cho tương lai. Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây cam và cây có múi nói chung tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên cây Cam Hàm Yên- Tuyên Quang và tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của chúng” Mục tiêu cơ bản của đề tài: Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 1
  10. Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây Cam tại Hàm Yên Tuyên Quang có tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng nấm cao. Nội dung nghiên cứu của đề tài: 1. Phân lậpcác chủng xạ khuẩn nội sinh trên rễ và cành trên các mẫu rễ và cành của cây cam Hàm Yên- Tuyên Quang. 2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây cam Hàm Yên –Tuyên Quang có khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn và kháng nấm cao. 3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn. 4. Nghiên cứu môi trường và điều kiện sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm của các chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn 5. Nghiên cứu một số tính chất hoá lý của hoạt chất kháng nấm thu nhận từ xạ khuẩn R12-4. Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 2
  11. Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Xạ khuẩn nội sinh trong thực vật 1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc nhóm Prokaryote, thuộc giới Monera trong 5 giới của Whittaken, còn theo hệ thống phân loại chia sinh giới thành 7 giới thì xạ khuẩn thuộc giới Prokaryote. Xạ khuẩn có mặt chủ yếu trong đất, trong nước ao hồ, trong bùn và trong chất hữu cơ khác, thậm trí trong cả cơ chất mà các vi khuẩn và nấm mốc không sinh trưởng được [9]. a. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn * Cấu tạo tế bào xạ khuẩn Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn G(+), toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 ÷ 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 ÷ 120Å, khi già có thể đạt tới 150 ÷ 200Å, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50Å, lớp trong dày khoảng 50Å. Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - β glucozit. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào[3, 9]. Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính, bao gồm: Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này. Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic (meso - ADP) và glyxin. Thuộc nhóm này gồm các chi : Micromonospora, Actinoplanes, Ampullarriella… Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -diaminopimelic. Thuộcnhóm này có các chi: Dermatophilus, Geodermatophilus, Frankia… Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 3
  12. Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -diaminopimelic, arabinose và galactose. Thuộc nhóm này gồm các chi: Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia…[8,11]. Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn. Tế bào chất của xạ khuẩn có chứa mezoxom, thể nhân, và các vật thể ẩn nhập gồm các hạt poliphotphat và polixacarit. Nhân của tế bào xạ khuẩn không có cấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có 1 nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty…[8, 11]. * Khuẩn lạc, khuẩn ty xạ khuẩn Hình thái của khuẩn lạc xạ khuẩn rất khác nhau, kích thước và hình dạng của chúng thay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm…). Trên môi trường đặc, xạ khuẩn sinh trưởng thành những khuẩn lạc khô, kích thước thay đổi. Mặt khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng đá vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và bám sâu [8]. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có 3 lớp: lớp vỏ ngoài có các sợi bện chặt, lớp trong đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, tím, nâu… tùy thuộc vào từng loại và điều kiện ngoại cảnh như: pH, nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn được phân biệt ở hướng sinh trưởng trong và ngoài môi trường tạo thành khuẩn ty cơ chất (KTCC) và khuẩn ty khí sinh (KTKS). Các KTCC cắm sâu vào môi trường để lấy chất dinh dưỡng, còn KTKS thì phát triển ra ngoài không khí, phần cuối của khuẩn ty này thường biến thành cuống sinh bào tử. Khuẩn ty xạ khuẩn mảnh hơn khuẩn ty của nấm mốc và có đường kính thay đổi trong khoảng từ 0,2 ÷ 1,0 m đến 2 ÷ 3 m. Đa số xạ khuẩn có khuẩn ty không có vách ngăn và không tự đứt đoạn [3]. Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhưng lại là cơ thể đơn bào, Gram (+), không có nhân thực và có kích thước giống vi khuẩn. Mặc dù thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhưng xạ khuẩnthường sinh trưởng dưới dạng sợi và tạo nhiều bào tử. Một bào tử xạ khuẩn khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau 1÷ 2 giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN, nhân các gen cần thiết từ hệ gen và tiến hành tổng hợp protein hình thành KTKS. Đầu KTKS kéo dài và phát triển hệ sợi theo phương pháp mọc chồi phân nhánh (khoảng 30 m phân 1 nhánh). Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đoạn phát triển khoảng 11 m/1 giờ và nhân của xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của khuẩn ty [9]. Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 4
  13. Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân b. Đặc điểm sinh trưởng của xạ khuẩn Phần lớn xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, nhưng không phải là hiếu khí nghiêm ngặt. Tùy theo xuất xứ mà chúng là vi sinh vật ưa ấm hoặc ưa nhiệt, thậm chí có loài phát triển được ở những nhiệt độ bằng hoặc cao hơn 50°C. Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh trưởng tốt ở dải nhiệt độ từ 25 ÷ 37°C, còn các chủng ưa nhiệt phát triển tốt ở 45 ÷ 50°C. Xạ khuẩn phát triển tốt ở môi trường trung tính và hơi kiềm, phát triển chậm hoặc không phát triển khi pH của môi trường quá axit hoặc kiềm. Xạ khuẩn thuộc loài dị dưỡng, chúng sử dụng nguồn cacbon là tinh bột, các loại đường (glucose, maltose, saccarose…) và các hợp chất polysacaride. Nguồn nitơ vô cơ thường là: nitrate, muối amon…, nitơ hữu cơ thường là: pepton, cao ngô, cao nấm men. Khả năng đồng hóa các chất này ở các chủng xạ khuẩn khác nhau là không giống nhau. Phần lớn xạ khuẩn phát triển tốt ở môi trường có pH trung tính và hơi kiềm; ở môi trường pH thấp hoặc hơi quá kiềm xạ khuẩn không phát triển hoặc phát triển kém. Các chủng xạ khuẩn phát triển được ở nồng độ muối 3 ÷ 5% (w/v), còn ở nồng độ cao hơn có thể bị ức chế hoặc tiêu diệt [3]. c. Đặc điểm của bào tử xạ khuẩn Cũng như các vi khuẩn sinh bào tử khác, xạ khuẩn thường sinh bào tử khi gặp điều kiện bất lợi về dinh dưỡng hoặc điều kiện hóa lý của môi trường (nhiệt độ, độ ẩm, độ pH). Bào tử của xạ khuẩn có dạng hình cầu hay hình bầu dục, hình que, hình trụ hay hình quả dưa… Dưới kính hiển vi quang học, hình dạng của bào tử ổn định, nhưng khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử thì hình dạng của chúng không đồng nhất, thậm chí trong một chuỗi bào tử hình thái của các bào tử cũng có thể khác nhau. Ngược lại, kết cấu bề mặt ngoài của bào tử (trơn, thô, nhám, nhăn nheo, có mấu lồi hoặc có gai) thì lại là đặc điểm tương đối ổn định. Dựa vào hình thái, kích thước cuống sinh bào tử và của bào tử ở nhiều chi xạ khuẩn có thể phân loại được xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử thường có dạng thẳng hoặc hơi cong (RF), dạng xoắn thật hay xoắn lò xo (S) và chuỗi bào tử không sinh trưởng hoặc xoắn đơn giản hình móc câu (RA). Cuống sinh bào tử dạng xoắn có chiều dài và số vòng khác nhau. Cuống sinh bào tử dạng thẳng có thể dài hoặc ngắn hơn với các dạng lỏng cứng hoặc có thể thon lại, uốn cong hay kéo dài. Những đặc điểm này rất quan trọng khi xác định tên xạ khuẩn [3]. Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que với mép nhẵn hoặc xù xì, ở một số loài, bào tử có hình thành ở các mấu lồi với các dạng khác nhau. Việc hình thành cuống bào tử diễn ra mạnh mẽ hơn khi môi trường có chứa một số nguyên tố vi lượng [9]. Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 5
  14. Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân Cuống sinh bào tử xạ khuẩn hình thành bào tử theo 3 phương thức sau:  Phương thức sinh trưởng toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ty hình thành nên thành của bào tử. - Phương thức sinh trưởng trong thành: thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa màng nguyên sinh chất và thành khuẩn ty. Trường hợp này gặp ở xạ khuẩn thuộc chi Planomonospora. - Phương thức sinh trưởng thành bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ty không tham gia vào quá trình hình thành ra bào tử Thermoactynomyces[3]. 1.1.2. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật Vi sinh vật nội sinh bắt đầu được nghiên cứu từ giữa thế kỷ XIX, nhưng không chiếm được sự chú ý do hệ sinh thái của chúng rất đặc biệt[58]. De Bary (1866) lần đầu tiên đề xuất định nghĩa về endophyte: đó là các VSV cư trú ở các mô bên trong của thực vật, phân biệt với thực vật biểu sinh (epiphyte) sống ở trên bề mặt thực vật, khái niệm này đã gây ra nhiều tranh cãi[58]. Năm 1975, Smith và cộng sự đã đưa ra khái niệm xạ khuẩn nội sinh khi phân lập thành công xạ khuẩn Microsmonospora sp. có khả năng ức chế nấm gây bệnh Fusarium oxysporum trong mô cây cà chua không nhiễm bệnh [45].Vào năm 1991, Pentrini đưa ra khái niệm về “endophyte”và đã được chấp nhận rộng rãi: Endophyte là các vi sinh vật sống trong các tổ chức của thực vật trong một giai đoạn nhất định của cuộc đời và không có khả năng gây bệnh [37]. Sau đó Sikora đã mở rộng định nghĩa của endophyte: đó là một sinh vật xâm chiếm trong mô của một thực vật trong suốt vòng đời của chúng, mà không biểu hiện bất cứ triệu chứng bệnh rõ ràng nào cho cây chủ[43]. Theo định nghĩa được thừa nhận rộng rãi nhất của Bacon và White (2000) thì “các thể nội sinh (endophytes) là những vi sinh vật sinh trưởng ở các mô sống bên trong thực vật, mà không gây ra hiệu ứng xấu rõ ràng và trực tiếp nào cho cây”. Theo Bacon và While (2000) thì định nghĩa này hàm chứa một ý nghĩa rất quan trọng: vì bản chất không gây triệu chứng bệnh cho cây nên việc các thể nội sinh chiếm cứ mô thực vật đã khiến chúng ta nghĩ đến mối quan hệ hỗ sinh (mutualistic) giữa thể nội sinh và cây chủ của chúng[16]. Vì vậy, các VSV nội sinh được mô tả là những VSV thiết lập được mối quan hệ cộng sinh với thực vật hoặc được định nghĩa là bất cứ VSV nào không gây ra tác động có hại với thực vật, và có thể được phân lập từ bề mặt của các mô thực vật đã được khử trùng hoặc được chiết xuất từ phần bên trong của thực vật. Mối liên kết giữa nội sinh và thực vật đã được tìm thấy trong rất nhiều cơ quan của thực vật như rễ, cuống, lá, quả, hoa và hạt [35]. Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 6
  15. Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân Theo Kandpal1 và cộng sự (2012), trong số gần 300.000 loài thực vật tồn tại trên trái đất thì mỗi loại cây là cây chủ cho một hoặc nhiều loài VSV nội sinh[29].Các VSV nội sinh tồn tại rộng rãi trong nhiều cơ quan thực vật mà chưa được biết đến, ước tính lên đến một triệu loài [58]. Chúng không những không gây bệnh cho cây chủ mà còn có khả năng thúc đẩy sự phát triển của cây bằng cách sản xuất các chất kích thích tăng trưởng và bảo vệ thực vật. Tiếp tục đi sâu nghiên cứu, các VSV nội sinh được xác định có khả năng sản xuất ra nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau có giá trị to lớn trong sinh thái học, y học và bệnh lý học. Vi sinh vật nội sinh đem lại một triển vọng lớn trong việc ứng dụng để phát triển các nguồn thuốc và ngăn chặn dịch bệnh, côn trùng trong nông nghiệp và công nghiệp, có hiệu quả cao, độc tính thấp và thân thiện với môi trường. Thêm nữa, vi sinh vật nội sinh cũng là nguồn tài nguyên quý giá của vi sinh vật cũng như nguồn gen. Nhiều cây có ý nghĩa kinh tế quan trọng có chứa các thể nội sinh giúp cây tăng trưởng, chống chịu các tác động bất lợi bên ngoài như khô hạn, đồng thời cũng như giúp cây chống lại côn trùng và vi sinh vật gây bệnh [16]. Trong số các VSV nội sinh, xạ khuẩn được chú ý bởi hơn 70 % các chủng xạ khuẩn đã biết có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh có thể ức chế nhiều nhóm VSV gây bệnh[31]. Với các tác dụng nhận được từ xạ khuẩn nội sinh, một số nhà sinh học đã nghiên cứu sử dụng xạ khuẩn nội sinh như một yếu tố kiểm soát sinh học (Biocontrol) trong suốt hai thập kỷ qua [47]. Khi sử dụng trong kiểm soát sinh học, vai trò xạ khuẩn đã được chứng minh giúp tăng cường, thúc đẩy tăng trưởng của cây chủ, giảm nguy cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cường khả năng sống sót của cây chủ trong các điều kiện khác nhau ... [58].Nói chung, số chủng loại và số lượng VSV nội sinh trong thực vật vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới nhiều hơn vùng lạnh và khô, trong cây tăng trưởng nhanh và lâu năm nhiều hơn trong cây tăng trưởng chậm và ngắn ngày, trong cây khỏe mạnh nhiều hơn trong cây phát triển ở môi trường ô nhiễm[58]. Xạ khuẩn đại diện cho một phần lớn cộng đồng vi sinh vật vùng rễ, đây là yếu tố thuận lợi để chúng xâm nhiễm vào thực vật và trở thành thể nội sinh. Cộng đồng xạ khuẩn nội sinh bao gồm cả các loài Streptomyces và các loài khác không thuộc Streptomyces, đều có thể có mặt trong mô thực vật [45]. Theo một số tác giả,tương tự các loài vi sinh vật khác, sự sinh ra hormone thực vật như IAA ở xạ khuẩn nội sinh là một trong những cơ chế để kích thích sự tăng trưởng của cây chủ, tăng trọng lượng khô của lá, rễ và chiều dài rễ khiến cho cây phát triển khỏe mạnh hơn. Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội sinh với cây chủ và việc sản sinh ra các sản phẩm tự Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 7
  16. Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân nhiên có hoạt tính sinh học tạo ra cơ hội tìm ra các loại chế phẩm đặc hiệu có tiềm năng ứng dụng trong bảo vệ thực vật và kiểm soát nấm bệnh. Xạ khuẩn nội sinh có khả năng hạn chế nấm gây bệnh trên cây chủ yếu dựa vào khả năng sinh tổng hợpcác chất có hoạt tính sinh học như kháng sinh và các enzyme phá hủy thành tế bào. Xạ khuẩn nội sinh cũng được công bố là có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch thực vật (ISR) [34, 43]. 1.1.3. Mối quan hệ giữa thực vật và xạ khuẩn nội sinh Vi sinh vật nội sinh có lợi với thực vật trong hầu hết các trường hợp. Thực vật che chở và cung cấp chất dinh dưỡng cho thể nội sinh, và thể nội sinh sẽ giúp tăng trưởng thực vật. Ví dụ, xạ khuẩn nội sinh giúp tăng cường sự phát triển của rễ, hòa tan phosphate làm tăng khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của thực vật từ đất [58], cố định nitơ và bảo vệ rễ chống nhiễm nấm [47, 53]Thông qua những hoạt động đó, endophyte có thể thúc đẩy tăng trưởng cây chủ và giúp cây chủ chống chịu tốt hơn với điều kiện bất lợi của môi trường. Mối quan hệ cộng sinh khá phổ biến giữa endophytes và thực vật, nhưng mối quan hệ này có thể biến đổi từ hỗ sinh thành ký sinh, nếu một gen đơn (single gene) bị biến đổi, có thể ảnh hưởng đến cơ chế hoạt động của VSV nội sinh với cây chủ[58]. 1.1.4. Con đường xâm nhập của vi sinh vật vào cây chủ Có một số cách thức để vi sinh vật xâm nhập vào bên trong cây và trở thành thể nội sinh. Quá trình này thường bắt đầu từ sự tập trung của chúng ở vùng rễ. Khi đã sinh trưởng được ở vùng rễ thì vi sinh vật bắt đầu bám lên bề mặt rễ. Đây là bước quan trọng cho quá trình xâm nhập sau này. Một số tác giả cho rằng vi sinh vật bám được lên bề mặt rễ nhờ một số thành phần trên bề mặt tế bào như lông tơ (pilli), liposaccharide hoặc exopolysaccharide v.v. Những vị trí mà vi sinh vật lựa chọn để bám và xâm nhập thường là vùng đầu rễ, nơi có lớp thành tế bào mỏng của đỉnh sinh trưởng, hoặc vùng lông rễ, hoặc vùng gốc rễ nơi có những vết nứt nhỏ để rễ phụ trồi ra. Tại những vị trí đó vi sinh vật sinh trưởng thành các khuẩn lạc siêu nhỏ gồm vài trăm tế bào. Để có thể xâm nhập dễ dàng thì các vi sinh vật nội sinh phải có hệ enzyme phân hủy cellulose để phá lớp ngoài của thành tế bào. Các enzyme phân hủy thành tế bào của vi khuẩn cũng được cho là kích thích các cơ chế bảo vệ trong cây vì rất nhiều protein tham gia vào quá trình bảo vệ và phục hồi đều nằm ở thành tế bào, được sinh tổng hợp nhằm ngăn chặn sự lan truyền của mầm bệnh trong cây. Để trở thành thể nội sinh thì các vi sinh vật này phải có khả năng tránh được đáp ứng miễn dịch của cây, hoặc làm giảm nó một cách đáng kể, một trong những cách đó là xâm nhập vào cây từ các vết nứt nơi rễ phụ trồi ra, đây là trường hợp được giả thiết cho Azoacus và Burkholderia vietnamiensis[33]. Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 8
  17. Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân Sau khi tế bào vi sinh vật đã vượt qua được lớp biểu bì ngoài, chúng có thể nằm ngay tại chỗ, hoặc di chuyển sâu hơn và xâm chiếm khoảng giữa các tế bào (apoplast) trong vỏ cây. Vi sinh vật nội sinh khác vi khuẩn nốt sần ở cây họ đậu ở chỗ chúng không xâm nhập vào bên trong tế bào thực vật và tạo ra các tổ chức hình thái đặc biệt như trường hợp của vi khuẩn nốt sần. Tuy vậy, cũng có trường hợp vi sinh vật nội sinh cũng tạo ra các nốt sần. Chỉ có một số vi sinh vật có thể đi qua lớp bảo vệ bên trong và xâm nhập hệ mạch dẫn (xylem) của thực vật. Tại đây vi sinh vật có thể sử dụng các chất dinh dưỡng được vận chuyển trong hệ mạch như nước, ion và một số chất hữu cơ có phân tử lượng thấp như đường, axit amin và axit hữu cơ. Mặc dù nồng độ các chất dinh dưỡng trong hệ mạch là rất thấp nhưng cũng đủ để duy trì sự sinh trưởng của thể nội sinh. Vi sinh vật nội sinh có khả năng sử dụng các nguồn cac bon mà thông thường vi sinh vật vùng rễ không sử dụng được, ví dụ D-sorbitol, D-galacturonic acid và L-arabinose là nguồn các bon có sẵn trong hệ mạch dẫn của cây. Như vậy để trở thành thể nội sinh thì điều kiện tiên quyết là vi sinh vật đó phải có khả năng sử dụng một số hợp chất trao đổi chất của thực vật [33]. Thông thường thì nồng độ của chất dinh dưỡng trong hệ mao quản thực vật giảm dần theo độ cao của cây. Điều này giải thích cho thực tế là tính đa dạng và mật độ quần thể vi sinh vật nội sinh giảm dần theo khoảng cách từ rễ trở lên, và chỉ một phần nhỏ vi sinh vật đạt tới những phần trên của cây, lá và cơ quan sinh sản (hoa, quả và hạt). Một số vi sinh vật có thể xâm nhập vào cây qua các vị trí khác như khí khổng trên lá và trở thành nội sinh. Chúng cũng có thể xâm nhập vào cây từ hoa quả và hạt, nhưng trường hợp này thì thường là vi sinh vật gây bệnh [33]. 1.1.5.Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh Xạ khuẩn nội sinh cư trú trong mô thực vật bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất, lượng mưa, cường độ ánh sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ… Thêm vào đó, mật độ xạ khuẩn nội cộng sinh nhìn chung thấp và phụ thuộc vào loại mô khác nhau trên thực vật[39]. Theo các kết quả nghiên cứu đã công bố, quá trình phân lập xạ khuẩn nội sinh cần xử lý bề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề mặt. Vì vậy, phải khử trùng bề mặt mẫu và cắt mẫu thành từng mảnh bằng dụng cụ đã khử trùng trước khi phân lập. Sodium hypochlorite (NaOCl) là một trong những tác nhân oxy hóa phổ biến được sử dụng để khử trùng bề mặt, mẫu thực vật có thể được ngâm trong ethanol nồng độ 70 ÷ 90 % trong thời gian 1 ÷ 5 phút, sau đó được ngâm trong dung dịch NaOCl nồng độ 1 ÷ 5 % trong khoảng thời gian 3 ÷ 20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nước vô trùng nhằm loại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 9
  18. Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân bỏ lượng NaOCl còn dư. Ngoài ra, hydroperoxide và clorua thủy ngân cũng được sử dụng như chất khử trùng bề mặt hiệu quả [43]. Năm 1992, Sardi và cộng sự công bố sử dụng hơi của propylene oxit để khử trùng bề mặt thay vì hóa chất khử trùng dạng lỏng[41]. Hiệu quả khử trùng bề mặt được tăng cường bằng việc sử dụng các chất hoạt hóa bề mặt như Tween 20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của cơ chất khử trùng với bề mặt thực vật [43]. Phần mẫu đã khử trùng được đặt vào trên môi trường thạch thích hợp, nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25 ÷ 30oC. Trong quá trình phân lập, các nhà nghiên cứu thường gặp phải VSV phát triển mạnh trong hai tuần đầu tiên vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần mẫu thực vật. Để ngăn chặn sự sinh trưởng của vi khuẩn và nấm không mong muốn cũng như tìm kiếm loại xạ khuẩn mới, một số môi trường chọn lọc đã được sử dụng như: môi trường humic acid - vitamin, môi trường thạch casein tinh bột, cao nấm men… bổ sung thêm các hợp chất kháng sinh như nystatin hoặc cycloheximide - ampicilin, acid nalodixic và trimethoprim… Để ức chế vi khuẩn, nấm nội cộng sinh và nâng cao khả năng phát triển chọn lọc của xạ khuẩn vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn và nấm ... [43]. 1.1.6. Phân loại xạ khuẩn nội sinh Các phương pháp phân loại xạ khuẩn thường dùng hiện nay là phương pháp phân loại truyền thống (dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy), phương pháp phân loại bằng kỹ thuật phân tử (lai AND, ARN và phân tích rADN 16S) và phân loại số (dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một độ lớn các đặc điểm, chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so sánh các chủng với nhau từng đôi một. a. Phương pháp phân loại truyền thống Krainski (1914) lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu về đặc điểm sinh lý và coi đó là mấu chốt trong nguyên tắc phân loại để sơ loại 17 chủng thuộc chi Actinomyces. Waksman và Curtis (1916) đã đề cập đến những dạng trung gian trong mô tả phân loại của mình và coi đặc điểm hình thái của bào tử là đặc tính quan trọng của các cá thể. Do vậy họ đã đưa ra một số loài mới ý nghĩa. Tiếp đó Millard và Burr (1926) tìm ra 17 loài, Jensen (1930-1931) – hai loài, Dunche (1934) -13 loài. Baldacci và cộng sự đã bắt đầu nghiên cứu xạ khuẩn từ năm 1936 và cho đến năm 1953 công bố một khóa phân loại chi Streptomyces dựa trên cơ sở màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và một số đặc điểm trung gian khác nhau. Năm 1943, Waksman và Henrici đã đưa ra một số hệ thống phân loại và cho đến năm 1961 có sửa đổi. Trong hệ thống này, xạ khuẩn được xếp thành nhóm gồm 3 họ, chia thành Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 10
  19. Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân 10 chi và mô tả chi tiết hơn 250 loài thuộc chi Streptomyces. Krassilnikov là một trong những chuyên gia nổi tiếng về nghiên cứu và phát triển khóa phân loại xạ khuẩn. Từ năm 1941 đến năm 1949 ông đã phát hiện thêm 38 loài mới. Năm 1970, ông lại công bố hệ thống phân loại mới dựa trên hệ thống đã công bố năm 1949 [56].Trong đó xạ khuẩn được chia thành 6 họ, gồm 26 chi. Theo ông Actinomyces được dùng như một tên gọi chung cho những loài thuộc chi Streptomyces mà Waksman và Henrici đã phác họa năm 1943.Một số nhà nghiên cứu người Đức cho rằng chi Streptomyces là một nhóm lớn. Lần đầu tiên họ sử dụng kính hiển vi điện tử để nghiên cứu đặc điểm bào tử của chi này. Kutzner đã phát triển một số khóa phân loại Streptomyces dựa trên cơ sở hình dáng cuống sinh bào tử, cấu trúc hiển vi điện tử của bào tử, sự tạo sắc tố tan, hoạt phổ kháng khuẩn và một số đặc điểm sinh lí khác.Năm 1957, Gause và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới. Hệ thống này dựa vào màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ty cơ chất (KTCC), hình dạng bào tử và cuống sinh bào tử. Hệ thống này cũng được chỉnh lý và tái bản năm 1983. Số lượng hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày một tăng trong những năm gần đây. Đó là hình thức phân loại truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy. Hình thức này hiện nay vẫn đang được sử dụng phổ biến. b. Phương pháp phân loại sinh học phân tử Ngày nay nhờ sự phát triển cao của khoa học kĩ thuật, phương pháp phân loại phân tử đã được sử dụng vào phân loại xạ khuẩn. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay người ta vẫn dùng ba phương pháp chính: lai AND, ARN và phân tích rADN 16S. Kết quả được biểu hiện bằng số phần trăm sự thống nhất (homology). Hiện nay, đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệt nêu chúng giống nhau dưới 70% khi tiến hành lai AND. Phân tích rADN 16S để liệt kê thứ tự nucleotit đặc trưng của các cá thể và so sánh với bảng liệt kê của các cá thể khác để xác định mức độ giống nhau của chúng. Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự rADN 16S là 98,6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai AND thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự rADN 16S được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98% [30] . c. Phân loại số Phân loại số đã được Williams và cộng sự (1983) sử dụng để phân loại chi Streptomyces và các chi có quan hệ gần gũi [57]. Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một số các đặc điểm, chủ yếu là các Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 11
  20. Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so sánh các chủng với nhau từng đôi một, Sneath Ns .100 (1974) đề nghị tính hệ số giống nhau S (similarity) theo phương trình sau: %S = Ns + Nd Trong đó: Ns – tổng số các đặc điểm dương tính của 2 chủng so sánh. Nd – tổng số các đặc điểm dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia. Kết quả phân tích số được biểu diễn bằng sơ đồ nhánh mà trên đó các chủng tùy theo mức độ giống nhau được nhóm thành từng cụm (Cluster). Bằng phân loại số, người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 21 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện duy nhất. Trên cơ sở nhận được, người ta đưa ra thuật toán học để xác định những chuẩn xạ khuẩn chưa biết. Mặc dù nguyên tắc là giảm số lượng các đặc điểm, nhưng cũng còn tới 139 đặc điểm đã được sử dụng trong phân loại số. Cả ba phương pháp phân loại trên hiện vẫn còn đang được sử dụng độc lập kết hợp với nhau để định tên loài một cách chính xác trong phân loại xạ khuẩn hiện nay. Mỗi phương pháp có một ưu điểm nhất định, tuy nhiên vì lý do thực dụng, người ta chủ yếu vẫn dựa vào phương pháp phân loại truyền thống. 1.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh và tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh 1.2.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh 1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thế giới Trong vài thập kỷ qua đã có nhiều thành tựu trong tìm kiếm các loài xạ khuẩn và các hợp chất mới có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn trong mô tế bào thực vật. Đáng chú ý, hầu hết mỗi loại thực vật đều là nơi cư trú của rất nhiều vi sinh vật nội sinh tạo nên sự đa dạng sinh học. Tuy nhiên, mới chỉ có một phần nhỏ thực vậtđã được nghiên cứu và tìm kiếm các thể nội sinh, nên cơ hội để tìm ra các loài mới và sản phẩm có hoạt tính sinh học có nguồn gốc tự nhiên còn rất lớn. Do tiềm năng ứng dụng lớn của xạ khuẩn nội sinh nên đối tượng vi sinh vật này đang được quan tâm và nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới [26, 48, 49, 50, 51, 52]. Sơ lược về tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thực vật trong hơn 10 năm gần đây được thể hiện trong bảng 1.1. Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 12
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.01: Bộ Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Kinh Doanh MBA
165 tài liệu
2062 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2