Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa protein OmpL1 của chủng Leptospira spp. trong Escherichia coli

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:83

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là tách dòng và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp OmpL1 của 5 chủng vi khuẩn Leptospira, làm tiền đề cho chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis tại Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa protein OmpL1 của chủng Leptospira spp. trong Escherichia coli

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Văn Huy NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN OmpL1 CỦA CHỦNG Leptospira spp. TRONG Escherichia coli LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Văn Huy NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN OmpL1 CỦA CHỦNG Leptospira spp. TRONG Escherichia coli Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. Nghiêm Ngọc Minh Hà Nội - 2021
i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Hà nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả Nguyễn Văn Huy
ii Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS.Nghiêm Ngọc Minh, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị, cũng như kinh phí để giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể Phòng Hệ gen học vi sinh, Viện Viện Nghiên cứu Hệ gen và đặc biệt là PGS.TS. Võ Thị Bích Thủy đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình thực nghiệm cũng như chia sẽ những kinh nghiệm chuyên môn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc khoa Sinh học, các thầy cô giáo của Học viện Khoa học và Công nghệ cùng với Lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi học tập cũng như hoàn thành đề tài nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình, người thân và bạn bè đã giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Nguyễn Văn Huy
iii Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt L. interrogans Leptoxspira interrogans L. interrogans Leptospira interrogans L. Bataviae Leptospira interrogans serovar Bataviae L. Canicola Leptospira interrogans serovar Canicola L. Grippotyphosa Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa Leptospira interrogans serovar L. Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae L. Pomona Leptospira interrogans serovar Pomona E.coli Escherichia coli LB Môi trường Luria Bertani Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại PCR gen) DNA Deoxyribonucleic acid Amp Ampicillin BSA Bovine Serum Albumins (Huyết thanh bò) TBST Tris-buffered saline với Tween 20 CBB Comassie Brilliant Blue SDS Sodium dodecyl sulfate IPTG Cơ chất Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside APS Ammonium persulphate EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid OD Optical density PBS Phosphate buffer saline TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine bp Base pair kb Kilobase kDa KiloDalton
iv Danh mục các bảng Bảng 1.1: Một số hệ biểu hiện phổ biến ......................................................... 19 Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR............................................................. 25 Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ................................................. 25 Bảng 2.3: Trình tự mồi khuếch đại toàn bộ gen OmpL1 ................................ 25 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng gắn gen vào vector nhân dòng .................... 28 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng cắt vector .................................................... 30 Bảng 2.6: Thành phẩn phản ứng nối gen vào vetor ........................................ 31 Bảng 2.7: Thành phần gel Acrylamide ........................................................... 32 Bảng 2.8: Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ........................... 33 Bảng 3.1: Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen OmpL1 .................................... 45 Bảng 3.2:Kết quả đo độ hấp phụ BSA ở bước sóng 595nm ........................... 57
v Danh mục các hình vẽ, đồ thị Hình 1.1: Xoắn khuẩn Leptospira interrogans .................................................. 3 Hình 1.2: Con đường lây truyền của bệnh Leptospirosis ................................. 5 Hình 1.3: Sơ đồ vector pET32a....................................................................... 22 Hình 3.1: DNA tổng số tách chiết được của 5 chủng Leptospira ................... 37 Hình 3.2: Kết quả gióng hàng trình tự chuẩn của 5 chủng Leptospira interrogans ....................................................................................................... 41 Hình 3.3: Kết quả gióng hàng trình tự chuẩn của 5 chủng Leptospira interrogans (tiếp) ............................................................................................. 42 Hình 3.4: Kết quả dự đoán vùng quyết định kháng nguyên trên gen OmpL1 của năm chủng Leptospira .............................................................................. 43 Hình 3.5: Kết quả gióng hàng trình tự amino acid của năm chủng Leptospira ......................................................................................................................... 44 Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn gen OmpL1. ................................. 45 Hình 3.7: Điện di đồ sản phẩm cắt vector pJET1.2/OmpL1........................... 46 Hình 3.8: Điện di đồ sản phẩm plasmid .......................................................... 47 Hình 3.9: Điện di đồ sản phẩm cắt mở vòng vector pET32a .......................... 48 Hình 3.10: Khuẩn lạc E.coli đã được biến nạp vector pET32a/OmpL1 trên môi trường LB. ................................................................................................ 49 Hình 3.11: Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi T7 ................................... 49 Hình 3.12: Điện di đồ sản phẩm biểu hiện protein OmpL1 ở E. coli BL21 ... 50 Hình 3.13: Điện di đò sản phẩm biểu hiện của protein OmpL1 ở E. coli BL21 trong các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng khác nhau. ............................ 52 Hình 3.14: Điện di đồ sản phẩm biểu hiện của protein OmpL1 ở E. coli BL21 trong các điều kiện nồng độ cảm ứng IPTG khác nhau .................................. 54
vi Hình 3.15: Điện di đồ sản phẩm biểu hiện của protein OmpL1 ở E. coli BL21 trong các điều kiện thời gian cảm ứng IPTG khác nhau ................................. 55 Hình 3.16: Điện di đồ sản phẩm sau tinh sạch protein OmpL1 ...................... 56 Hình 3.17: Đồ thị biểu diễn đường hồi quy tuyến tính ................................... 57 Hình 3.18: Chuột nhắt trắng sử dụng trong thử nghiệm ................................. 59 Hình 3.19: Phản ứng Western Blot giữa kháng nguyên tái tổ hợp OmpL1 với kháng thể thu được từ huyết thanh chuột sử dụng kháng thể thứ cấp HRP Goat Anti-Mouse IgG. .................................................................................... 60
vii MỤC LỤC Lời cam đoan ...................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt .............................................................. iii Danh mục các hình vẽ, đồ thị ............................................................................ v MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................. 3 1.1. GIỚI THIỆU XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA VÀ BỆNH LEPTPSPIROSIS .......................................................................................... 3 1.1.1. Xoắn khuẩn Leptospira................................................................. 3 1.1.2. Thực trạng dịch tễ bệnh Leptospirosis.......................................... 4 1.1.2.1. Trên thế giới............................................................................ 4 1.1.2.2. Tại Việt Nam .......................................................................... 8 1.2. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PTOTEIN TÁI TỔ HỢP PHÒNG CHỐNG BỆNH LEPTOSPIROSIS .............................................................. 9 1.2.1. Đặc điểm bộ gen của xoắn khuẩn Leptospira............................... 9 1.2.2. Một số nghiên cứu về protein OmpL1 tái tổ hợp ....................... 11 1.2.3. Cơ chế tạo kháng thể trong cơ thể của xoắn khuẩn Leptospira .. 14 1.3. TỔNG QUAN VỀ HỆ THỐNG BIỂU HIỆN GEN ........................... 18 1.3.1. Hệ biểu hiện Escherichia coli ..................................................... 18 1.3.1.1. Các hệ biểu hiện cơ bản ........................................................ 18 1.3.1.1. Hệ biểu hiện Escherichia coli. .............................................. 19 1.3.2. Chủng biểu hiện E. coli BL21 (DE3) ......................................... 20 1.3.3. Vector biểu hiện pET32a ............................................................ 21
viii CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.............. 23 2.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ ............................................................... 23 2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất.............................................................. 23 2.1.1.1. Nguyên liệu ........................................................................... 23 2.1.1.2. Hóa chất ................................................................................ 23 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu .................................................. 24 2.1.2.1. Thiết bị .................................................................................. 24 2.1.2.2. Dụng cụ thí nghiệm .............................................................. 24 2.1.2.3. Phần mềm phân tích.............................................................. 24 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 24 2.2.1. Thiết kế mồi đặc hiệu và PCR nhân gen OmpL1 ....................... 24 2.2.2. PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (Colony – PCR)............................... 26 2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ............................... 26 2.2.4. Xác định trình tự acid nucleic ..................................................... 27 2.2.5. Gắn đoạn gen vào vector nhân dòng........................................... 27 2.2.6. Biến nạp vào tế bào E. coli khả biến .......................................... 28 2.2.7. Tách chiết và định lượng DNA plasmid ..................................... 29 2.2.8. Xử lý enzyme cắt giới hạn .......................................................... 30 2.2.9. Gắn gen vào vector biểu hiện pET32a........................................ 31 2.2.10. Biểu hiện protein OmpL1 trong E.coli BL21 ............................. 31 2.2.11. Điện di protein trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) . 32 2.2.12. Phương pháp sắc ký ái lực .......................................................... 33 2.2.13. Phương pháp định lượng protein bằng Bradford ........................ 33
ix 2.2.14. Phương pháp gây miễn dịch trên chuột ...................................... 34 2.2.15. Phương pháp Western Blot ......................................................... 35 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................... 36 3.1. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN OmpL1.................................................. 36 3.1.1. Tách DNA tổng số của 5 chủng Leptospira interrogans ........... 36 3.1.2. Thu thập, phân tích in-silico và thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn OmpL1 của năm chủng Leptospira interrogans............................. 37 3.1.3. Nhân dòng đoạn gen OmpL1 vào vector pJET1.2 ...................... 45 3.2. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP OmpL1 .................................. 47 3.2.1. Chuyển gen OmpL1 vào vector biểu hiện pET32a ..................... 47 3.2.2. Biểu hiện protein OmpL1 tái tổ hợp ........................................... 50 3.2.2.1. Nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng ................................................... 51 3.2.2.2. Nồng độ chất cảm ứng IPTG ................................................ 53 3.2.2.3. Thời gian nuôi cấy cảm ứng ................................................. 54 3.2.3. Tinh sạch protein OmpL1 ........................................................... 55 3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP OmpL1 ......................................................................................... 58 3.3.1. Thí nghiệm sinh đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch ................. 58 3.3.2. Kiểm tra khả năng sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp OmpL1 bằng Western blot ................................................................................... 59 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................... 61 4.1. Kết luận .............................................................................................. 61 4.2. Kiến nghị ............................................................................................ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 62
1 MỞ ĐẦU Leptospirosis (bệnh xoắn khuẩn vàng da) là bệnh truyền nhiễm cấp tính, gây ra bởi xoắn khuẩn thuộc chi Leptospira. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Leptospirosis là bệnh có khả năng lây truyền từ động vật sang người phổ biến nhất trên thế giới [1]. Hiện nay, các nhà khoa học đã định danh được 22 loài xoắn khuẩn, chia thành hơn 300 nhóm huyết thanh [2]. Ở Việt Nam đã phát hiện được 15 nhóm huyết thanh thường hay gây bệnh là: Leptospira interogans serovar Australis (L. australis), Leptospira interogans serovar Autumnalis (L. autumnalis), Leptospira interogans serovar bataviae (L. bataviae), Leptospira interogans serovar Canicola (L. canicola), Leptospira interogans serovar grippotyphosa (L. grippotyphosa), Leptospira interogans serovar icterohaemorrhagiae (L. icterohaemorrhagiae), Leptospira interogans serovar pomona (L. pomona), Leptospira interogans serovar saxkoebing (L. saxkoebing), Leptospira interogans serovar bratislava (L. bratislava), Leptospira interogans serovar javancia (L. javancia), Leptospira interogans serovar panama (L. panama), Leptospira interogans serovar pyrogens (L. pyrogens), Leptospira interogans serovar hardjo (L. hardjo), Leptospira interogans serovar tarassovi (L. tarassovi), và Leptospira interogans serovar patoc (L. patoc)[3]. Đặc điểm lâm sàng của Leptospirosis là hội chứng nhiễm khuẩn nhiễm độc toàn thân và tổn thương gan, thận [4]. Bệnh cũng có thể làm sảy thai và thai chết lưu ở động vật gây ra thiệt hại kinh tế rất lớn cho ngành chăn nuôi [5]. Bệnh lây sang người thông qua da, niêm mạc, hoặc các màng nhầy tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với nước tiểu hoặc mẫu mô động vật mắc bệnh. Người nhiễm bệnh có thể có nhiều biểu hiện lâm sàng khác nhau, trong đó, biểu hiện nặng nhất là hội chứng Weil có thể gây tử vong [6]. Ở thời điểm hiện tại, Leptospirosis không còn là mối đe dọa nghiêm trọng cho sức khỏe con người mà chủ yếu gây thiệt hại cho ngày chăn nuôi đối với các nước nhiệt đới và các nước có mức độ ô nhiễm môi trường cao [7]. Do vậy, việc chế tạo một vắc xin đặc hiệu phòng bệnh xoắn khuẩn là rất cần thiết cho việc ổn định phát triển kinh tế nông nghiệp.
2 Hiện nay, tại Việt Nam mới chỉ có một đơn vị trong nước sản xuất được vắc xin nhược độc phòng bệnh Leptospirosis cho động vật. Loại vắc xin này có nhiều điểm yếu cố hữu như khả năng bảo hộ hẹp, có nguy cơ gây bệnh cho đối tượng tiêm và chất lượng chủng giống khó đảm bảo qua thời gian dài. Việc chế tạo vắc xin tái tổ hợp hiện đang là xu hướng mới của thế giới do có thể loại bỏ được các điểm yếu của các loại vắc xin truyền thống. Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa protein OmpL1 của chủng Leptospira spp. trong Escherichia coli ” nhằm góp phần nghiên cứu, sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng chống bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra trên động vật tại Việt Nam. Mục đích Tách dòng và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp OmpL1 của 5 chủng vi khuẩn Leptospira, làm tiền đề cho chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis tại Việt Nam. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Năm chủng Leptospira gây bệnh và hiện đang được sử dụng chế vắc xin vô hoạt và nhược độc tại Việt Nam. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu Vắc xin chống lại bệnh Leptospirosis chế tạo từ protein tái tổ hợp OmpL1là một sản phẩm đã được chứng minh có tiềm năng cao qua nhiều nghiên cứu trước đây. Sản phẩm hứa hẹn thay thế cho vắc xin bất hoạt đang được sử dụng tại Việt Nam nhờ các ưu điểm như khả năng bảo hộ rộng, ít nguy cơ gây hại cho con vật và chất lượng ổn định. Đề tài này nghiên cứu chế tạo protein tái tổ hợp OmpL1 làm nguyên liệu cho phát triển sản suất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis cho động vật tại Việt Nam.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA VÀ BỆNH LEPTPSPIROSIS 1.1.1. Xoắn khuẩn Leptospira Chi Leptospira gồm hơn 20 loài được xác định dựa trên các nghiên cứu lai tạo DNA [8, 9]. Trong đó, chúng được chia thành hai nhóm chính: nhóm không gây bệnh và nhóm gây bệnh (phổ biến nhất là Leptospira interrogans). Chúng giống nhau về hình thái và một số đặc tính sinh học nhưng khác nhau về cấu trúc kháng nguyên và khả năng gây bệnh trên động vật [10]. Hình 1.1: Xoắn khuẩn Leptospira interrogans (Nguồn: Depositphotos) Leptospira interrogans thuộc giới Monera, ngành Spirochaetes, họ Leptospiraceae, chi Leptospira. Các loài vi khuẩn này có kích thước nhỏ, dạng mảnh, đường kính 0.1-0.5µm, dài 6-20µm [11]. Xoắn khuẩn có dạng các vòng xoắn sát nhau (15-20 vòng) khi được quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 10000 lần, hai đầu vi khuẩn uốn cong như móc câu, không có lông, di động mạnh, nhanh theo kiểu xoáy và bật thẳng như lò xo. Xoắn khuẩn có
4 thể được phát hiện bằng phương pháp nhuộm thấm bạc Morosop, chúng bắt màu nâu đen trên nền vàng hoặc đỏ tím khi dung phương pháp nhuộm Giemsa [4]. Leptospira là vi khuẩn hiếu khí, phát triển ở 28oC trong môi trường có pH từ 7,2 đến 7,6. Môi trường nuôi cấy là thạch máu hoặc thạch thường có bổ sung 5-10% huyết thanh thỏ hoặc các môi trường có huyết thanh bò (bovine serum albumin – BSA). Leptospira tồn tại rất lâu trong bùn lầy, nước đọng và trong gan chuột mà vẫn giữ được độc tính, tồn tại được ở -30oC. Chúng đề kháng kém với nhiệt độ, có thể bị tiêu diệt ở 56oC trong 10 phút, 5 phút ở 60oC, bị tiêu diệt nhanh chóng ở 100oC và các chất sát trùng thông thường như phenol, javen,…[4]. Giống như hầu hết các vi khuẩn, Leptospira cần sắt để phát triển [12]. L. interrogans có khả năng thu nhận sắt ở các dạng khác nhau [13]. L. interrogans cũng có thể lấy sắt từ heme, chất liên kết với hầu hết sắt trong cơ thể con người. Protein liên kết với hemin HbpA, có thể tham gia vào quá trình hấp thu hemin, đã được phát hiện trên bề mặt của L. interrogans [14]. Mặc dù các loài gây bệnh khác thiếu HbpA, nhưng một protein liên kết hemin khác, LipL41, có thể giải thích cho khả năng sử dụng hemin như một nguồn sắt của chúng [14]. Leptospira phân bố ở hầu khắp các khu vực trên thế giới ngoại trừ ở vùng cực. Chúng sống sót tốt nhất trong điều kiện ấm áp, ẩm ướt và phổ biến nhất ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. 1.1.2. Thực trạng dịch tễ bệnh Leptospirosis 1.1.2.1. Trên thế giới Bệnh xoắn khuẩn (Leptospirosis), do vi khuẩn Leptospira gây ra, là bệnh có khả năng lây truyền từ động vật sang người phổ biến nhất trên thế giới [1]. Nó gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi bởi khả năng tác động đến động vật đang mang thai [5]. Bệnh xoắn khuẩn có mặt ở cả vùng khí hậu ôn đới và nhiệt đới, xảy ra nhiều hơn vào mùa xuân và mùa thu.
5 Bệnh xoắn khuẩn đã được ghi nhận ở khắp nơi trên thế giới, tập trung ở châu Phi, Nam Mỹ, châu Á và gây ra nhiều thiệt hại cho sức khỏe con người cũng như ngành chăn nuôi. Trong số các tác nhân trung gian truyền bệnh, các loài gặm nhấm như chuột được cho là nguồn lây truyền nguy hiểm nhất do sự phổ biến của chúng [1]. Bên cạnh đó, các loài động vật có vú khác cũng có khả năng truyền bệnh cao: chó, bò, thỏ, hươu,… điều này dẫn đến nguy cơ nhiễm bệnh cao hơn ở các khu vực kém phát triển do tiếp xúc nhiều với các loài động vật. Hình 1.2: Con đường lây truyền của bệnh Leptospirosis (Nguồn: Vernon Ansdell, 2012, Leptospirosis) Trước đây, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã thống kê mỗi năm có khoảng 7 -10 triệu người nhiễm xoắn khuẩn vàng da với tỉ lệ ước tính từ 0.1- 1/100000 ở vùng khí hậu ôn đới và 10-100/100000 ở vùng khí hậu nhiệt đới. Ở các vùng có nguy cơ bùng phát dịch cao như Đông Á, Nam Á, Đông Nam Á tỉ lệ này sẽ tăng lên trên 100/100000. Ở những nước đang phát triển, người mắc bệnh chủ yếu là nông dân và người nghèo [15]. Nhiều trận dịch Leptospirosis đã được ghi nhận và đặc biệt thường đi kèm các thảm họa thiên nhiên như tại Orrisa năm 1999, lũ lụt ở Jakarta năm 2002, Mumbai năm 2005, Srilanka năm 2008. Ngoài ra, một số nơi đã ghi nhận tình trạng bùng phát dịch bệnh theo mùa như ở Thái Lan và một số vùng khác của Ấn Độ . Ngoài ra, năm 1995, một đợt dịch bệnh lớn đã xảy ra ở Nicaragua, một nước thuộc
6 vùng Trung Mĩ, do nước lũ mang mầm bệnh Leptospirosis có trong nước tiểu của chó. Sau mỗi đợt dịch bùng phát, bệnh Leptospirosis gây thiệt hại lớn về kinh tế và có diễn biến ảnh hưởng trực tiếp tính mạng của con người. Hiện nay, số ca nhiễm đã giảm đi rất nhiều nhưng con số tử vong vẫn lên tới 58.900 ca mỗi năm [16]. Chẩn đoán Leptospirosis được xác nhận thông qua các xét nghiệm miễn dịch như ELISA hoặc sinh học phân tử như PCR. Nhưng biện pháp chính xác nhất là xét nghiệm huyết thanh học MAT (Microscopic Agglutination Test) [17]. Bệnh Leptospirosis lây truyền qua đường da, niêm mạc hoặc do tiếp xúc trực tiếp, gián tiếp với màng nhầy, nước tiểu, mẫu mô động vật đã nhiễm khuẩn. Như vậy, các đối tượng có thể nhiễm bệnh có thể là con người, động vật hoang dã, chuột, chó, gia súc, trong đó chuột là vật chủ lan truyền bệnh chính. Thời gian ủ bệnh của Leptospirosis kéo dài từ 2 đến 20 ngày, sau đó là hai giai đoạn chính là nhiễm trùng và miễn dịch. Leptospirosis được đặc trưng bởi xuất huyết, vàng da, đau cơ, suy thận và viêm màng não vô trùng [18]. Khi đã nhiễm khuẩn, thể bệnh có các biểu hiện lâm sàng như nhiễm khuẩn thể ẩn, hội chứng nhiễm độc toàn thân, tổn thương gan, thận và hội chứng Weil ở người. Xuất huyết khuếch tán phổi (PDH), một loại leprospirosis lâm sàng nghiêm trọng, dẫn đến tử vong trong một phần tư bệnh nhân bị ảnh hưởng [19]. Một đặc điểm phổ quát của bệnh Leptospirosis là khả năng ký sinh trong ống thận các động vật hoang dã và vật nuôi. Nhiễm trùng Leptosira spp. thích nghi với vật chủ có thể dẫn đến phá hủy hệ thống tiết niệu. Ở động vật, bệnh Leptospirosis gây tình trạng thai chết lưu, giảm khả năng sinh sản, giảm năng suất và gây tử vong qua đó thiệt hại lớn về kinh tế. Ở người, có từ 5 đến 15% các trường hợp nhiễm Leptospirosis xuất hiện biến chứng đa cơ quan nghiêm trọng với tỉ lệ tử vong từ 5 đến 40% . Ngoài nguồn lây nhiễm chính cho con người là từ nước tiểu động vật mắc bệnh, bùn đất và nước bị ô nhiễm ở sông, hồ, đồng ruộng, ao cũng là nguyên nhân thứ phát lan truyền bệnh. Vì vậy, đối chiếu với các số liệu thống kê dịch tễ cho thấy, những người thường làm việc trong một số nhóm ngành nghề cụ thể như nông dân, công nhân vệ sinh, bác sỹ thú y hoặc người thường xuyên tiếp trực tiếp với động vật sẽ có nguy cơ
7 cao nhiễm bệnh. Do tính phổ biến và cấp thiết của bệnh, Leptospirosis đã được Tổ chức Sức khỏe động vật Thế giới (World Organization for Animal Health-OIE) xếp vào nhóm thứ 2 của Bệnh nguy hiểm và được bổ sung vào nhóm bệnh nghề nghiệp ở Việt Nam. Ở các đô thị, L. interrogans thường cư trú ở chuột nâu (Rattus norvegicus) và tồn tại một thời gian dài trong ống thận của đối tượng nhiễm bệnh. Ở các đô thị, L. interrogans thường cư trú ở chuột nâu và tồn tại một thời gian dài trong ống thận của đối tượng nhiễm bệnh. Ngoài ra, L. interrogans có thể sống trong môi trường nước ngọt, đất ẩm, bùn, thảm thực vật đến vài tháng. Khi có mưa, lũ lụt lớn sẽ tạo điều kiện bùng phát thành dịch. Bên cạnh xoắn khuẩn L. interrogans, có hơn 230 kiểu huyết thanh (serovar) thuộc chi Leptospira được chia làm 11 kiểu gen loài khác nhau gây bệnh Leptospirosis. Việc chẩn đoán bệnh chủ yếu dựa trên các xét nghiệm huyết thanh học. Mặc dù các liệu pháp kháng sinh vẫn được sử dụng, tuy nhiên bệnh Leptospriosis vẫn là mối đe dọa nguy hiểm cho các quốc gia thuộc vùng ôn đới và nhiệt đới đang phát triển, nơi mà các thành thị và nông thôn có điều kiện vệ sinh không đạt chuẩn, nước thải xử lý kém. Các biện pháp phòng ngừa bao gồm tránh có khả năng bị ô nhiễm. Nước ngọt, đất ẩm, hoặc bùn bất cứ khi nào có thể, mặc quần áo bảo hộ và che thắt và mài mòn với băng không thấm nước. Nên tránh chìm, bởi vì sinh vật có thể đi qua màng nhầy của mắt, mũi, miệng. Nước uống có khả năng bị ô nhiễm luộc hoặc xử lý bằng iốt hoặc clo. Lọc đơn giản có thể không cung cấp bảo vệ đầy đủ. Chemoprophylaxis có thể được chỉ định trong ngắn hạn, rủi ro cao tình huống. Doxycycline, 200 mg mỗi tuần một lần, bắt đầu trước tiếp xúc đầu tiên và kết thúc sau khi tiếp xúc cuối cùng có thể, dường như có hiệu quả Khách du lịch đến sốt rét-khu vực đặc hữu cũng có nguy cơ bị Leptospirosis có thể được bảo vệ chống lại cả hai Nhiễm trùng bằng cách dùng doxycycline, 100 mg mỗi ngày, một trong những chế độ hóa học được khuyến nghị chống lại sốt rét chloroquineresistant (CRPF).
8 1.1.2.2. Tại Việt Nam Leptospirosis được phát hiện trên người lần đầu vào năm 1931 bởi Ragiot và cộng sự. Năm 1964 đã ghi nhận một trận bùng phát của bệnh tại Lai Châu gây thiệt hại cho cả người và gia súc. Hiện nay, Việt Nam vẫn nằm trong vùng dịch tễ cao của bệnh xoắn khuẩn. Các số liệu thống kê cho thấy, tổng số ca mắc xoắn khuẩn được ghi nhận tại Việt Nam trong gia đoạn 2002 – 2011 là 369 ca và không có trường hợp tử vong. Người mắc bệnh thường làm các công việc: công nhân vệ sinh môi trường nước, công nhân chăn nuôi, cán bộ địa chất, lâm nghiệp. Mặc dù bệnh luôn tiềm ẩn nguy cơ lây nhiễm cao cho người và động vật nhưng lâu nay ít được chú ý cả về mặt pháp luật cũng như ý thức của người dân, người chăn nuôi. Việc mua bán gia súc bừa bãi, không được kiểm soát chặt chẽ về mặt thú y làm cho nguy cơ nhiễm bệnh trên gia súc ngày càng tăng, đồng thời cũng tăng nguy cơ lây nhiễm sang người [20]. Một nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm bệnh ở lợn tại 4 tỉnh Phú Thọ, Bắc Giang, Hòa Bình, Lào Cai cho thấy con số này là 7,78%. Trong nghiên cứu khác, tại thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ nhiễm bệnh ở vật nuôi tương đối cao. Cụ thể, Tỷ lện nhiễm ở bò lên tới 23,85%, ở chó là 20,59% và trên lợn là 17,46%. Trong đó, các nhóm huyết thanh phổ biến được ghi nhận tại Việt Nam gồm: L. icterohaemorrhagiae, L. bataviae, L. canicola, L. pomona, L. grippotyphosa,… [3]. Điều đó cho thấy cần phải có sự quan tâm đúng mức trong việc kiểm soát, phòng ngừa căn bệnh này. Theo số liệu từ báo Lao động năm 2003 thống kê, kết quả xét nghiệm trên 103 mẫu chuột bắt tại 15 điểm ở Hà Nội trong tháng 5/2003 cho thấy: 62% nhiễm xoắn khuẩn Leptospira (trong đó chuột cống chiếm 64%, còn lại là chuột nhà). Kết quả xét nghiệm huyết thanh chuột tại ga Giáp Bát, nhà máy bia Hà Nội và nhiều chợ trên địa bàn cho thấy, tỷ lệ nhiễm Leptospira đều ở mức 50 - 100%. Đặc biệt, 100% mẫu ở ga Giáp Bát, chợ Cầu Giấy, 130 Thụy Khuê đều dương tính.
9 1.2. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PTOTEIN TÁI TỔ HỢP PHÒNG CHỐNG BỆNH LEPTOSPIROSIS 1.2.1. Đặc điểm bộ gen của xoắn khuẩn Leptospira Leptospira interrogans là một loại vi khuẩn Gram âm. lớp màng ngoài của chúng có các đặc điểm quan trọng có thể liên quan đến sự tồn tại và tính độc của vi khuẩn. Lớp màng của xoắn khuẩn Leptospira interrogans gồm có lớp lipopolysaccaride (LPS), các lipoprotein LipL21, Loa22, LigA và các protein xuyên màng như FecA, OmpL1. Bộ gen của L. interrogans giữa các nhóm huyết thanh khác nhau có sự khác biệt rất lớn nằm trong khoảng từ 3,9- 4,7Mb. Sự thay đổi về chiều dài bộ gen này khiến vi khuẩn có khả năng sống trong các môi trường khác nhau và thích nghi với nhiều loại vật chủ. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, xác định gen mã hóa yếu tố kháng nguyên đặc trưng chính là chìa khóa cho nghiên cứu vắc xin tái tổ hợp. Cùng với đó, các protein tiếp xúc bề mặt thường có tiềm năng cao chứa các vị trí quyết định kháng nguyên, phù hợp để làm nguyên liệu chế tạo vắc xin. Năm 2003, trên báo Nature, trình tự bộ gen đầy đủ của chủng gây bệnh xoắn khuẩn L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae đã được công bố. Kích thước bộ gen gần 4,7 Mb bao gồm một nhiễm sắc thể vòng lớn (CI) có kích thước gần 4,33 Mb và một nhiễm sắc thể vòng nhỏ (CII) có kích thước gần 359 kb. Cả hệ gen chứa tổng cộng 4768 gen dự đoán. Bộ gen của Leptospira gây bệnh bao gồm hai nhiễm sắc thể. Kích thước bộ gen của L. interrogans serovars Copenhageni và Lai là khoảng 4,6 Mb. Tuy nhiên, bộ gen của L. borgpeterenii serovar Hardjo chỉ có kích thước 3,9 Mb với số lượng lớn pseudogens, đoạn gen và trình tự chèn liên quan đến bộ gen của L. interrogans. L. interrogans và L. borgpeterenii chia sẻ 2708 gen trong đó 656 là các gen đặc hiệu gây bệnh. Hàm lượng guanine và cytosine (G+C) nằm trong khoảng từ 35% đến 41%. L. borgpeterenii serovar Hardjo thường lây truyền qua tiếp xúc trực tiếp với các mô bị nhiễm bệnh, trong khi đó, L. interrogans thường được lây từ nước hoặc đất bị ô nhiễm bởi nước tiểu của động vật mang mầm bệnh Leptospira trong thận của chúng. Số lượng gen khiếm khuyết cao và trình tự chèn trong L. borgpeterenii Hardjo cùng với khả