Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa enzyme columbamine O- methyltransferase ở cây Bình vôi (stephania spp.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:61

Thêm vào BST

Báo xấu

27
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn nghiên cứu lý thuyết về đặc điểm trình tự gen và protein CoOMT; tạo dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang gen nhân tạo CoOMT; thiết kế vector chuyển gen pBI121-1113 và tạo chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp mang gen CoOMT. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa enzyme columbamine O- methyltransferase ở cây Bình vôi (stephania spp.)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN 34 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ---------------------------------- Tangmany SYSOMEPHONE THIẾT KẾ CẤU TRÚC VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O- METHYLTRANSFERASE Ở CÂY BÌNH VÔI (Stephania spp.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN, NĂM 2020 1
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ---------------------------------- Tangmany SYSOMEPHONE THIẾT KẾ CẤU TRÚC VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O- METHYLTRANSFERASE Ở CÂY BÌNH VÔI (Stephania spp.) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. Phạm Thị Thanh Nhàn THÁI NGUYÊN, NĂM 2020 2
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn: “Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa enzyme columbamine O-methyltransferase ở cây Bình vôi (Stephania spp.)” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Mọi kết quả thu được là trung thực, không sao chép từ kết quả nghiên cứu khác. Tất cả những tham khảo và kế thừa đều được trích dẫn đầy đủ. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020 Tác giả luận văn Tangmany SYSOMEPHONE i
LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn chính phủ hai nước Lào và Việt Nam đã dành cho tôi học bổng học tập, để tôi có thể bước chân vào học tập và nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thị Thanh Nhàn, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗ trợ của Đề tài cấp Bộ mã số B2019-TNA-09. Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, bộ phận Sau đại học của Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã trang bị cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý giá về các môn học liên quan đến chuyên ngành của tôi và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học. Tôi xin cảm ơn ThS. Trần Thị Hồng, cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ gen và Công nghệ tế bào của Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm – Đại học Thái Nguyên, đã giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện thí nghiệm. Tôi xin cảm ơn những ý kiến nhận xét của các thầy cô trong Hội đồng đánh giá luận văn ngày 16 tháng 11 năm 2020. Tôi xin cảm ơn toàn thể đồng nghiệp, gia đình, bạn bè đã động viên, giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và sinh sống tại Thái Nguyên, Việt Nam. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020 Tác giả luận văn Tangmany SYSOMEPHONE ii
MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................ ii MỤC LỤC................................................................................................... iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT......................................................................... v DANH MỤC CÁC HÌNH........................................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................... vii MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................... 3 1.1. Cây Bình vôi ....................................................................................... 3 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học cơ bản của cây Bình vôi 3 1.1.2. Giá trị của cây Bình vôi ………………………………………….... 7 1.1.3. Hiện trạng khai thác và bảo tồn nguồn gen cây bình vôi …………. 12 1.2. Gen CoOMT ở cây Bình vôi và bộ Mao lương……………………… 13 1.3. Vector biểu hiện gen và ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện hàm lượng dược chất có hoạt tính ở cây thuốc ……………….....………. 15 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 22 2.1. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................. 22 2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu............................................ 23 2.2.1. Hóa chất nghiên cứu.......................................................................... 23 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu........................................................................... 24 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu......................................................................... 24 2.3. Phương pháp nghiên cứu ……............................................................. 24 2.3.1. Nhóm phương pháp tạo dòng gen..................................................... 24 2.3.1.1. Thiết kế mồi colony- PCR.............................................................. 24 iii
2.3.1.2. Tạo vector pUC19_1113bp tái tổ hợp............................................. 25 2.3.1.3. Tạo dòng vi khuẩn tái tổ hợp mang vector pUC19_1113bp........... 25 2.3.1.4. Tách chiết và tinh sạch plasmid...................................................... 26 2.3.2. Nhóm phương pháp thiết kế vector biểu hiện mang gen đích ........ 27 2.3.2.1. Xử lý enzyme cắt giới hạn............................................................. 27 2.3.2.2. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR ............................................ 28 2.3.2.3. Gắn gen CoOMT 1113 bp vào vector pBI121................................. 28 2.3.2.4. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt............................................................................................................ 29 2.3.2.5. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)................. 29 2.3.2.6. Tách chiết plasmid từ tế bào E.coli............................................... 30 2.3.2.7. Phương pháp kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn............................................................................................................... 31 2.3.2.8. Phương pháp biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens bằng xung điện............................................................................................................. 31 2.3.2.9. Chọn dòng A. tumefaciens tái tổ hợp............................................... 32 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................. 33 3.1. Nghiên cứu lý thuyết về đặc điểm trình tự gen và protein CoOMT .... 33 3.2. Kết quả tạo dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang gen nhân tạo CoOMT ...................................................................................................... 35 3.3. Kết quả thiết kế vector pBI121-1113 và tạo chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp mang gen CoOMT.................................................. 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 40 CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ ......................................... 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 42 iv
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic cDNA Complementary ADN bổ sung Deoxyribonucleic Acid CoOMT Columbamine O- Methyltranferase Cs/cs Cộng sự EB Extration buffer EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EST expressed sequence tag Fw Primer forward Mồi xuôi LB Lysogeny Broth Môi trường nuôi cấy vi khuẩn OMT O-Methyltranferase PCR Polymerase Chain Reaction Phán ứng chuỗi Polymerase Rv Primer reverse Mồi ngược SDS Sodium doecyl sulfate SMT S-adenosyl-L- methionine:scoulerine 9-O- methyltransferase SOC Soil organic carbon môi trường giàu dinh dưỡng (dùng để tạo dòng vi khuẩn) v
DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình ảnh về cây Bình vôi………................................................. 6 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của palmatin và L-tetrahydropalmatin (rotundin)... 11 Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp tetrahydropalmatine và palmatine ..... 14 Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121……………………… 16 Hình 1.5. Sự tương tác của Agrobacterium và cơ chế chuyển T-DNA…... 18 Hình 1.6. Cấu trúc Ri-plasmid của A. rhizogenes…………………………… 19 Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc vector pUC19……………………………........... 22 Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc vector pBI121…………… …………………….. 23 Hình 3.1. So sánh trình tự amino acid suy diễn của các enzyme OMT trong con đường tổng hợp palmatine .................................................................... 34 Hình 3.2. Mô hình cấu trúc không gian 3D của protein CoOMT....……… 34 Hình 3.3. Cấu trúc thứ cấp của protein CoOMT.......................................... 35 Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony- PCR..................................... 36 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm cắt xử lý vector PUC-1113 và vector pBI121 với enzyme XbaI và SacI ................................................................ 37 Hình 3.6. Kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong E. Coli 37 Hình 3.7. Kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong A.tumefaciens............................................................................................... 38 vi
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của alkaloid phân lập từ một số loài thuộc chi Bình vôi Stephania…………………………………………………………... 10 Bảng 2.1. Cặp mồi đặc trưng của phản ứng colony- PCR........................... 24 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng nối ghép gen............................................. 25 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng colony-PCR…………………………….. 26 Bảng 2.4. Thành phần dung dịch tách plasmid …………………………... 27 Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn........................... 28 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối ghép gen............................................. 28 Bảng 2.7. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn………………... 31 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng PCR…………………………………….. 32 vii
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Bình vôi có tên khoa học là Stephanta spp., họ Tiết dê (Menispermaceae), là một loài cây thân thảo dạng dây leo, phần rễ phát triển thành củ to, bám vào núi đá, có củ nặng tới hơn 40kg. Vỏ thân củ màu đen, xù xì giống như hòn đá. Củ còn được gọi là “củ một”, “củ mối trôn”, “ngải tượng”, “tử nhiên”… Cây Bình vôi thường ưa mọc ở những vùng có núi đá tại tỉnh Hà Giang, Tuyên Quang, Hòa Bình, Hà Tây (cũ) … Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất alkaloid: L-tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin. Những hợp chất này được sử dụng phổ biến để điều chế các loại thuốc quý có tác dụng an thần, dưỡng huyết, thanh nhiệt, giải độc, giảm đau, sốt nóng, đau dạ dày, trị ho có đờm, hen suyễn, khó thở… Hiện nay, cây Bình vôi đang bị khai thác nhiều, số lượng cây Bình vôi tự nhiên ngày càng giảm mạnh. Bình vôi đã được ghi trong Sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (V) và Danh mục Thực vật rừng quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ. Chi Bình vôi (Stephanta) có khoảng trên 45 loài, còn ở Việt Nam có từ 14 đến 16 loài, trong đó một số loài như Bình vôi hoa đầu (Stephania cepharantha Hayata), Bình vôi tím (Stephania rotunada Lour), Thiên kim đằng (Stephania japonica Miers) đang được khai thác, và nhìn chung hàm lượng rotundin của các loài Bình vôi là thấp và rất thấp, tùy thuộc từng loài và điều kiện sinh thái. Do vậy, định hướng nghiên cứu nhằm tăng hàm lượng rotundin ở cây Bình vôi được quan tâm, trong đó xác định việc tăng cường biểu hiện enzyme chìa khóa tham gia trong quá trình chuyển hóa tổng hợp rutundin là rất quan trọng. Columbamine O-methyltransferase (CoOMT) mới được phát hiện là một enzyme chìa khóa trong chuỗi chuyển hóa tổng hợp rotundin ở cây thuộc bộ Mao lương, trong đó có cây Bình vôi [77]. Biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme CoOMT sẽ làm tăng các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp và hàm lượng 1
rotundin trong cây Bình vôi được nâng cao. Xuất phát từ những lí do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa enzyme columbamine O- methyltransferase ở cây Bình vôi (stephania spp.)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế được cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa enzyme columbamine O- methyltransferase ở cây Bình vôi. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu lý thuyết về đặc điểm trình tự gen và protein CoOMT. - Tạo dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang gen nhân tạo CoOMT. - Thiết kế vector chuyển gen pBI121-1113 và tạo chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp mang gen CoOMT. 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cây Bình vôi 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học của cây Bình vôi Về nguồn gốc, phân loại: Chi Bình vôi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có nguồn gốc ở miền đông và nam châu Á cũng như Australasia. Tên gọi dân dã trong tiếng Việt là Bình vôi [91]. Về mặt phân loại, cây Bình vôi thuộc: Giới (regnum): Plantae Bộ (ordo): Ranunculales Họ (familia): Menisperrnaceae Chi (genus): Stephania Lour [13]. Trên thế giới chi Bình vôi (genus: Stephania) có khoảng 50 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới, chủ yếu như là các nước châu Á như: Trung Quốc 43 loài, Thái Lan 18 loài, Indonesia 17 loài, Việt Nam 14-16 loài, Malaysia 17 loài, Ấn Độ 11 loài, Philippine 8 loài, Papua New Guinea 8 loài, Myanma 5 loài, Nhật Bản 2 loài, Sri Lanka 2 loài, Lào 2 loài, Đông Timor 1 loài, Nepal 1 loài. Ngoài ra còn có ở châu Úc: Australia 7 loài và châu Phi 12 loài [11]. Ở Việt Nam, các loài trong chi Bình vôi phân bố rất rộng, trên nhiều địa phương từ Bắc vào Nam. Song các khu vực có số loài phong phú, đa dạng và tập trung hơn cả ở các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Yên Bái, Bắc Cạn, Tuyên Quang, Phú Thọ, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Lai Châu, Sơn La, Hòa Binh, Hà Tây, Hà Nam, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh. Một số ít loài (S. venosa, S. cambodica, Gagnep, S. pierrei) chỉ gặp ở các tỉnh phía Nam như: Đắc Lắc, Lâm Đồng, Bình Định, Phú Yến, Ninh Thuận, Khám Hòa, Bà Rịa-Vũng Tàu và An Giang [8]. 3
Đặc điểm sinh học Các loài trong chi Bình vôi (Stephania) đều là dây leo, sống lâu năm hoặc hằng năm. Ở giai đoạn non thân thường nhẵn, màu xanh nhạt, xanh bóng hoặc xanh đậm. Trên thân già thường có những rãnh dọc, những mụn cóc sần sùi, màu nâu xám, nâu đen hoặc màu nâu đất. Rễ dạng sợi hoặc phình to tạo thành rễ củ. Củ rất đa dạng về hình thái, kích thước và màu sắc. Củ thường có dạng hình cầu, hình trứng, hình trụ hoặc hình dạng bất định. Có loài rễ củ thường chỉ nặng 0,5 – 2kg (hoặc 3 kg), nhưng cũng có loài cho củ có thể nặng tới 50-70 kg. Tuy thuộc vào từng loài, tuổi cây và điều kiện môi trường sống mà hình thái, màu sắc vỏ củ cũng có nhiều thay đổi (nhẵn hoặc xù xì, màu nâu sáng, nâu đậm, xám tro, đen…). Thịt củ nạc hoặc có lẫn những vằn xơ, màu trắng ngà, vàng tươi, vàng nhạt hoặc đỏ nâu, đỏ tươi [16]. Lá Bình vôi mọc cách. Cuống lá thường mảnh, dài 2 đến 5 hoặc 15 đến 20 cm và hai đầu phồng lên [8], có khi gấp khúc ở gốc [11]. Cuống lá đính vào lá thường ở những vị trí cách xa mép dưới của gốc là ở những khoảng cách nhất định, tùy thuộc vào từng loài (có thể từ 1/5 đến 1/3 chiều dài phiến lá). Phiến lá mỏng hoặc dài, nhẵn mỏng hoặc rải rác có lông, hình khiên, hình tam giác rộng, hình trứng-tam giác, tam giác tròn hoặc gần tròn; mép lá nguyên hoặc chia thùy; gân lá dạng chân vịt, gồm 8-9 hoặc 10-12 gân chính cùng xuất phát từ đỉnh cuống lá. Chóp lá nhọn, thuôn nhọn, tù hoặc gần tròn; gốc lá gần tròn, phằng hoặc gần hình tim. Màu sắc của phiến lá tùy thuộc vào từng loài (màu xanh nhạt, xanh vàng nhạt, xanh đậm, xanh nâu nhạt hoặc đốm tía) [24]. Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực, cái thường mọc từ kẽ lá. Cụm hoa có dạng tính tán đơn, tán kép, xim tán kép, hình đầu đến tán ngù [8], có cuống đơn độc hoặc xếp theo kiểu chum ít nhất ở các nhánh tán cấp 1, các nhánh cuống cùng đôi khi không đều hoặc đôi khi các xim tụ họp thành đầu hình đĩa [13]. Hoa đực thường có cấu tạo đối xứng tỏa tròn, đài 6-8 rời, xếp thành 2 vòng; 3-4 cánh hoa, dạng vỏ sò, màu vàng, đôi khi trắng xanh; nhị 2-6, thường 4
4, chỉ nhị dính nhau tạo thành ống hình trụ, đầu nhụy xòe thành đĩa tròn. Hoa cái thường chỉ gồm 1 lá đài và 2 cánh hoa (rất ít khi có 3-4 lá đài và 3-4 cánh hoa), bầu hình trứng có 4 đến 6 hoặc 7 núm nhụy hình dùi [24]. Quả hạch, dạng hình gần tròn, hình trứng, trứng bầu, 2 bên dẹt. Ở quả trưởng thành cuống quả lệch về một phía gần với dấu vết còn lại của núm nhụy. Bầu 2 noãn, nhưng chỉ có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, nhẵn bóng. Hạt hình móng ngựa, hình trứng đẹp hoặc hơi tròn, 2 mặt bên lõm, ở giữa có lỗ thủng hoặc không, dọc theo gờ lưng bụng thường có 4 hàng vằn hoặc gai (một số loài có 5 hàng [24]. Đặc điểm hình thái của hạt thường đặc trưng cho từng taxon; nên đây được coi là một trong những dấu hiệu đáng tin cậy để giám định tên khoa học đối với các loài chi Bình vôi [8]. Cây mầm có lá mầm ít nhiều bằng rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ [14]. Sinh thái, sinh trường và phát triển của các loài Bình vôi Các loài thuộc cây Bình vôi thường sinh trưởng trong các rừng nguyên sinh hay rừng thứ sinh. Chúng thường mọc trên đỉnh hay các sườn núi đá vôi, núi đất xen lẫn đá, các dài đất ven đường, ven song, đôi khi gặp ở ven bòe biển. Sống thích hợp ở nhiệt độ trung bình năm 21- 23oC, lượng mưa 2000- 2500 mm, ưa đất nhiều mùn, thoát nước, độ pH= 6,5- 7. Một số loài có thể phân bố ở độ cao tới 2000 – 2800 m so với mực nước biển. Hầu hết các loài Bình vôi đều ưa đất có độ ẩm vừa phải và đặc biệt ở giai đoạn ra hoa tạo quả. Các loài Bình vôi hiện có ở Việt Nam có 2 thời vụ chồi chính trong năm. Vụ chồi đông xuân, bao gồm các chồi sớm xuất hiện (trên thân và trên đầu củ) ngay từ tháng 11- 12. Những chồi này ở trạng thái “chồi ngủ” cho đến mùa xuân (tháng 1- 2) thì bắt đầu thời kỳ sinh trưởng mạnh. Chỉ trong vòng 1- 2 tháng, chồi đã dài tới hơn 1 m. Chồi đông xuân là lứa chồi quan trọng nhất của cây Bình vôi, vì trên loài chồi này cây sẽ ra lá, ra hoa, quả và mọc ra lứa chồi xuân hè (chồi cấp II). Số lá chồi cấp II nhiều hơn cấp bội so với chồi đông xuân (tính trên cùng một đơn vị chiều dài của chồi). Lá trưởng thành ngay trong mùa 5
hè và sẽ rụng hết khi mùa khô hanh (tháng 10). Sự rụng lá hàng năm cũng là tập tính quang trọng của cây Bình vôi. Sự tái sinh chồi mạnh mẽ của cây Bình vôi còn thể hiện ở khả năng mọc mầm trên các mảnh bổ ra từ củ đem vùi xuống đất. Những mảnh ở đầu củ (khoảng 1/3 củ trở lên) mọc mầm tốt hơn những mảnh khác. Có thể áp dụng khả năng này để nhân giống cây Bình vôi. Trong tự nhiên, hoa Bình vôi được thụ phấn chéo chủ yếu nhờ côn trùng. Hạt Bình vôi thường rất nhỏ, khối lượng trung bình của 1000 hạt thường chỉ khoảng 10- 29g. Hạt phát tán nhờ nước. Các cá thể Bình vôi trồng từ hạt thường sinh trưởng, phát triển khá nhanh. Chỉ sau 5- 6 tháng tuổi, cây đã vươn dài tới 50-100) cm, phân cành khỏe. Ở một số loài, cây có thể bắt đầu ra hoa và cho quả khi mới bước vào giai đoạn 6- 8 tháng tuổi. Trong quá trình sinh trưởng, rễ chính thường lớn dần tạo thành củ (ở những loài có củ) hoặc phân nhánh nhiều tạo thành rễ dạng sợi (ở những loài chỉ có rễ dạng sợi) [8]. Hình 1.1. Hình ảnh về cây Bình vôi (Nguồn: http://www.thuocvuonnha.com/c/dung-cu-binh-voi-chua-mat- ngu/hoi-dap) 6
1.1.2. Giá trị của cây Bình vôi Trong nhân dân củ Bình vôi được sử dụng là một vị thuốc dân gian. Củ Bình vôi thái nhỏ, phơi khô được dùng dưới dạng sắc hay ngâm rượu chữa hen, ho lao, lỵ, sốt, đau bụng. Theo kinh nghiệm trong y học cổ truyền, Bình vôi được dùng dưới dạng thuốc sắc, thuốc bột hoặc rượu thuốc để chữa bệnh mất ngủ, sốt nóng, nhức đầu, đau dạ dày, ho nhiều đờm, hen suyễn khó thở… Liều dùng: 6 - 12 g/ngày [2], [3]. Thuốc ngâm rượu gồm bột Bình vôi (1 phần) với rượu 40° (5 phần); mỗi ngày uống 5 - 15 ml rượu, có thể thêm đường cho dễ uống [6]. Để tránh bị ngộ độc, nên sử dụng liều lượng 0,02 – 0,025g đối với trẻ 1 – 5 tuổi; 0,03 – 0,05g đối với trẻ 5 – 10 tuổi [6], [21]. Trong y học hiện đại, Bình vôi chủ yếu được dùng làm nguyên liệu chiết xuất lấy L-tetrahydropalmatin hoặc cepharanthin tuỳ theo loài. L-tetrahydropalmatin (Rotundin) được dùng là thuốc trấn kinh, an thần dùng trong các trường hợp: Mất ngủ, trạng thái căng thẳng thần kinh, một số trường hợp rối loạn tâm thần [6], [17], [94]. Liều dùng là 0,05g - 0,10g dưới dạng viên L-tetrahydropalmatin hydroclorid hoặc sulfat [6], [94]. Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất alkaloid: L-tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin. Những hợp chất này được sử dụng phổ biến để điều chế các loại thuốc. Các alkaloid này thuộc nhóm alkaloid dẫn xuất của nhân isoquinolin. Trong đó quan trọng nhất là rotundin. Một số kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính sinh học của alkaloid và rotudin trong cây như sau: Alkaloid là một hợp chất hữu cơ chứa nitơ, đa số có nhân vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp ở thực vật và đôi khi trong động vật, có dược lực tính mạnh và độc, cho kết tủa và phản ứng màu với một số thuốc thử gọi là thuốc thử của alkaloid. Các alkaloid trong cây tồn tại dưới dạng muối với các hợp chất hữu cơ như acid succinic, acid oxalic, acid malic, acid meconic [55]. 7
Alkaloid thường là các chất có trọng lượng phân tử cao, ở thể rắn ở nhiệt độ thường. Các alkaloid ở thể rắn thường là các alkaloid không bay hơi, các alkaloid bay hơi thường ở thể lỏng. Ở thể rắn, chúng dễ kết tinh và có độ chảy xác định. Một số alkaloid không đo được độ chảy do bị phá hủy ở nhiệt độ thấp hơn độ chảy. Các alkaloid ở dạng lỏng thường không có oxy trong phân tử (nicotin, spartein). Các alkaloid ở dạng lỏng dưới dạng tự do nhưng khi tạo muối với acid thì nó có thể chuyển sang thể rắn (spartein ở thể lỏng nhưng spartein sulfat ở thể rắn). Tuy nhiên có một vài trường hợp ngoại lệ một số alkaloid có oxy trong phân tử nhưng vẫn ở thể lỏng như arecolin, pilocarpin [16], [4]. Alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chất rất độc. Tác dụng của alkaloid thường khác nhau ở những loại cây khác nhau. Trên thế giới hiện nay dùng nhiều thuốc tổng hợp nhưng vẫn không bỏ được các alkaloid lấy từ cây cỏ, vì có chất chưa tổng hợp được, và cũng có nhiều thuốc sản xuất tổng hợp không rẻ hơn chiết xuất hoặc tác dụng của chất tổng hợp chưa bằng tác dụng của các chất lấy từ cây. Do đó, người ta vẫn dùng phương pháp chiết xuất từ cây, ví dụ như ajmalin, morphin, reserpin, quinin, eserin hoặc vừa sử dụng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên vừa tổng hợp vừa bán tổng hợp, ví dụ như: ajimalisin, theobromin, cafein, ephedrine, atropine, vincamin [16], [4], [8]. Trước đây, người ta cho rằng nhân cơ bản của các alkaloid là do các chất đường hay thuộc hợp chất của đường kết hợp với ammoniac để có nitơ mà sinh ra. Ngày nay bằng phương pháp dùng các nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóng xạ) người ta chứng minh được alkaloid tạo ra từ các acid amin. Qua định tính và định lượng alkaloid trong các bộ phận khác nhau của cây và theo dõi sự thay đổi của chúng trong quá trình phát triển của cây, người ta thấy nơi tạo ra alkaloid không phải luôn luôn là nơi tích tụ alkaloid. Nhiều alkaloid được tạo 8
ra ở rễ lại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây, sau khi thực hiện những biến đổi thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quả hoặc hạt. Năm 1941, Trần Xuân Thuyết cùng với Đỗ Tất Lợi và P. Bonnet đã phát hiện ra hỗn hợp alkaloid của củ Bình vôi, đặt tên là rotundin - có tác dụng an thần gây ngủ, hạ huyết áp, điều hòa tim, giãn cơ trơn, do đó giảm các cơn đau do co thắt cơ trơn [96]. Năm 1998, Nguyễn Tiến Vững và cs đã tiến hành thăm dò tác dụng của L-tetrahydropalmatin trên điện não thỏ. Tất cả các thỏ được tiến hành đặt điện cực vào vùng cảm giác, vận động và thể lưới thân não. Kết quả là sau khi cho thỏ uống L-tetrahydropalmatin với liều 100 mg/kg thể trọng trong 7 ngày liền, thành phần các sóng điện não trong vỏ não vùng cảm giác-vận động và trong thể lưới thân não có những biến động rõ. Sự tăng thành phần sóng chậm denta và giảm thành phần sóng nhanh beta chứng tỏ rằng L-tetrahydropalmatin có tác dụng tăng cường quá trình ức chế trong các tế bào thần kinh ở vỏ bán cầu đại não và thể lưới thân não [14]. Năm 1996, Dương Hữu Lợi thử nghiệm tiêm cho chuột nhắt trắng 0,1 ml dung dịch L- tetrahydropalmatin ở các nồng độ khác nhau 0,5%, 1%, 2% nhận thấy đều có tác dụng làm chuột nhắt trắng trấn tĩnh, tác dụng này được duy trì trong vòng 3-5 giờ [4]. Theo Zhu (1991), D-tetrahydropalmatin và L-tetrahydropalmatin được phân lập từ nhiều loài thuộc chi Stephania và cây Corydalis ambigua không chỉ có tác dụng giảm đau mà còn có tác dụng an thần gây ngủ [90]. Năm 1986, Phạm Duy Mai và Phan Đức Nhuận nghiên cứu đã cho thấy gindarin hydroclorid (L- tetrahydropalmatin hydroclorid) và hỗn hợp alkaloid chiết từ củ Bình vôi đều tăng cường tác dụng gây ngủ của thiopental một cách rõ rệt. Gindarin hydroclorid với liều 30 mg/kg thể trọng chuột có khả năng kéo dài thời gian ngủ lên 1,5 lần. Hỗn hợp alkaloid với liều 100 mg/kg thể trọng chuột cũng có tác dụng tương đương [18]. 9
Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của alkaloid phân lập từ một số loài thuộc chi Bình vôi Stephania Hoạt tính Tên chất Tài liệu Chống sốt rét Dehydroroemerine, tetrahydropalmatine, xylopinine, cepharanthine, Nmethylliriodendronine, [30], [53] 2-O, N dimethylliriodendronine, liriodenine, dicentrinone, corydine, aloe-emodine Kháng sinh Glabradine, dịch chiết trong cồn từ củ từ loài S. glabra (Roxb.) Mies, dịch chiết [48], [71] trong methanol từ rễ của loài S. japonica, cepharanone D,Nformyl-asimilobine, Nformylannonain Diệt giun sán Dịch chiết trong cồn từ rễ của loài của cây [40] S. glabra (Roxb.) Miers Chống virus Dịch chiết từ củ trong methanol của loài S. [26], [51] cepharantha Hayata Chống ung thư dl-tetrandrine, fangchinoline, d- tetrandrine, d-isochondrodendrine, dịch chiết trong cồn từ củ của loài S. venosa [29], [31] (Blume) Spreng, aporphine, cepharanthine, cepharanoline, isotetrandrine. An thần (−)-Stepholidine, Ltetrahydropalmatin [41], [90] Kích đẻ cho phụ sản Tetrandrine [89] Đảo chiều đa kháng Insotrilobine và trilobine [46] Chống viêm và Tetrandrine, fangchinoline, [31], [42] giảm đau Ltetrahydropalmatin, cepharinthin Miễn dịch Tetrandrine [47], [63] Chặn kênh Ca2+ Tetrandrine [67], [79] Chống oxi hóa Fangchinoline cepharanthine [45], [74] 10
Nguyễn Tiến Vững đã thử tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của L- tetrahydropalmatin trên chuột nhắt trắng cho thấy L- tetrahydropalmatin đã kéo dài giấc ngủ của pentotal rất rõ rệt, liều 40 mg/kg thể trọng chuột (bơm trực tiếp vào dạ dày) đã làm tăng thời gian ngủ cùa chuột lên 8 lần [14]. Theo Mantsch John R, Li Shi-Jiang. L-tetrahydropalmatin có tác dụng trong điều trị cai nghiện cocain và trong điều trị cai nghiện oxycodone [56]. Rotundin có tên khoa học là L-tetrahydropalmatin, đây là một alkaloid, lần đầu tiên thu được vào năm 1902 nhờ phương pháp hydro hóa palmatin trong quá trình nghiên cứu cấu trúc của palmatin theo phản ứng [50]. Hình 1.2. Công thức cấu tạo của palmatin và L-tetrahydropalmatin (rotundin) Rotundin có công thức phân tử: C12H25NO4. Khối lượng phân tử là M=355,43. Danh pháp quốc tế của rotundin: 5,8,13,13a-tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy-6H dibenzo [a, g] quinolizine. Đây là một hợp chất hữu cơ gồm 4 vòng kết dính, chứa nhân dị vòng isoquinolin, vì thế nó thuộc loại isoquinolin alkaloid và đó cũng là một trong các bộ khung alkaloid rất thường gặp trong một số họ thực vật. Rotundin là hợp chất ít độc và có nhiều hoạt tính vô cùng phong phú. Kết quả nghiên cứu ở Liên Xô (cũ), Rumani, Trung quốc đã chỉ ra rằng L- tetrahydropalmatin rất ít độc. Thí nghiệm cho thấy rằng một liều cao hơn 30 mg/kg cơ thể được tiêm vào mạch máu con thỏ chỉ làm thỏ mệt 1-2 ngày, đồng tử bị liệt nhất thời rồi hết [16], [6]. 11