Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Đánh giá mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và các chỉ số tinh dịch đồ ở nam giới vô sinh đến khám và điều trị tại Bệnh viện A Thái Nguyên

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:75

Thêm vào BST

Báo xấu

21
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm phân tích sự phân mảnh DNA của tinh trùng và mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh với các chỉ số tinh dịch đồ phục vụ cho công tác chẩn đoán và điều trị vô sinh nam tại Bệnh viện A Thái Nguyên. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Đánh giá mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và các chỉ số tinh dịch đồ ở nam giới vô sinh đến khám và điều trị tại Bệnh viện A Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ..................  .................... DƯƠNG THỊ NHÀN ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN HỆ GIỮA MỨC ĐỘ PHÂN MẢNH DNA TINH TRÙNG VÀ CÁC CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ Ở NAM GIỚI VÔ SINH ĐẾN KHÁM VÀ ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN A THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN, 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ..................  .................... DƯƠNG THỊ NHÀN ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN HỆ GIỮA MỨC ĐỘ PHÂN MẢNH DNA TINH TRÙNG VÀ CÁC CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ Ở NAM GIỚI VÔ SINH ĐẾN KHÁM VÀ ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN A THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 84 20 201 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Phú Hùng THÁI NGUYÊN, 2020
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết quả thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn này, em xin trân trọng được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Phú Hùng đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình em tiến hành nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và truyền cho em niềm đam mê nghiên cứu khoa học. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Bộ phận Sau đại học – Phòng Đào tạo & QHQT, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thủ tục, văn bản trong suốt quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Bệnh viện A Thái Nguyên, đặc biệt các anh chị, các bạn, các em trong Khoa Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh viện A Thái Nguyên nơi tôi đang công tác, đã chia sẻ và giúp đỡ tôi trong thời gian tôi tiến hành làm luận văn. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn bố mẹ, anh chị em trong gia đình luôn động viên và cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Thái Nguyên,09 tháng 07 năm 2020 Tác giả Dương Thị Nhàn
iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................... 3 3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4 1.1. Sơ lược sinh lý sinh sản nam.......................................................................... 4 1.1.1. Cấu tạo hệ sinh dục nam ......................................................................... 4 1.1.2. Cấu tạo tinh trùng người ......................................................................... 4 1.1.2. Cấu tạo nhiễm sắc chất tinh trùng người ................................................ 7 1.2. Tình hình vô sinh ở nam giới ......................................................................... 8 1.2.1. Sơ lược vô sinh nam ................................................................................ 8 1.2.2. Nguyên nhân vô sinh ở nam giới ............................................................ 9 1.2.3. Sơ lược tinh dịch đồ ................................................................................ 9 1.3. Sự phân mảnh DNA tinh trùng người .......................................................... 10 1.3.1. Khái niệm về sự phân mảnh DNA tinh trùng ....................................... 11 1.3.2. Một số nguyên nhân chính gây tổn thương DNA của tinh trùng.......... 11 1.3.3. Ảnh hưởng của sự phân mảnh DNA tinh trùng tới khả năng sinh sản của nam giới .................................................................................................... 13 1.3.4. Các phương pháp xác định sự phân mảnh DNA tinh trùng .................. 15 1.3.5. Phương pháp khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh trùng .................... 16 1.4. Tình hình khám và điều trị vô sinh tại khoa Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh viện A Thái Nguyên ........................................................................................................ 18 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................ 21 NGHIÊN CỨU .................................................................................................... 21 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu............................................... 21 2.2. Hóa chất và thiết bị....................................................................................... 22 2.2.1. Hóa chất................................................................................................. 22
iv 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 22 2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 23 2.3.1. Phương pháp thu nhận mẫu bệnh phẩm ................................................ 23 2.3.2. Phương pháp phân tích tinh dịch đồ ..................................................... 23 2.3.3. Quy trình phân tích sự phân mảnh DNA tinh trùng bằng phương pháp khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất (SCSA) ....................................................... 24 2.3.4. Phân tích số liệu .................................................................................... 25 2.4. Đạo đức trong nghiên cứu ............................................................................ 25 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 26 3.1. Đặc điểm lâm sàng và đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu .... 26 3.1.1. Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu ...................................... 26 3.1.2. Đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu ................................. 28 3.2. Kết quả phân tích mức độ phân mảnh DNA của tinh trùng......................... 29 3.3. Kết quả mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với đặc điểm lâm sàng và chỉ số tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu ................................. 31 3.3.1. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với các đặc điểm lâm sàng........................................................................................................... 32 3.3.2. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và chỉ số tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 49 1. Kết luận ........................................................................................................... 49 2. Kiến nghị ......................................................................................................... 50
v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AO Acridine orange Phương pháp nhuộm AOT Acridine orangetest acridine orange Assited reproductive ART Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản techniques BN Bệnh nhân DFI DNA fragmentation index Chỉ số phân mảnh DNA dsDNA Double – stranded DNA DNA mạch đôi Máy phân tích dòng chảy FCM Flow cytometer tế bào Hormon kích thích nang FSH Follice stimulating hormone noãn HTSS Hỗ trợ sinh sản Hormon kích thích hoàng LH Luteinizing hormone thể Intra cytoplasmic sperm Kỹ thuật tiêm tinh trùng ICSI ịnjection vào bào tương trứng Kỹ thuật bơm tinh trùng IUI Intra ulterine insemination vào buồng tử cung IVF Invitro fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm NST Nhiễm sắc thể ROS Reactive oxygen species Các tác nhân oxy hóa GTMTT Giãn tĩnh mạch thừng tinh TTTON Thụ tinh trong ống nghiệm
vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Giá trị bình thường của tinh dịch đồ [54], [81] .................................. 10 Bảng 1.2. Một số phương pháp xác định sự phân mảnh DNA tinh trùng .......... 15 Bảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng cho nghiên cứu ..................................... 22 Bảng 2.2. Danh mục dụng cụ sử dụng cho nghiên cứu ...................................... 22 Bảng 2.3. Danh mục thiết bị sử dụng cho nghiên cứu........................................ 23 Bảng 3.1. Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu ................................... 26 Bảng 3.2. Đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu .............................. 28 Bảng 3.3. Kết quả đánh giá mức độ phân mảnh DNA tinh trùng ...................... 30 Bảng 3.4. Mối liên hệ giữa việc sử dụng rượu bia với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng ............................................................................................................. 32 Bảng 3.5. Mối liên hệ giữa việc sử dụng thuốc lá với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng ............................................................................................................. 34 Bảng 3.6. Mối liên hệ giữa tiền sử bị quai bị với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng..................................................................................................................... 36 Bảng 3.7. Mối liên hệ giữa độ tuổi với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng .... 38 Bảng 3.8. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với thời gian kiêng xuất tinh ..................................................................................................... 40 Bảng 3.9. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với độ pH của tinh dịch ............................................................................................................... 41 Bảng 3.10. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với thể tích xuất tinh ............................................................................................................... 42 Bảng 3.11. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với mật độ tinh trùng ... 43 Bảng 3.12. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với độ di động của tinh trùng..................................................................................................................... 44 Bảng 3.13. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với tỷ lệ sống của tinh trùng..................................................................................................................... 45 Bảng 3.14. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với hình dạng của tinh trùng..................................................................................................................... 47
vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc tinh trùng trưởng thành ......................................................... 5 Hình 1.2. Sự sinh tinh .......................................................................................... 6 Hình 1.3. Cấu trúc chromatin của tinh trùng ....................................................... 8 Hình 1.4. Các cơ chế chính gây tổn thương DNA trong tinh trùng trong quá trình sản xuất hoặc vận chuyển các tế bào tinh trùng ........................................ 11 Hình 3.1. Cường độ tín hiệu của tinh trùng sau khi nhuộm AO ....................... 29 Hình 3.2. Tần suất mức độ phân mảnh DNA tinh trùng trong tổng số 151 bệnh nhân được nghiên cứu ......................................................................................... 31 Hình 3.3. Mối liên hệ giữa tiền sử quai bị với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng..................................................................................................................... 37 Hình 3.4. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và pH tinh dịch41 Hình 3.5. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với mật độ tinh trùng ..... 43 Hình 3.6. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với độ di động của tinh trùng..................................................................................................................... 45 Hình 3.7. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với tỷ lệ sống của tinh trùng..................................................................................................................... 46
1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1. Lý do chọn đề tài Vô sinh là tình trạng không có thai sau một thời gian 1 năm chung sống vợ chồng và không sử dụng một biện pháp tránh thai nào [110]. Vô sinh đã trở nên phổ biến trên toàn thế giới và ảnh hưởng đến hơn 70 triệu cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh sản [23]. Theo ghi nhận của y văn thế giới, tỷ lệ vô sinh nam chiếm từ 30 – 40% và cách đây hơn 10 năm, tỷ lệ nam giới điều trị hiếm muộn có liên quan đến bất thường tinh dịch chiếm 77,3% [7]. Có ý kiến cho rằng khả năng sinh sản của nam giới đã giảm trong nhiều thập kỷ qua [51] và tỷ lệ khuyết tật hạt nhân tinh trùng là nguyên nhân gây vô sinh được ước tính đại diện cho khoảng 3% các cặp vợ chồng vô sinh được hỗ trợ bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF - In Vitro Fertilization) [62]. Trong hai thập kỷ qua, hình thái tinh trùng được công nhận là một yếu tố dự báo quan trọng về kết quả trong thụ tinh nhân tạo, thông thường là IVF và ICSI (Intra cytoplasmic sperm injection) [74]. Trong khi mối quan hệ giữa mật độ tinh trùng và sự phân mảnh DNA tinh trùng (SDF- Sperm DNA fragmentation) ở nam giới hiếm muộn có vẻ khác nhau, mối tương quan giữa SDF và khả năng sống của tinh trùng cũng đã được đánh giá [24]. Nhiều nghiên cứu cho thấy mức độ đứt gãy DNA tinh trùng ở những người nam vô sinh cao hơn ở người bình thường [21], [100] và có mối liên quan giữa mức độ dị dạng của tinh trùng với sự phân mảnh DNA tinh trùng [27], [77], nhưng yếu tố để dự đoán mức độ phân mảnh DNA tinh trùng không phải là hình dạng tinh trùng [27] và những tinh trùng bình thường vẫn có thể mang DNA bị phân mảnh [16]. Tinh trùng có tỷ lệ DNA phân mảnh cao sẽ làm ảnh hưởng tới chất lượng tinh trùng và kết quả có thai của các trường hợp bệnh nhân được điều trị bằng các phương pháp hỗ trợ sinh sản. DNA bị phân mảnh sẽ ảnh hưởng tới độ di động của tinh trùng [95], làm giảm tỷ lệ thụ tinh đối với các trường hợp làm ICSI [79], tăng nguy cơ sảy thai [108], giảm chất lượng phôi, giảm tỷ lệ tiền làm tổ [48]. Theo Aziz N (2008), thất bại của IUI (Intra ulterine insemination) đòi
2 hỏi phải đánh giá thêm các đặc tính sinh học của tinh trùng, chẳng hạn như dấu hiệu apoptotic và phân mảnh DNA tinh trùng [17]. Các phương pháp phổ biến được sử dụng để đánh giá sự phân mảnh DNA tinh trùng gồm có phương pháp khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất tinh trùng (SCD – Sperm chromatin dispersion assay), phương pháp khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh trùng (SCSA – Sperm chromatin structure assay), phương pháp dịch mã đứt gãy tại chỗ,... Một trong những phương pháp phổ biến được sử dụng để đánh giá sự phân mảnh DNA tinh trùng là phương pháp SCSA. Phương pháp này sẽ định lượng sự phân mảnh DNA trực tiếp dựa vào sự kết hợp DNA bị biến tính với chất nhuộm DNA huỳnh quang acridine orange. Giá trị ngưỡng của SCSA đã được xác định và đưa vào trong chẩn đoán lâm sàng. SCSA là một phương pháp có nhiều tiềm năng hỗ trợ cho chẩn đoán và điều trị của các cặp vợ chồng hiếm muộn. Tại Bệnh viện A Thái Nguyên, lượng bệnh nhân vô sinh đến khám và điều trị ngày càng tăng và với nhiều nguyên nhân khác nhau. Để đưa ra được hướng điều trị nhằm đạt kết quả tốt nhất cho từng trường hợp, các cặp vợ chồng cần phải làm đầy đủ các xét nghiệm lâm sàng, đối với nữ: xét nghiệm nội tiết, siêu âm đánh giá tử cung – buồng trứng, xét nghiệm máu cơ bản (viêm gan B, viêm gan C, HIV,…); đối với nam: xét nghiệm nội tiết, xét nghiệm tinh dịch đồ, xét nghiệm máu cơ bản, và gần đây là xét nghiệm phân mảnh DNA tinh trùng. Ở Việt Nam hiện nay, có nhiều trung tâm đã nghiên cứu và triển khai đánh giá mức độ phân mảnh DNA tinh trùng bằng nhiều phương pháp khác nhau. Tuy nhiên, để đánh giá mối tương quan giữa các chỉ số tinh dịch đồ với mức độ phân mảnh của các trường hợp vô sinh nam đến khám và điều trị tại khoa Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh viện A Thái Nguyên chưa được xây dựng. Chính vì vậy, tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và các chỉ số tinh dịch đồ ở nam giới vô sinh đến khám và điều trị tại Bệnh viện A Thái Nguyên” để góp phần vào việc đưa
3 thêm yếu tố tiên lượng cho việc hỗ trợ điều trị hiếm muộn được cải thiện và nâng cao hơn. 2. Mục tiêu nghiên cứu Phân tích sự phân mảnh DNA của tinh trùng và mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh với các chỉ số tinh dịch đồ phục vụ cho công tác chẩn đoán và điều trị vô sinh nam tại Bệnh viện A Thái Nguyên. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu các chỉ số tinh dịch đồ và đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu. - Phân tích mức độ phân mảnh DNA tinh trùng của đối tượng nghiên cứu. - Phân tích mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và các chỉ số tinh dịch đồ.
4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược sinh lý sinh sản nam 1.1.1. Cấu tạo hệ sinh dục nam Hệ sinh dục nam bao gồm: - Tinh hoàn: là nơi sinh ra tinh trùng và tổng hợp nội tiết tố nam testosterone. - Đường dẫn tinh trùng: từ tinh hoàn đi đến đổ vào niệu đạo và ra ngoài. - Các tuyến sinh dục phụ: chế tiết các dịch tiết, đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành tinh dịch. Sự điều hòa hoạt động sinh tinh chế tiết nội tiết tố của tinh hoàn thông qua trục hạ đồi – tuyến yên – tinh hoàn và một số cơ chế điều hòa nội tại ở tinh hoàn. Hiện tượng cương dương vật và phóng tinh ở nam có sự tham gia của hệ thần kinh tự động và hệ thần kinh cảm thể [3], [7]. Trong những năm gần đây, vô sinh nam đang thu hút sự quan tâm ngày càng tăng vì bằng chứng về chất lượng tinh dịch giảm ở những người đàn ông trẻ và khỏe mạnh trên toàn thế giới [12], [83], [106]. Giảm số lượng hay chất lượng tinh trùng hay bất thường ở bất kỳ giai đoạn nào trong quá trình sinh tinh trùng, vận chuyển tinh trùng, phóng tinh… đều có thể dẫn đến vô sinh nam [21], [100]. 1.1.2. Cấu tạo tinh trùng người Tinh trùng người là các tế bào đơn bội, mang 23 nhiễm sắc thể (NST) là đặc điểm di truyền của người cha. Tinh trùng có cấu tạo phù hợp giúp tinh trùng có thể di chuyển, nhận biết và thụ tinh với noãn trong đường sinh dục nữ. Tế bào tinh trùng có kích thước nhỏ nhất trong cơ thể và có mức độ biệt hóa cao. Một tinh trùng trưởng thành có chiều dài khoảng 50µm, bao gồm phần đầu và phần đuôi. Phần đầu có chiều dài khoảng 5µm, ngang 2,5µm và dày 1,5µm bao gồm
5 thể cực đầu (acrosome) chứa các enzyme cần thiết cho quá trình thụ tinh và nhân chứa vật chất di truyền [1]. Phần đuôi tinh trùng dài khoảng 45µm, gồm phần cổ, đoạn giữa, đoạn chính và chóp đuôi. Đuôi tinh trùng là bộ phận chịu trách nhiệm chính cho khả năng di động của tinh trùng (Hình 1.1) Hình 1.1. Cấu trúc tinh trùng trưởng thành [14] (Head: đầu; Plasma membrane: màng plasma; Acrosome: thể cực đầu; Nucleus: nhân; Centriole: trung thể; Mitochondria: ty thể; Mid-pieace: đoạn giữa; Tail: đuôi; End piece: chóp đuôi; Flagellium: roi; Axialflament: trục chính) Theo Mortimer (1994), sau khi quá trình sinh tinh được diễn ra, để hình thành nên tinh trùng trưởng thành từ tinh nguyên bào sẽ mất khoảng 70 ± 4 ngày và gồm 2 giai đoạn chính [84]: - Giai đoạn hình thành tinh tử. - Giai đoạn tinh tử biệt hóa thành tinh trùng. Các tinh nguyên bào tinh trùng gồm có tinh nguyên bào loại A1, A2, A3, A4, tinh nguyên bào trung gian và tinh nguyên bào loại B nằm ở phần biểu mô gần màng đáy ống sinh tinh. Mỗi loại, theo thứ tự là kết quả của việc phân chia nguyên nhiễm từ loại tinh nguyên bào trước đó. Tinh nguyên bào loại B là loại cuối cùng còn nguyên phân để tạo nên tinh bào sơ cấp. Các tinh bào sơ cấp trải qua giảm phân I tạo thành tinh bào thứ cấp. Tinh bào thứ cấp giảm phân II tạo ra tinh tử đơn bội. Theo Dym (1971), các tinh nguyên bào sẽ liên kết với nhau qua cầu sinh chất trong suốt quá trình phân bào và tế bào chất phân chia không hoàn toàn. Suốt quá trình phát triển, các tế bào dần dần di chuyển từ màng đáy để tiến về lòng ống sinh tinh. Khi tinh tử đến thành ngoài cùng của lòng ống, chúng tách bỏ phần tế bào chất dính với nhau (thể thừa) và biệt hóa thành các tinh trùng tự do [41], [88].
6 Để tạo nên tinh trùng trưởng thành, tinh tử sẽ thay đổi về cấu tạo, hình thái sau khi trải qua 3 bước gồm: sự cô đặc nhân, sự hình thành thể cực đầu (acrosome) và quá trình hình thành đuôi. Sự cô đặc nhân là quá trình nén chặt để NST (Nhiễm sắc thể) có cấu trúc nhỏ gọn nhất. Cấu trúc này giúp ổn định và bảo vệ DNA người cha trong suốt quá trình di chuyển của tinh trùng. Acrosome được hình thành từ bộ máy Golgi, che phủ khoảng 30 – 50% bề mặt nhân tế bào tinh trùng [37]. Acrosome có chứa nhiều enzyme thủy phân, bao gồm hyaluronidase và proacrosine, cần thiết cho quá trình xâm nhập vào noãn và thụ tinh của tinh trùng. Những enzyme này có vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ tinh trùng xâm nhập vào màng trong suốt (màng zona pellucida – zp) của noãn. Như vậy, nhân tinh trùng và acrosome là cấu tạo chính phần đầu của tinh trùng. Phần cổ và đuôi tinh trùng được hình thành từ trung tử. Đuôi có cấu trúc sợi trục, gồm hai sợi trong trung tâm và chín cặp ngoại vi. Các ti thể bao bọc quanh sợi trục ở phần giữa, cung cấp năng lượng cho hoạt động di chuyển của đuôi tinh trùng. Hình 1.2. Sự sinh tinh [41] Như vậy, sự biệt hóa thành tinh tử được đặc trưng bởi việc bất hoạt bộ gen, nhiễm sắc thể được nén chặt tạo thuận lợi cho quá trình di chuyển của tinh trùng và sự hình thành các cấu trúc chức năng quan trọng cho quá trình di chuyển và thụ tinh như phần đuôi tinh trùng, thể cực đầu. Sự phát sinh tinh trùng là một quá trình được kiểm soát liên tục và chính xác, bao gồm những thay đổi cực kỳ rõ rệt về tế bào, di truyền và nhiễm sắc thể dẫn đến việc tạo ra các tế bào tinh trùng chuyên biệt cao. Sau khi tinh trùng được giải phóng ra mào tinh, tinh trùng mất đi các túi bào tương thừa ở cổ, ổn định cấu trúc cực đầu. Cấu trúc glycoprotein màng ngoài tinh trùng thay đổi tạo thuận lợi cho quá trình nhận diện và phản ứng với noãn. Bên cạnh đó, mức độ chuyển hóa trong tinh trùng tăng dần và khả năng di động của tinh trùng tăng dần trong thời gian tinh trùng di chuyển dọc theo mào
7 tinh. Như vậy, sự trưởng thành của tinh trùng trong mào tinh giúp tinh trùng tăng khả năng di chuyển, nhận diện và kết hợp với noãn trong đường sinh dục nữ. 1.1.2. Cấu tạo nhiễm sắc chất tinh trùng người Nhiễm sắc chất (Chromatin) là vật chất di truyền của tế bào gồm các chuỗi DNA kết hợp với protein cấu trúc. Phần lớn chất nhiễm sắc của tinh trùng được ngưng tụ bởi các protamine ở dạng cấu trúc hình xuyến rất nhỏ gọn, mỗi cấu trúc chứa khoảng 50 Kb DNA [18], [62], mặc dù khoảng 8% DNA vẫn được tổ chức bởi histones [55], [56], [61]. Các protein cấu trúc này có vai trò tổ chức hình thái và điều hòa hoạt động của DNA. Ở tế bào sinh dưỡng, protein cấu trúc chủ yếu là các protein histone. Chromatin trong tế bào tinh trùng có sự khác biệt với chromatin của tế bào sinh dưỡng. Trước quá trình giảm phân, chromatin của tinh nguyên bào cũng mang các protein histone, khi các tế bào giảm phân, protein histone này được thay thế bởi biến thể histone đặc trưng cho tinh hoàn [30]. Trước khi tiến hành thay thế histone, chromatin dãn rộng và có nhiều vùng co cụm. Các biến thể histone thay thế vào giúp chromatin trở nên gọn gàng và đồng đều hơn [86]. Tiếp theo, trong các tinh tử hình cầu, protein histone được thay thế dần bởi protein chuyển tiếp. Đến giai đoạn tinh tử kéo dài, protein chuyển tiếp bị loại khỏi chromatin và thay bằng protamine. Ở người khi kết thúc quá trình sinh tinh, khoảng 85% histone được thay thế bởi protamine [39]. Quá trình thay thế histone thành protamine rất quan trọng trong sự hình thành tinh trùng cũng như chức năng sinh lý của tinh trùng khi gặp noãn [115]. Protamine có kích thước khoảng một nửa histone. Chúng là các protein rất kiềm, giàu 2 amino axit là arginine và cysteine [39], [71]. Hàm lượng arginine cao (lên đến 70% trong tổng số các amino axit) hình thành một mạng lưới điện tích dương, giúp protamine có thể liên kết chặt chẽ với DNA mang điện tích âm [26]. Cysteine góp phần trong việc hình thành cầu nối disulfide nội phân tử của protamine và liên kết giữa các protamine với nhau [34]. Protamine giúp nén chặt các sợi DNA và hình thành các đơn vị đóng gói cơ bản của chromatin tinh trùng được gọi là toroid, một phần nhỏ liên kết với histone tạo cấu trúc lỏng lẻo hơn
8 và phần còn lại liên kết với chất nền nhân tinh trùng (Matrix Attachment Regions - MAR) có kích thước khoảng 50kb (Hình 1.3). Các liên kết chéo disulfide nội phân tử và liên phân tử giữa các cysteine trong protamine giúp các toroid càng nén chặt hơn nữa [70]. Với cấu trúc có sự tham gia của protamine, DNA tinh trùng người được nén chặt bằng 1/6 so với DNA của tế bào sinh dưỡng bình thường. Hình 1.3. Cấu trúc chromatin của tinh trùng [111] Thành phần protein quan trọng khác trong cấu trúc DNA tinh trùng là histone. Theo Hammoud và cộng sự (2009), có khoảng 4% lượng DNA liên kết với histone tại các vùng gen khởi động phiên mã (gene promoter site) [61]. Toàn bộ các vùng gen đặc trưng cho quá trình sinh tinh và thụ tinh được xác định là liên kết với histone trong nhiễm sắc thể của tinh trùng. Tuy nhiên, những vùng gen này lại dễ bị bất hoạt bởi hoạt động của các enzyme nuclease. Histone trong DNA tinh trùng không được thay thế bởi histone của noãn sau quá trình thụ tinh nên bất cứ tổn thương nào ở vùng này cũng sẽ truyền trực tiếp cho phôi [10]. Do đó, nếu không được phát hiện và sửa chữa sẽ ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của phôi và thai nhi. 1.2. Tình hình vô sinh ở nam giới 1.2.1. Sơ lược vô sinh nam Vô sinh nam được định nghĩa là tình trạng nam giới không có khả năng thụ thai cho nữ giới sau khi kết hôn 12 tháng mà không sử dụng biện pháp tránh thai nào [40]. Người ta ước tính rằng 20 - 30% các trường hợp vô sinh chỉ do yếu tố nam giới và 20% khác liên quan đến các vấn đề từ cả hai vợ chồng [64] và sự suy giảm số lượng tinh trùng được báo cáo trong các báo cáo khoa học ngày càng tăng [78]. Song song với số lượng tinh trùng, suy giảm là một xu hướng đáng lo ngại không kém và kéo dài trong các bất thường của hệ thống sinh sản nam giới, chẳng hạn như hiện tượng tinh hoàn ẩn, khối u tế bào mầm và đến tuổi dậy thì [104]. Nếu xu hướng tiêu cực về số lượng tinh trùng và các vấn đề về hệ thống sinh sản nam có giá trị, thì điều đó có nghĩa gì đối với khả năng
9 sinh sản của nam giới nói chung và có những vấn đề khác liên quan đến sức khỏe sinh sản của nam giới [105]. 1.2.2. Nguyên nhân vô sinh ở nam giới Các nguyên nhân dẫn tới vô sinh nam bao gồm [3]: - Nhóm nguyên nhân bất thường về tinh trùng: + Thiểu năng tinh trùng: Tinh trùng ít, yếu, dị dạng. + Không tinh trùng. - Nhóm nguyên nhân khác: + Giãn tĩnh mạch thừng tinh (GTMTT). + Rối loạn chức năng giao hợp, rối loạn phóng tinh. + Rối loạn nội tiết. + Miễn dịch. + Bệnh lý toàn thân. + Tổn thương tinh hoàn mắc phải. + Nhiễm trùng tuyến sinh dục phụ. + Bệnh lý di truyền. 1.2.3. Sơ lược tinh dịch đồ Người ta ước tính các bất thường của tinh trùng về sản xuất hay hoạt động chức năng, chiếm từ 35% đến 50% các trường hợp vô sinh. Tinh dịch đồ là một xét nghiệm nhằm đánh giá chất lượng của tinh trùng, thông qua các chỉ số như số lượng, khả năng di động, hình dạng bình thường… mặc dù không cung cấp các thông tin về hoạt động chức năng của tinh trùng, dựa vào kết quả của một tinh dịch đồ, người ta có thể đánh giá một cách khái quát về khả năng sinh sản của nam giới [20], [113]. Đa số các trung tâm trên thế giới và khu vực đều đánh giá tinh dịch đồ dựa theo cẩm nang của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Phiên bản đầu tiên được phát hành vào 1980 và từ 2010 đến nay, hầu hết các trung tâm đều thực hiện theo hướng dẫn của phiên bản thứ năm (WHO, 2010) [113]. Đây là phiên bản hoàn chỉnh nhất hiện nay, thay đổi quy trình và cách diễn giải kết quả, cũng như
10 cách đánh giá theo tiêu chuẩn mới chính xác hơn, nghiêm ngặt hơn để hạn chế sai số tối thiểu và mang lại kết quả tối ưu nhất cho các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (Bảng 1.1). Tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới, ngoài các chỉ số về tinh trùng còn có các trị số về pH tinh dịch. Dịch túi tinh mang tính kiềm, trong khi đó dịch tiền liệt tuyến mang tính axít, sự pha trộn của hai dịch này làm cho độ pH của tinh dịch có tính kiềm (pH = 7,2 - 8). Nếu túi tinh không có, teo hay vô chức năng, hay bế tắc cả hai ống phóng tinh, thể tích tinh dịch sẽ thấp (< 1mL) và pH axit (< 7,0) vì tinh dịch chỉ có dịch tuyến tiền liệt là chính [66], [113]. Trong điều kiện được kiểm soát, chất lượng tinh dịch phụ thuộc các yếu tố thường không thể thay đổi như khả năng sản xuất tinh trùng từ tinh hoàn, dịch tiết từ các tuyến phụ và tình trạng sức khỏe gần thời điểm lấy mẫu (đặc biệt là bệnh sốt cao), cũng như thời gian kiêng xuất tinh. Các điều này cần được ghi nhận khi phân tích kết quả. Bảng 1.1. Giá trị bình thường của tinh dịch đồ [54], [81] Các chỉ số bình thường của WHO, Các chỉ số bình thường của WHO, 2010 1999 - Thể tích tinh dịch: ≥ 1,5ml. - Thể tích tinh dịch ≥ 2 ml. - pH ≥ 7,2. - pH: 7,2 - 8,0. - Mật độ tinh trùng: ≥ 15.106/ml. - Mật độ: ≥ 20.106 TT/ml. - Tổng số tinh trùng: ≥ 39.106/lần xuất tinh. - Độ di động của tinh trùng: A ≥ - Độ di động của tinh trùng: 25%, hoặc A+B ≥ 50%. PR ≥ 32%, hoặc PR + NP ≥ 40%. - Hình dạng bình thường: ≥ 15%. - Hình dạng bình thường: ≥ 4%. - Tỉ lệ sống ≥ 75%. - Tỉ lệ sống: ≥ 58%. 1.3. Sự phân mảnh DNA tinh trùng người
11 1.3.1. Khái niệm về sự phân mảnh DNA tinh trùng Sự phân mảnh DNA tinh trùng là hiện tượng bất ổn trong bộ nhiễm sắc thể của tinh trùng. Các phân tử DNA bị đứt gãy, làm thay đổi tính toàn vẹn của bộ gen. Sự bất thường về bộ gen này gây ra mất khả năng kết hợp giữa tinh trùng và trứng, mất khả năng phân chia tế bào hoặc phôi ngừng phân chia, thoái hoá và chết. Điều này giải thích cho sự giảm khả năng thụ tinh hoặc sảy thai liên tiếp, hoặc sinh con bất thường. Đây là nguyên nhân đặc biệt quan trọng dẫn tới vô sinh nam. Nguyên nhân dẫn tới phân mảnh DNA của tinh trùng có thể bao gồm: - Khiếm khuyết trong thay thế histone bằng protamine trong quá trình biệt hóa. - Hiện tượng chết theo chu trình (Apoptosis). - Hậu quả của việc tiếp xúc với các tác nhân oxy hóa (Reactive oxygen species - ROS) trong quá trình di chuyển trong lòng ống sinh tinh và mào tinh hoàn. Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Denny Sakkas và cộng sự (2010) cũng chỉ ra một số nguyên nhân gây ra sự phân mảnh DNA tinh trùng (Hình 1.4) Hình 1.4. Các cơ chế chính gây tổn thương DNA trong tinh trùng trong quá trình sản xuất hoặc vận chuyển các tế bào tinh trùng [38] ((i) Apoptosis trong quá trình sản sinh tinh trùng; (ii) Sự phá vỡ chuỗi DNA trong quá trình sản sinh tinh trùng; (iii) DNA phân mảnh do ROS ở sau tinh hoàn; (iv) DNA phân mảnh do yếu tố nội sinh và ngoại sinh; (v) DNA phân mảnh do xạ trị và hóa trị; (vi) DNA phân mảnh do ô nhiễm môi trường) 1.3.2. Một số nguyên nhân chính gây tổn thương DNA của tinh trùng * Khiếm khuyết trong thay thế histon bằng protamine trong quá trình biệt hóa Trong quá trình biệt hóa, tinh tử được thay thế protein histon bằng protamine dẫn đến hư hỏng DNA. Trong quá trình này, các chromatin phải biến đổi để nén toàn bộ vật chất di truyền vào đầu tinh trùng. Khi thay đổi các protein cấu trúc và tiến hành cuộn nén, DNA phải chịu một áp lực xoắn rất lớn. Enzyme DNA topoisomerase II giúp DNA tháo xoắn và giảm áp lực này bằng cách cắt mạch DNA tạo các nick tạm thời [76].