Một số yếu tố sinh lý sinh hóa ảnh hưởng tới khả năng tạo màng sinh học chủng nấm men Trichosporon asahii QN-B1 phân hủy phenol phân lập từ Hạ Long, Quảng Ninh

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3se): 106-113<br /> <br /> MỘT SỐ YẾU TỐ SINH LÝ SINH HÓA ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG TẠO<br /> MÀNG SINH HỌC CHỦNG NẤM MEN TRICHOSPORON ASAHII QN-B1 PHÂN<br /> HỦY PHENOL PHÂN LẬP TỪ HẠ LONG, QUẢNG NINH<br /> Lê Thị Nhi Công*, Cung Thị Ngọc Mai, Nghiêm Ngọc Minh<br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *lenhicong@ibt.ac.vn<br /> TÓM TẮT: Từ các mẫu nước ô nhiễm dầu lấy ở vùng ven biển vịnh Hạ Long, Quảng Ninh chúng tôi đã<br /> phân lập được một số chủng nấm men tạo màng sinh học (biofilm) có khả năng phân hủy phenol. Trong<br /> số các chủng đó, chủng QN-B1 có khuẩn lạc tròn, gọn, bề mặt khô cằn, ở giữa có nhân lồi, trắng, đường<br /> kính 3-4mm là chủng có các khả năng ấy tốt hơn các chủng còn lại. Kết quả phân tích trình tự vùng bảo<br /> thủ cho nấm (ITS1-5.8r RNA-ITS2) và kết hợp với các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng B1<br /> được định tên là Trichosporon asahii QN-B1. Chủng đã được đăng ký trên ngân hàng gen với mã số<br /> KC139404. Chủng này có khả năng phân hủy phenol và tạo biofilm tốt ở pH từ 3 đến 7; với nồng độ NaCl<br /> là 1,5% và ở nhiệt độ 30oC, đồng thời chủng có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt ở nồng độ phenol<br /> lên tới 200ppm. Sử dụng các điều kiện cho khả năng tạo màng của chủng, sau 7 ngày nuôi cấy, chủng QNB1 đã phân hủy được 90% phenol, với nồng độ ban đầu là 200 ppm. Các kết quả này đã mở ra khả năng<br /> ứng dụng các chủng nấm men tạo màng sinh học nhằm xử lý các hợp chất gây ô nhiễm môi trường là các<br /> hydrocarbon thơm nói chung và phenol nói riêng.<br /> Từ khóa: Trichosporon asahii, màng sinh học, nấm men, phân hủy sinh học.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Hiện nay, ngành công nghiệp sản xuất<br /> dầu mỏ ngày một phát triển mạnh và đã trở<br /> thành thế mạnh kinh tế đối với những quốc<br /> gia có tiềm năng dầu mỏ, trong đó có Việt<br /> Nam. Tuy nhiên, bên cạnh nguồn lợi về kinh<br /> tế do ngành công nghiệp này mang lại thì còn<br /> có hiểm họa ô nhiễm môi trường mà nguyên<br /> nhân từ những sự cố khai thác, vận chuyển<br /> trên biển và dự trữ dầu mỏ [ 6]. Trong nước<br /> thải nhiễm dầu, phenol là một chất gây ô<br /> nhiễm nghiêm trọng và có nhiều tác động xấu<br /> đến môi trường xung quanh. Phenol là một<br /> hợp chất vòng thơm rất độc hại, khó phân<br /> hủy, gây ra mùi khó chịu, ảnh hưởng lớn đến<br /> sản xuất nông nghiệp, gia tăng bệnh tật và tỷ<br /> lệ người mắc bệnh kể cả ở nồng độ rất thấp,<br /> nó cũng là tác nhân tiềm ẩn gây ung thư và<br /> nhiều bệnh nguy hiểm cho con người [ 3].<br /> Chính vì vậy, việc loại bỏ phenol ra khỏi<br /> nguồn nước là một vấn đề cấp thiết hiện nay.<br /> Việc xử lý phenol theo phương pháp phân<br /> hủy sinh học đã và đang được nhiều nhà khoa<br /> học trên thế giới cũng như trong nước quan<br /> tâm nghiên cứu. Nhờ có các ưu điểm vượt trội<br /> của nó so với các phương pháp hoá lý như: an<br /> toàn với môi trường, đơn giản, xử lý triệt để<br /> 106<br /> <br /> không gây ra hiện tượng ô nhiễm thứ cấp, mà<br /> giá thành lại rẻ. Trong các công nghệ phân<br /> hủy sinh học đó thì công nghệ sử dụng màng<br /> sinh học (biofilm) do các vi sinh vật tạo ra<br /> hiện đang được xem là công nghệ có hiệu quả<br /> xử lý ô nhiễm dầu cao [ 13]. Biofilm là một<br /> tập hợp các vi sinh vật gắn trên một bề mặt của<br /> vật thể rắn hoặc bề mặt chất lỏng, tạo thành lớp<br /> màng bao phủ bề mặt đó. Các vi sinh vật trong<br /> biofilm liên kết với nhau một cách chặt chẽ, tạo<br /> thành một cấu trúc bền vững. Do mật độ các<br /> chủng vi sinh vật trong biofilm cao, hỗ trợ và<br /> liên kết với nhau một cách chặt chẽ nên khả<br /> năng đồng hóa, trao đổi chất, phân hủy các<br /> hydrocarbon sẽ xảy ra nhanh hơn. Theo các<br /> công bố trong những năm gần đây, người ta<br /> thấy rằng một số chủng nấm men tạo biofilm<br /> tốt, chẳng hạn như Candida tropicalis,<br /> Cryptococcus terreus, Rhodotorula creatinivora<br /> và Rhodosporidium toruloides có nhiều tiềm<br /> năng ứng dụng trong xử lý nước ô nhiễm phenol<br /> một cách hiệu quả xử lý cao và an toàn [2, 10].<br /> Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay chưa có nhiều<br /> nghiên cứu về các chủng nấm men tạo màng<br /> sinh học có khả năng phân hủy phenol. Vì vậy,<br /> chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu một số đặc<br /> điểm sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men biển<br /> <br /> Le Thi Nhi Cong, Cung Thi Ngoc Mai, Nghiem Ngoc Minh<br /> <br /> Trichosporon asahii QN-B1.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Vật liệu<br /> 15 mẫu đất và nước bị ô nhiễm dầu lấy<br /> ở các vị trí khác nhau của vịnh Hạ Long,<br /> Quảng Ninh.<br /> Môi trường Hansen: Glucose (30 g/l),<br /> K2HPO4 (3 g/l), NaCl (5 g/l), MgSO4 (2 g/l),<br /> peptone (7 g/l), cao men (1 g/l), thạch (20 g/l),<br /> pH 6; và môi trường muối khoáng cơ bản có bổ<br /> sung các nồng độ phenol khác nhau (50-250<br /> ppm) [16].<br /> Cặp mồi ITS1: 5’-TCC GTA GGT GAA<br /> CCT GCG G-3’; ITS4: 5’-TCC TCC GCT TAT<br /> TGA TAT GC-3’<br /> Phương pháp<br /> Phân lập nấm men; quan sát hình thái khuẩn<br /> lạc và hình thái tế bào<br /> Phương pháp làm giàu 3 lần được dùng để<br /> phân lập các chủng nấm men có khả năng sử<br /> dụng phenol. 5ml hỗn hợp các mẫu nước (hoặc<br /> 1g mẫu đất) được nuôi trong 100 ml môi trường<br /> muối khoáng có bổ sung 1% (v/v) dầu diesel,<br /> 0,5% glucose và 0,1% vitamin, nuôi lắc 5-7<br /> ngày ở 30oC với tốc độ 200 vòng/phút. Sau 5-7<br /> ngày, 10% giống ở lần làm giàu thứ nhất được<br /> chuyển sang bình làm giàu lần thứ hai và lần<br /> thứ ba. Sau lần làm giàu thứ 3, 0,5ml dịch nuôi<br /> cấy được pha loãng tới nồng độ 10-5 trong nước<br /> muối sinh lý 0,85% và cấy gạt trên môi trường<br /> Hansen có bổ sung chất kháng sinh cyclohexamid. Các khuẩn lạc tạo thành được quan sát<br /> hình thái và hình dạng tế bào nấm men theo<br /> phương pháp của Phạm Hương Sơn và nnk.<br /> (1999) [15].<br /> Tạo màng sinh học<br /> Sử dụng phương pháp đánh giá sự hình<br /> thành màng sinh học của Morikawa et al. (2006)<br /> [13]: chủng nuôi cấy non (trong 12-16 giờ)<br /> được đưa vào môi trường đặc hiệu. Sau 2 ngày,<br /> màng sinh học tạo thành sẽ được rửa bằng nước<br /> cất và nhuộm với dung dịch tím tinh thể, rửa lại<br /> bằng DMSO và đo ở bước sóng 570 nm. Các<br /> chủng có giá trị đo độ hấp thụ cao sẽ được lựa<br /> chọn.<br /> Phân loại và định tên nấm men<br /> <br /> Tách chiết DNA tổng số: DNA tổng số của<br /> nấm men được tách chiết theo phương pháp của<br /> Harju và cộng sự (2004) [9]. DNA tổng số sau<br /> khi kiểm tra trên gel agarose 1% thấy đảm bảo<br /> đủ chất lượng và số lượng được sử dụng làm<br /> khuôn để khuếch đại bằng PCR với cặp mồi<br /> ITS1 [16].<br /> Sản phẩm PCR được tinh sạch theo quy<br /> trình hướng dẫn của bộ kit AccuPrep PCR<br /> Purrification Kit (Bioneer, Hàn Quốc) và được<br /> xác định trình tự trên máy đọc tự động tại<br /> Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen,<br /> Viện Công nghệ sinh học. Mức độ tương đồng<br /> của đoạn gene ITS1 của 2 chủng TH1 và TH4<br /> được so sánh với các trình tự của các chủng<br /> nấm men khác trên Gen Bank (NCBI) bằng<br /> công cụ BLAST. Cây phát sinh chủng loại được<br /> xây dựng dựa trên các chương trình Blast,<br /> clustal X và Mega4.<br /> Đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện<br /> sinh lý, sinh hóa lên khả năng tạo màng<br /> Khảo sát các điều kiện: dải pH từ 3 đến 7;<br /> nồng độ NaCl từ 0 đến 2% (w/v) và nhiệt độ từ<br /> 20 đến 50oC, nhằm đánh giá ảnh hưởng của các<br /> điều kiện này lên khả năng tạo màng sinh học<br /> của các chủng lựa chọn.<br /> Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển<br /> của các chủng nấm men trên nguồn cơ chất<br /> phenol<br /> Các chủng nấm men được nuôi lắc trên môi<br /> trường khoáng có bổ sung các nồng độ phenol<br /> khác nhau ở 30oC. Sau 1, 3, 5 và 7 ngày dịch<br /> nuôi cấy được lấy ra và đo ở bước sóng 600nm.<br /> Đánh giá khả năng phân hủy phenol: Theo<br /> Cung Thị Ngọc Mai và nnk. (2010) [7].<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Phân lập các chủng nấm men có khả năng<br /> phân hủy phenol<br /> Từ các mẫu đất và nước bị ô nhiễm dầu lấy<br /> ở các vị trí khác nhau của vịnh Hạ Long, Quảng<br /> Ninh, sau 3 lần làm giàu trên môi trường<br /> khoáng có bổ sung phenol và vitamin, chúng tôi<br /> đã phân lập và tuyển chọn được 3 chủng nấm<br /> men với các đặc điểm hình thái khuẩn lạc được<br /> mô tả trong bảng 1. Các chủng này có khả năng<br /> sinh trưởng và phát triển tốt trên nguồn cơ chất<br /> 107<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3se): 106-113<br /> <br /> phenol với nồng độ là 100 ppm. Phenol và các<br /> dẫn xuất của nó thường được tìm thấy với nồng<br /> độ khá cao trong các mẫu nước ô nhiễm dầu<br /> mỏ. Còn trong các mẫu nước lấy tại các sông hồ<br /> với nồng độ cao, trong nước tự nhiên nồng độ<br /> phenol khoảng 0,01-0,2 ppm, trong nước thải<br /> <br /> của các nhà máy chế biến xăng dầu có thể lên<br /> tới 40 ppm. Trong khi đó, với nồng độ vài ppm<br /> trong nước, phenol đã gây ảnh hưởng rất lớn tới<br /> các sinh vật sống [3]. Do đó, chúng tôi đã sử<br /> dụng 3 chủng nấm men này cho các nghiên cứu<br /> tiếp theo.<br /> <br /> Bảng 1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của ba chủng nấm men được phân lập<br /> STT<br /> <br /> Ký hiệu<br /> <br /> 1<br /> <br /> QN-B1<br /> <br /> Hình thái khuẩn lạc<br /> Khuẩn lạc tròn, gọn, bề mặt khô<br /> cằn, ở giữa có nhân lồi, trắng,<br /> đường kính 3-4 mm<br /> <br /> Khuẩn lạc tròn, gọn, bề mặt hơi<br /> lồi, đỏ cam nhạt, đường kính 1-2<br /> mm<br /> 2<br /> <br /> QN-B2<br /> <br /> Khuẩn lạc tròn, gọn, bề mặt xù xì,<br /> trắng, đường kính 3-5 mm<br /> 3<br /> <br /> QN-B3<br /> <br /> b<br /> <br /> a<br /> <br /> Đối chứng<br /> <br /> QN-B1<br /> <br /> QN-B2 QN-B3<br /> <br /> Hình 1. Khả năng tạo màng sinh học của ba chủng nấm men (K: đối chứng)<br /> a. Màng tạo thành trên các ống eppendorf; b. Kết quả đo giá trị hấp thụ ở bướ sóng 570 nm<br /> của các màng (Kết quả là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm lặp lại).<br /> <br /> 108<br /> <br /> Le Thi Nhi Cong, Cung Thi Ngoc Mai, Nghiem Ngoc Minh<br /> <br /> Sàng lọc các chủng nấm men tạo màng<br /> sinh học<br /> Sử dụng phương pháp nghiên cứu khả năng<br /> tạo biofilm của Morikawa et al. (2006), chúng<br /> tôi đã thu được kết quả trong hình 1. So sánh<br /> các kết quả trên với chủng đối chứng dương<br /> Candida tropicalis VT09 trong nghiên cứu<br /> trước [4], chủng QN-B1 đã được lựa chọn cho<br /> các nghiên cứu tiếp theo.<br /> Phân loại và định tên nấm men<br /> Chủng QN-B1 đã được định danh bằng<br /> phương pháp giải trình tự vùng ITS1-5.8r RNAITS2. Kết quả được tra cứu trên ngân hàng gene<br /> của NCBI thông qua chương trình BLAST và<br /> dựa vào sự tương đồng để định tên đến loài. Kết<br /> quả cho thấy, chủng này có độ tương đồng đến<br /> <br /> 99% so với chủng Trichosporon asahii<br /> AB031520 (hình 2). Kết hợp với các kết quả<br /> sinh lý, sinh hóa của KIT chuẩn sinh hóa API<br /> 20C AUX, chủng QN-B1 được định tên là<br /> Trichosporon asahii QN-B1 và được đăng ký<br /> trên ngân hàng gene với mã số KC139404.<br /> Theo Awe et al. (2009) [1], Trichosporon asahii<br /> được xem là loài có khả năng phân hủy và<br /> chuyển hóa các hợp chất hydrocarbon thơm rất<br /> tốt. Tuy nhiên, cho tới nay chưa có công bố nào<br /> về khả năng tạo biofilm của loài này. Do đó,<br /> chúng tôi đã sử dụng chủng Trichosporon<br /> asahii QN-B1 vừa tạo biofilm tốt vừa có khả<br /> năng phân hủy phenol cao để nghiên cứu một số<br /> điều kiện hóa lý ảnh hưởng tới khả năng tạo<br /> màng của chủng này.<br /> <br /> Hình 2. Cây phát sinh chủng loại của chủng QN-B1<br /> Đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện<br /> sinh lý, sinh hóa lên khả năng tạo màng của<br /> chủng T. asahii QN-B1<br /> Ảnh hưởng của pH<br /> Nấm men thường sinh trưởng tốt trong<br /> khoảng pH môi trường từ axit đến gần trung<br /> tính [15]. Do đó, chúng tôi đã tiến hành khảo sát<br /> ảnh hưởng của pH lên khả năng tạo màng của<br /> chủng T. asahii QN-B1 với dải pH từ 3 đến 8.<br /> Kết quả được trình bày trên hình 3a cho thấy,<br /> chủng QN-B1 tạo biofilm tốt ở ở tất cả các pH<br /> từ 3-7 nhưng ở giá trị pH 8, khả năng tạo màng<br /> đã giảm đi rõ rệt. Đây là phát hiện khá thú vị về<br /> chủng QN-B1, chủng có khả năng sinh trưởng<br /> và tạo biofilm tốt ở phổ pH khá rộng, vì thông<br /> <br /> thường pH thích hợp cho sự sinh trưởng của<br /> nấm men là 5,5.<br /> Ảnh hưởng của nồng độ NaCl<br /> Do chủng T. asahii QN-B1 được phân lập từ<br /> vùng biển Hạ Long, Quảng Ninh, nên việc<br /> nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự<br /> sinh trưởng và tạo màng sinh học của chúng là<br /> một yếu tố rất quan trọng. Trong thí nghiệm,<br /> chúng tôi đã lựa chọn các nồng độ NaCl từ 0<br /> đến 2% (w/v) để nghiên cứu. Kết quả này cho<br /> thấy, chủng này tạo biofilm tốt ở nồng độ NaCl<br /> là 1,5 (hình 3b). Phát hiện này cho phép định<br /> hướng ứng dụng chủng TH4 vào các địa điểm<br /> có các điều kiện từ pH thấp đến trung tính, nồng<br /> độ NaCl cao.<br /> 109<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3se): 106-113<br /> <br /> a<br /> <br /> b<br /> <br /> c<br /> <br /> Hình 3. Ảnh hưởng của một số điều kiện sinh lý, sinh hóa<br /> lên khả năng tạo biofilm của chủng nấm men QN-B1<br /> a. pH; b. nồng độ NaCl; c. nhiệt độ (Kết quả là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm lặp lại)<br /> Ảnh hưởng của nhiệt độ<br /> Tiến hành thí nghiệm với dải nhiệt độ từ 20<br /> đến 50oC, kết quả cho thấy ở nhiệt độ 30oC khả<br /> năng tạo màng của chủng QN-B1 là tốt nhất<br /> (hình 3c).<br /> Khả năng sinh trưởng và phát triển của<br /> chủng T.asahii QN-B1 với các nồng độ<br /> phenol khác nhau<br /> Tiến hành nuôi lắc chủng QN-B1 trên môi<br /> trường muối khoáng Gost (50 ml) có bổ sung<br /> 0,1 % vitamin và phenol với nồng độ khác nhau<br /> lần lượt là 50, 100, 150, 200, 250 ppm. Nuôi lắc<br /> ở 30oC với tốc độ 180 vòng/ phút trong vòng 7<br /> ngày. Các mẫu thử nghiệm được quan sát từng<br /> ngày dựa vào màu sắc môi trường nuôi cấy và<br /> lượng sinh khối tạo ra trong bình. Sau 1, 3, 5, 7<br /> ngày 1 ml dịch nuôi được hút ra và đem đi đo<br /> OD600. Thử nghiệm được lặp lại 3 lần và tiến<br /> hành lập biểu đồ sinh trưởng (hình 4). Kết quả<br /> cho thấy, sau 7 ngày thử nghiệm, ở các nồng độ<br /> từ 50 đến 200 ppm phenol chủng nấm men này<br /> có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt. Tuy<br /> nhiên, khi nâng nồng độ thử nghiệm lên tới 250<br /> ppm phenol, chủng không còn sinh trưởng và<br /> phát triển. Vì vậy, chúng tôi đã sử dụng nồng độ<br /> 110<br /> <br /> 200ppm để nghiên cứu khả năng phân hủy<br /> phenol của chủng QN-B1 ở dạng nuôi tĩnh<br /> biofilm.<br /> Đánh giá khả năng phân hủy phenol<br /> <br /> Hình 4. Khả năng sinh trưởng và phát triển<br /> của chủng QN-B1 với các nồng độ phenol<br /> khác nhau<br /> Tiến hành thử nghiệm khả năng phân hủy<br /> phenol 200 ppm đối với chủng T. asahii QN-B1<br /> ở điều kiện nuôi tĩnh tạo biofilm và dạng nuôi<br /> lắc. Sau 7 ngày, chúng tôi nhận thấy, ở mẫu thử<br /> <br />