Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dung dịch đệm và nồng độ sudan B đối với phản ứng nhuộm lipid bạch cầu người

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA pH DUNG DỊCH ĐỆM<br /> VÀ NỒNG ĐỘ SUDAN B ĐỐI VỚI PHẢN ỨNG<br /> NHUỘM LIPID BẠCH CẦU NGƢỜI<br /> Trần Văn Tính*<br /> TÓM TẮT<br /> Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình nhuộm màu lipid bạch cầu người bằng sudan B. Quy hoạch<br /> hóa thực nghiệm theo mô hình mặt hai nhân tố: pH (X 1) và nồng độ sudan B (X2); hàm mục tiêu<br /> là điểm nhuộm lipid (Y) bằng phần mềm Modde 5.0. Phương trình hồi quy thu được: Y = 362,7<br /> 2<br /> 2<br /> + 5,2 x X1 -10.5 x X2 - 26,3 x X1 (R = 0,985 với p > 0,95) và điều kiện nhuộm tối ưu: Nồng độ<br /> sudan B là 0,20% pha trong dung dịch đệm với pH = 7,42. Hiệu suất nhuộm tốt nhất trong điều<br /> kiện tối ưu tìm được 95,10 ± 1,0% (p = 0,95).<br /> * Từ khóa: Nhuộm hóa học tế bào; Nhuộm sudan B; Nhuộm lipid.<br /> <br /> EFFECT OF pH AND B SUDAN SOLUTION ON<br /> LIPID STRAINING OF HUMAN LEUKOCYTE<br /> SUMMARY<br /> <br /> 60<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br /> A research was conducted on the optimal conditions for the lipid of human leukocyte with sudan<br /> B solution. Experiments were designed by response surface modeling with two factors: pH (X 1)<br /> and sudan B concentrate (X2) to target lipid score function; Regression equation presents dependence<br /> 2<br /> of lipid score on two factors quoted above as: Y = 362.7 + 5.2 x X1 -10.5 x X2 - 26.3 x X12 (R = 0.985<br /> with p > 0.95) and the optimal conditions of the lipid staining as: pH = 7.42, sudan B 0,20%.<br /> The best efficiency of the lipid staining in the above optimal conditions is found to be 95.10 ± 1.0%<br /> (p = 0.95).<br /> * Key words: Cytochemistry; Sudan B staining; Lipid staining.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Lipid có trong tế bào bạch cầu người là<br /> este của axít béo với ancol. Xác định các<br /> lipid này bằng phản ứng màu với nhiều<br /> loại phẩm màu: dầu đỏ, scharlach R,<br /> rodamin B, nile blue, sudan... Cơ chế của<br /> <br /> phản ứng màu rất khác nhau, bao gồm<br /> khuếch tán vật lý đơn thuần hoặc liên<br /> kết hóa học trực tiếp. Trong các loại<br /> thuốc nhuộm, sudan là một nhóm phẩm<br /> nhuộm được ưa chuộng để nhuộm lipid<br /> từ vàng (sudan III) đến đen (sudan B) [3].<br /> <br /> * Bệnh viện 19-8<br /> Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Tính (tranvantinh@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 17/06/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 28/07/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 11/08/2014<br /> <br /> Đối với máu ngoại vi, phản ứng nhuộm<br /> sudan B cho kết quả bạch cầu hạt dương<br /> tính mạnh, monoxit dương tính yếu,<br /> lymphoxit và hồng cầu âm tính. Trong tủy<br /> xương bình thường, các tế bào dòng tủy<br /> dương tính từ tiền tủy bào đến tế bào<br /> trưởng thành, dòng monoxit chỉ dương<br /> tính ở tế bào trưởng thành; mẫu tiểu cầu<br /> và tiểu cầu dương tính ở các giai đoạn.<br /> Trong nhiều trường hợp mắc bệnh bạch<br /> cầu cấp, có thể phân biệt tương đối rõ<br /> dòng tủy và những dòng tế bào khác bằng<br /> kết quả nhuộm sudan B. Kết quả dương<br /> tính sudan B của mẫu bệnh phẩm thường<br /> cho kết quả dương tính với kỹ thuật nhuộm<br /> peroxydase. Chính vì vậy, kết quả nhuộm<br /> sudan B là một trong những tiêu chuẩn<br /> được ứng dụng để phân loại thể bệnh<br /> <br /> 61<br /> <br /> trong bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn<br /> FAB [2].<br /> Chayen (1968) cho rằng, mức độ bắt<br /> màu chọn lọc của các thuốc nhuộm đối<br /> với lipid phụ thuộc rất nhiều vào bản chất<br /> lipid và đặc tính của thuốc nhuộm, thuốc<br /> điều trị, hormon và điều kiện tiến hành<br /> nhuộm [3]. Phản ứng nhuộm sudan B nói<br /> riêng và nhuộm lipid nói chung có thể cho<br /> kết quả tương đối khác nhau trong từng<br /> điều kiện cụ thể. Vì vậy, việc nghiên cứu<br /> tìm ra điều kiện tối ưu để tiến hành phản<br /> ứng, nhằm đảm bảo tính ổn định về mặt<br /> kỹ thuật, nâng cao chất lượng nhuộm và<br /> giảm chi phí là vấn đề có ý nghĩa khoa học<br /> và thực tiễn cần thiết. Mục tiêu của công<br /> trình này: Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình<br /> nhuộm lipid tế bào bạch cầu người bằng<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br /> <br /> phẩm màu sudan B dùng trong xét nghiệm<br /> để phân loại dòng tế bào ung thư máu.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng, dụng cụ và hóa chất<br /> nghiên cứu.<br /> * Đối tượng nghiên cứu: bạch cầu lấy<br /> từ máu của người khoẻ mạnh có chứa<br /> lipid. Máu sau khi lấy từ tĩnh mạch, tiến<br /> hành dàn 14 tiêu bản không qua chống<br /> đông, để khô trong điều kiện tự nhiên và<br /> cố định ngay.<br /> * Dụng cụ: máy ủ nhiệt CW-20G 0 - 500C,<br /> độ chính xác ± 0,10C, máy đo pH inoLab<br /> 730 với độ chính xác đến 10-3, cân phân<br /> tích Sartorius TE214S có độ chính xác 10-4,<br /> kính hiển vi Nikon với độ phóng đại 1.000<br /> lần, pipet tự động của Hãng Thermo kèm<br /> đầu côn 0,2, 1,0 và 10 ml của Hãng Gilson.<br /> * Hóa chất: sudan B (Hãng SigmaAldrich); phenol (Hãng Sigma-Aldrich);<br /> axít citric 99,5% (Hãng Sigma-Aldrich);<br /> formaldehyd 37% ACS 99,5% (Hãng<br /> Sigma-Aldrich); ethanol 96% (Hãng<br /> Sigma-Aldrich); aceton ACS 99,5% (Hãng<br /> Sigma-Aldrich); Na2HPO4 (Hãng SigmaAldrich); Giemsa (Hãng Sigma-Aldrich).<br /> - Pha chế thuốc thử:<br /> + Dung dịch cố định tiêu bản:<br /> ++ Dung dịch citrat: 25 ml (lấy từ dung<br /> dịch 18 mmol axÝt citric + 9 mmol natri citrat<br /> và 12 mmol NaCl trong 1 lít).<br /> <br /> Na2HPO4 0,3% điều chỉnh pH bằng HCl<br /> 0,1 M.<br /> + Dung dịch nhuộm sudan pha theo<br /> bảng 1 trong ethanol 96% và đệm phenolphosphat ở trên theo tỷ lệ 6:4.<br /> + Dung dịch nhuộm nhân: Giemsa.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Thiết kế thực nghiệm:<br /> Thí nghiệm được thiết kế theo mô hình<br /> khảo sát mặt mục tiêu (Response Surface<br /> Modeling - RSM) cụ thể: tổ hợp mặt tâm<br /> (The Central Composite Face - CCF) 2<br /> nhân tố trên phần mềm MOD5. Mỗi nhân<br /> tố gồm 3 mức: ở tâm (d = 0), ở đỉnh (1)<br /> và ở mặt (d). Mô hình gồm 11 thí nghiệm:<br /> 4 thí nghiệm ở đỉnh, 4 thí nghiệm điểm<br /> sao nằm ở mặt không gian mỗi nhân tố<br /> và 3 thí nghiệm lặp ở tâm. Thiết kế quy<br /> hoạch hóa thực nghiệm gồm 2 biến là pH<br /> dung dịch đệm (X1) và nồng độ sudan B<br /> theo g/100 ml (X2). Ảnh hưởng của hai<br /> nhân tố này lên hàm mục tiêu (Y) là điểm<br /> nhuộm tuân theo phương trình:<br /> 2<br /> <br /> 2<br /> <br /> Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b1(X1) + b2(X2) + b12X1X2<br /> <br /> Các điều kiện mã hóa để nhập dữ liệu<br /> vào chương trình phần mềm (bảng 1):<br /> Bảng 1: Ký hiệu và mức mã hóa thực<br /> nghiệm.<br /> <br /> -1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 1<br /> <br /> pH dung dịch đệm<br /> <br /> X1<br /> <br /> 7,2<br /> <br /> 7,4<br /> <br /> 7,6<br /> <br /> Sudan B (%)<br /> <br /> X2<br /> <br /> 0,2<br /> <br /> 0,3<br /> <br /> 0,4<br /> <br /> ++ Acetone 99,5%: 65 ml.<br /> ++ Focmaldehyd 37%: 8 ml.<br /> + Dung dịch đệm phenol-phosphat với<br /> pH được pha theo bảng 1: phenol 16% và<br /> <br /> 62<br /> <br /> * Kỹ thuật tiến hành nhuộm:<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br /> <br /> - Cố định tiêu bản trong dung dịch cố<br /> định tiêu bản ở trên với thời gian 30 giây.<br /> Sau đó, gói và đưa các tiêu bản vào hộp<br /> chống ẩm bảo quản ở nhiệt độ 4 - 80C<br /> (thời gian bảo quản có thể kéo dài 2 tháng<br /> [8]).<br /> - Nhúng tiêu bản vào dung dịch nhuộm<br /> sudan ở trên với nồng độ và pH khác nhau<br /> theo quy hoạch thực nghiệm ở bảng 1 trong<br /> 30 phút. Sau đó, rửa tiêu bản dưới vòi<br /> nước 5 phút, để khô.<br /> - Nhuộm nền bằng dung dịch Giemsa<br /> 10% trong 15 phút và để khô.<br /> - Đọc tiêu bản dưới vật kính dầu với độ<br /> phóng đại 1.000 lần.<br /> <br /> Đánh giá bạch cầu trung tính dương tính<br /> thành 5 mức độ:<br /> Độ 0: không có hạt bắt màu đen.<br /> Độ 1: ít hạt trên nguyên sinh chất, hạt<br /> mịn nhỏ, không có hạt trên nhân tế bào.<br /> Độ 2: nhiều hạt to trên nguyên sinh chất,<br /> không có hạt trên nhân tế bào.<br /> Độ 3: nhiều hạt to trên toàn bộ tế bào,<br /> nền xấu.<br /> Độ 4: nhiều hạt to trên toàn bộ tế bào,<br /> nền đẹp.<br /> Công thức tính điểm nhuộm: ∑Y (điểm) =<br /> Y0 x 0 + Y1 x 1 + Y2 x 2 + Y3 x 3 + Y4 x 4.<br /> Như vậy, phản ứng nhuộm sẽ đạt tối<br /> ưu khi toàn bộ tế bào bạch cầu trung tính<br /> dương tính ở độ 4, tổng điểm tối đa 400<br /> và hiệu suất đạt 100%.<br /> <br /> Các vùng có chứa lipid trong nguyên<br /> sinh chất bạch cầu sẽ xuất hiện hạt bắt<br /> màu đen. Đối với dòng tủy tế bào càng<br /> trưởng thành, mức độ dương tính càng<br /> mạnh. Đối với dòng lympho bình thường<br /> âm tính.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Bảng 2: Kết quả thực nghiệm nhuộm sudan theo theo mô hình khảo sát mặt mục tiêu.<br /> <br /> 63<br /> <br /> X1<br /> <br /> X2<br /> <br /> X1<br /> <br /> X2<br /> <br /> 8<br /> <br /> -1<br /> <br /> -1<br /> <br /> 7.2<br /> <br /> 0.2<br /> <br /> 342<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1<br /> <br /> -1<br /> <br /> 7.6<br /> <br /> 0.2<br /> <br /> 355<br /> <br /> 2<br /> <br /> -1<br /> <br /> 1<br /> <br /> 7.2<br /> <br /> 0.4<br /> <br /> 322<br /> <br /> 7<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1<br /> <br /> 7.6<br /> <br /> 0.4<br /> <br /> 335<br /> <br /> 6<br /> <br /> -1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 7.2<br /> <br /> 0.3<br /> <br /> 335<br /> <br /> 11<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 7.6<br /> <br /> 0.3<br /> <br /> 340<br /> <br /> 10<br /> <br /> 0<br /> <br /> -1<br /> <br /> 7.4<br /> <br /> 0.2<br /> <br /> 378<br /> <br /> 9<br /> <br /> 0<br /> <br /> 1<br /> <br /> 7.4<br /> <br /> 0.4<br /> <br /> 355<br /> <br /> 3<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 7.4<br /> <br /> 0.3<br /> <br /> 360<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 7.4<br /> <br /> 0.3<br /> <br /> 362<br /> <br /> 5<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 7.4<br /> <br /> 0.3<br /> <br /> 364<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br /> <br /> Nhập kết quả vào phần mềm Modde 5.0 qua xử lý, được phương trình hồi quy:<br /> Y = 362,7 + 5,2 x X1 -10.5 x X2 - 26,3 x X12 + 2,7 x X22 -5.53x10-6 x X1 x X2.<br /> * Độ tin cậy thống kê của các biến số:<br /> Bảng 3: Hệ số và độ tin cậy thống kê của các hệ số.<br /> ±<br /> <br /> p<br /> <br /> Constant<br /> <br /> 362,737<br /> <br /> 1,45222<br /> <br /> 1,95E-11<br /> <br /> 3,73306<br /> <br /> X1<br /> <br /> 5,16673<br /> <br /> 1,15571<br /> <br /> 0,006576<br /> <br /> 2,97085<br /> <br /> X2<br /> <br /> -10,5<br /> <br /> 1,15571<br /> <br /> 0,00027<br /> <br /> 2,97085<br /> <br /> X1*X1<br /> <br /> -26,3421<br /> <br /> 1,7786<br /> <br /> 2,54E-05<br /> <br /> 4,57205<br /> <br /> X2*X2<br /> <br /> 2,65793<br /> <br /> 1,7786<br /> <br /> 0,195304<br /> <br /> 4,57205<br /> <br /> X1*X2<br /> <br /> -3,15E-05<br /> <br /> 1,41545<br /> <br /> 1<br /> <br /> 3,63854<br /> <br /> N = 11<br /> <br /> 2<br /> <br /> Q =<br /> <br /> 0,878<br /> <br /> Cond. no. =<br /> <br /> 3,0822<br /> <br /> DF = 5<br /> <br /> 2<br /> <br /> 0,985<br /> <br /> Y-miss =<br /> <br /> 0<br /> <br /> R Adj. =<br /> <br /> 0,97<br /> <br /> RSD =<br /> <br /> 2,8309<br /> <br /> Conf. lev. =<br /> <br /> 0,95<br /> <br /> R =<br /> 2<br /> <br /> Như vậy, loại bỏ hệ số X22 và X1 x X2 phương trình hồi quy là: Y = 362,7 + 5,2 x X 1 10,5 x X2 - 26,3 x X12. Phân tích Anova cho thấy phương trình mô tả tương đối tốt kết<br /> quả thực nghiệm (hệ số tương quan R2 = 0,985 (p > 0,95)).<br /> Chạy chương trình tối ưu thu được điều kiện tối ưu với pH = 7,419 và nồng độ sudan<br /> là 0,20 g%, khi đó dự đoán điểm nhuộm đạt 376,1. Kết quả tối ưu hóa được trình bày ở<br /> bảng 4 và hình 1, hình 2.<br /> <br /> 64<br /> <br />