Nghiên cứu biến đổi siêu cấu trúc phôi người nuôi cấy ngày 5 trước đông lạnh và sau rã đông bằng kỹ thuật thủy tinh hóa

t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018<br /> <br /> NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SIÊU CẤU TRÚC PHÔI NGƯỜI<br /> NUÔI CẤY NGÀY 5 TRƯỚC ĐÔNG LẠNH VÀ<br /> SAU RÃ ĐÔNG BẰNG KỸ THUẬT THỦY TINH HÓA<br /> Đoàn Thị Hằng*; Quản Hoàng Lâm*; Nguyễn Thanh Tùng* và CS<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá sự thay đổi hình thái siêu cấu trúc phôi người dưới kính hiển vi điện tử<br /> truyền qua. Đối tượng và phương pháp: nghiên cứu mô tả trên 20 phôi người nuôi cấy ngày 5<br /> (10 phôi tươi và 10 phôi sau rã đông). Kết quả: dưới kính hiển vi điện tử, màng trong suốt của<br /> phôi bị biến đổi mất độ xốp, không quan sát rõ các sợi glycoprotein. Những phôi bào sống sau<br /> rã đông ít bị tổn thương, trong bào tương có một số điểm thoái hóa hạt hoặc xuất hiện không bào.<br /> Những phôi bào thoái hóa sau rã đông thấy màng tế bào bị co rúm, ty thể bị biến dạng, lưới nội<br /> bào giãn rộng, màng nhân co rúm. Kết luận: những phôi sống sau rã đông rất ít bị tổn thương.<br /> * Từ khóa: Phôi người; Hình thái siêu cấu trúc; Kỹ thuật thủy tinh hóa.<br /> <br /> Transformation of Morphological Ultrastructure of Day-Five Human<br /> Embryos before Freezing and after Vitrification Technique<br /> Summary<br /> Objectives: To assess the transformation of human embryological morphological ultrastructure<br /> in post-thawing stage under transmission electron microscope (TEM). Subject and methods:<br /> The descriptive study was performed on 20 human embryos in day 5 (10 fresh and 10 thawing<br /> embryos). Results: Under electron microscope, the zona pellucida of embryos is transformed<br /> and loses its porosity; glycoprotein fibers are not clearly visible. Embryos that survived after<br /> thawing show little damage; there are some particle degeneration and vacuoles appearance at<br /> some points in the cytoplasmic. The degenerative post-thawing embryos show deformed cell<br /> membrane and mitochondria, expanded endoplasmic reticulum, and shrunk nuclear membrane.<br /> Conclusions: Embryos that survived after thawing show little damage.<br /> * Keywords: Human embryo; Morphological ultrastructure; Vitrification technique.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Thụ tinh trong ống nghiệm gồm quá<br /> trình kích thích buồng trứng, thụ tinh và<br /> nuôi cấy phôi. Tuy nhiên, quá trình chuyển<br /> phôi tươi đôi khi không thực hiện được do<br /> niêm mạc tử cung chưa phù hợp, hội chứng<br /> <br /> quá kích buồng trứng hoặc không chuyển<br /> được phôi vào tử cung, đặc biệt khi số<br /> lượng phôi dư thừa đều là những lý do<br /> phải thực hiện phương pháp đông lạnh<br /> phôi. Do vậy, đông lạnh phôi là kỹ thuật<br /> không thể thiếu ở một trung tâm hỗ trợ<br /> sinh sản.<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Đoàn Thị Hằng (hangdt166@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 10/02/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 14/03/2018<br /> Ngày bài báo được đăng: 26/03/2018<br /> <br /> 13<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018<br /> Hiện nay, đông lạnh phôi bằng kỹ thuật<br /> thuỷ tinh hoá đang được áp dụng rộng rãi<br /> ở nhiều trung tâm trên thế giới cũng như<br /> ở Việt Nam trong bảo quản phôi người.<br /> Tuy nhiên, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu<br /> sâu về cấu trúc, siêu cấu trúc của phôi<br /> trước và sau rã đông bằng kỹ thuật thuỷ<br /> tinh hoá. Các nghiên cứu siêu cấu trúc này<br /> giúp đánh giá rất chính xác tổn thương<br /> phôi ở mức độ dưới tế bào sau quá trình<br /> rã đông, đồng thời giúp xác định hiệu quả<br /> của phương pháp đông lạnh bằng kỹ<br /> thuật thuỷ tinh hoá. Do đó, chúng tôi tiến<br /> hành nghiên cứu đề tài này với mục tiêu:<br /> Đánh giá siêu cấu trúc phôi người nuôi<br /> cấy ngày 5 trước đông lạnh và sau rã đông<br /> bằng kính hiển vi điện tử truyền qua.<br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU.<br /> 1. Đối tượng nghiên cứu.<br /> <br /> + Kỹ thuật làm tiêu bản cho kính hiển<br /> vi điện tử truyền qua: tiến hành làm tiêu<br /> bản cho kính hiển vi điện tử truyền qua<br /> theo phương pháp của Hayat M.A (1989)<br /> và Nguyễn Kim Giao (2004) [1, 7].<br /> Đọc tiêu bản trên kính hiển vị điện tử<br /> truyền qua JEOL - 1011 có độ phân giải 2A°,<br /> điện áp 100 KV, tại Labo Kính hiển vi điện<br /> tử - Bộ môn Mô Phôi, Học viện Quân y.<br /> - Tiêu chí đánh giá hình thái siêu cấu<br /> trúc phôi trên kính hiển vi điện tử quét và<br /> kính hiển vi điện tử truyền qua:<br /> + Mô tả thay đổi cấu trúc màng trong<br /> suốt của phôi trước đông lạnh và sau rã<br /> đông trên kính hiển vi điện tử truyền qua.<br /> + Mô tả thay đổi cấu trúc của màng tế<br /> bào, các bảo quan trong bào tương, nhân<br /> tế bào của phôi trước đông lạnh và sau rã<br /> đông trên kính hiển vi điện tử truyền qua.<br /> <br /> 20 phôi (được sự đồng ý của bệnh<br /> nhân [BN]). 10 phôi tươi của BN có phôi<br /> tươi dư thừa nhưng không có nguyện vọng<br /> lưu trữ phôi, 10 phôi sau rã đông của BN<br /> có phôi lưu trữ, nhưng đã có đủ số con,<br /> tự nguyện hiến phôi cho nghiên cứu.<br /> Tất cả phôi đều được đánh giá và lựa 3<br /> chọn theo thang điểm của K.Gardner với<br /> 2<br /> tiêu chuẩn sau:<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Siêu cấu trúc phôi tươi.<br /> <br /> 1<br /> <br /> * Tiêu chuẩn lựa chọn: phôi ngày 5 có<br /> điểm đánh giá AA, AB, BA, BB.<br /> * Tiêu chuẩn loại trừ: phôi ngày 5 có<br /> điểm đánh giá C.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Các kỹ thuật nghiên cứu:<br /> - Kỹ thuật đông phôi:<br /> + Quy trình đông lạnh phôi bằng kỹ thuật<br /> thủy tinh hóa: sử dụng quy trình đông lạnh<br /> cực nhanh theo phương pháp Cryotop của<br /> Masashige Kuwayama (2005) [8].<br /> 14<br /> <br /> Ảnh 1: Màng trong suốt của phôi tươi<br /> ngày 5 (TEM - 10.000X).<br /> (1: Ranh giới màng ZP; 2: Glycoprotein<br /> dạng sợi; 3: Protein dạng hạt)<br /> Quan sát ở độ phóng đại lớn (10.000X)<br /> thấy màng trong suốt của phôi tươi ngày 5,<br /> có thể nhìn rất rõ glycoprotein dạng sợi<br /> và hướng của các sợi này.<br /> <br /> t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018<br /> <br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 1<br /> 5<br /> <br /> Ảnh 2: Tế bào nụ phôi của phôi tươi ngày 5 (TEM - 4.000X).<br /> (1: Màng nhân; 2: Nhân tế bào; 3: Ty thể; 4: Lưới nội chất; 5: Hạt glycogen)<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> 5<br /> <br /> Ảnh 3: Tế bào lá nuôi phôi tươi ngày 5 (TEM - 4.000X).<br /> (1: Nhân tế bào; 2: Hạt nhân; 3: Ty thể; 4: Lưới nội chất có hạt; 5: Hạt glycogen)<br /> Quan sát hình ảnh tế bào trong phôi và tế bào lá nuôi phôi của phôi tươi ngày 5 ở<br /> độ phóng đại 4000X thấy tế bào có màng, bào tương, nhân và hạt nhân rõ, trong bào<br /> tương thấy các bào quan như ty thể, lưới nội chất, hạt glycogen.<br /> 15<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018<br /> 2. Siêu cấu trúc phôi sống sau rã đông.<br /> <br /> 1<br /> 3<br /> <br /> 2<br /> <br /> Ảnh 4: Màng trong suốt của phôi ngày 5 sau rã đông (TEM - 10.000X).<br /> (1: Ranh giới màng ZP; 2: Glycoprotein dạng sợi; 3: Protein dạng hạt)<br /> Quan sát màng trong suốt của phôi ngày 5 sau rã đông ở độ phóng đại 10.000X<br /> thấy màng trong suốt giảm mật độ điện tử hơn so với trước đông lạnh, không quan sát<br /> thấy rõ các glycoprotein dạng sợi như phôi trước đông lạnh.<br /> <br /> 2<br /> 1<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> 5<br /> <br /> Ảnh 5: Tế bào nụ phôi của phôi ngày 5 sau rã đông (TEM - 2.000X).<br /> (1: Màng nhân; 2: Nhân tế bào; 3: Ty thể; 4: Lưới nội chất; 5: Không bào)<br /> 16<br /> <br /> t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> 5<br /> <br /> Ảnh 6: Tế bào lá nuôi của phôi ngày 5 sau rã đông (TEM - 5.000X)<br /> (1: Nhân tế bào; 2: Lưới nội chất; 3: Ty thể; 4: Hạt glycogen; 5: Màng trong suốt)<br /> Quan sát tế bào lá nuôi phôi và tế bào nụ phôi ngày 5 sống sau rã đông ở độ phóng<br /> đại 1500X thấy tế bào đều có màng, bào tương, nhân, hạt nhân rõ ràng, màng nhân và<br /> màng tế bào không thay đổi, trong bào tương có đầy đủ các bào quan như ty thể, lưới<br /> nội chất… giống như phôi trước đông. Tuy nhiên, một số phôi bào xuất hiện không bào<br /> trong bào tương.<br /> 3. Siêu cấu trúc phôi thoái hóa sau rã đông.<br /> 3<br /> <br /> 1<br /> <br /> 4<br /> <br /> 2<br /> <br /> Ảnh 7: Phôi ngày 5 thoái hóa sau rã đông (TEM - 8.000X).<br /> (1: Màng nhân đứt gãy; 2: Hạt nhân; 3: Ty thể; 4: Lưới nội chất)<br /> Phôi ngày 5 thoái hóa sau rã đông quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua<br /> thấy màng nhân tế bào bị nhăn nhúm, có chỗ đứt gãy, nhiều nếp gấp, ty thể biến dạng,<br /> chất nền sáng, không quan sát thấy mào ty thể, các lưới nội chất có hạt giãn rộng.<br /> 17<br /> <br />