Nghiên cứu chế tạo và tinh sạch kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ TINH SẠCH KHÁNG THỂ<br /> KHÁNG NỌC RẮN HỔ MANG Naja atra<br /> Nguyễn Ngọc Tuấn*; Trịnh Thanh Hùng**<br /> Đặng Hồng Thanh***; Nguyễn Đặng Dũng*<br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: nhiễm độc nọc rắn nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong hoặc<br /> để lại di chứng nặng nề, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của nạn nhân. Biện pháp<br /> điều trị hiệu quả nhất cho bệnh nhân (BN) bị nhiễm độc nọc rắn là huyết thanh kháng nọc rắn<br /> (HTKNR) đặc hiệu; tuy nhiên, trước hết cần xác định được loài rắn độc gây ra tai nạn rắn cắn.<br /> Vật liệu và phương pháp: chế tạo và tinh sạch 3 kháng thể đặc hiệu nọc rắn hổ mang miền Bắc<br /> N. atra nhằm sử dụng làm nguyên liệu phát triển xét nghiệm miễn dịch phát hiện nọc rắn N. atra.<br /> Kết quả: đã chế tạo và tinh sạch thành công 2 kháng thể đặc hiệu với nọc rắn hổ mang N. atra<br /> từ huyết thanh thỏ và từ l ng đỏ trứng gà được gây miễn dịch (tại Bộ môn Miễn dịch, Học viện<br /> Quân y) và tinh sạch 1 kháng thể từ huyết thanh ngựa được gây miễn dịch (do Đài Loan cung cấp).<br /> Kết luận: có thể sử dụng các kháng thể sau tinh sạch để phát triển bộ xét nghiệm miễn dịch<br /> phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang N. atra.<br /> * Từ khoá: Nọc rắn; Naja atra; Kháng thể.<br /> <br /> Study on Production and Purification of Antibodies Specific to<br /> Naja Atra Snake Venom<br /> Summary<br /> Introduction: Snake envenomation, if not promptly treated, may lead to death or severe<br /> complications in the snakebite victims. One of the most effective therapies for snakebite victims<br /> relies on administration of specific antivenin, once the causal snake species is identified.<br /> Current methods of choice for snake venom identification include immunoassay, which needs<br /> venom-specific antibodies for its development. Materials and methods: 3 antibodies specific to<br /> Naja atra venom antigen were isolated and purified by conventional methods. Results: We have<br /> successfully produced and purified 3 antidobies specific to N. atra venom, 2 of which were<br /> created by ourselves (at Vietnam Military Medical University) and the other was kindly provided<br /> by Center for Toxicology, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan. Conclusions:<br /> These 3 antibodies can be utilized as materials for development of rapid immunoassays for<br /> N. atra snake venom detection.<br /> * Key words: Snake venom; Naja atra; Antibody.<br /> * Học viện Quân y<br /> ** Bộ Khoa học và Công nghệ<br /> *** Viện Y học Phòng không - Không quân<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Ngọc Tuấn (nguyenngoctuanmd@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 28/10/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 24/12/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 29/12/2015<br /> <br /> 77<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Rắn độc cắn là một trong những tai<br /> nạn nguy hiểm thường gặp đối với nông<br /> dân, công nhân lâm trường và bộ đội hoạt<br /> động dã ngoại. Nhiễm độc nọc rắn nếu<br /> không được điều trị kịp thời có thể dẫn<br /> đến tử vong hoặc để lại di chứng nặng<br /> nề, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc<br /> sống của nạn nhân sau khi sống sót.<br /> Xác định chính xác nọc độc của loài rắn<br /> gây tai nạn trong cơ thể nạn nhân rắn cắn<br /> có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, vừa<br /> giúp sơ cấp cứu đúng cách, vừa định<br /> hướng lựa chọn đúng loại HTKNR đơn<br /> đặc hiệu để sử dụng, đem lại hiệu quả<br /> điều trị cao và an toàn hơn cho nạn nhân<br /> [1, 3, 4]. Theo WHO, thuốc điều trị hiệu<br /> quả nhất cho BN bị nhiễm độc nọc rắn là<br /> HTKNR [7, 8]. Tuy nhiên, để lựa chọn<br /> HTKNR đặc hiệu, trước tiên cần xác định<br /> loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn. Tại<br /> miền Bắc, rắn hổ mang N. atra là một<br /> trong số các loài rắn có tần suất gây tai<br /> nạn rắn độc cắn và tỷ lệ tử vong do rắn<br /> cắn tương đối cao. Đến nay, tại Việt Nam<br /> chưa có báo cáo về việc phát triển kít<br /> phát hiện nọc rắn hổ mang N. atra cho<br /> chẩn đoán loài rắn gây tai nạn rắn cắn.<br /> Nhờ tính đặc hiệu của phản ứng kết<br /> hợp kháng nguyên - kháng thể, các phản<br /> ứng miễn dịch được coi là những kỹ thuật<br /> tốt nhất được sử dụng để phát hiện nọc<br /> độc [7]. Nổi bật trong các kỹ thuật miễn<br /> dịch chính là xét nghiệm dựa trên nguyên<br /> lý sắc ký miễn dịch. Tuy nhiên, để phát<br /> triển được bộ xét nghiệm miễn dịch phát<br /> hiện nọc rắn độc dựa trên nguyên lý sắc<br /> 78<br /> <br /> ký miễn dịch cần có ít nhất 2 kháng thể<br /> từ 2 loài khác nhau có hiệu giá cao và<br /> đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn. Xuất<br /> phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành<br /> nghiên cứu chế tạo kháng thể (IgG, IgY)<br /> và tinh sạch kháng thể sẵn có đặc hiệu<br /> với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N. atra,<br /> có thể sử dụng để phát triển bộ xét<br /> nghiệm miễn dịch phát hiện nọc rắn hổ<br /> mang N. atra.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu.<br /> * Đối tượng nghiên cứu:<br /> - Động vật thí nghiệm: thỏ đực 12 con,<br /> cân nặng 2 - 2,5 kg chia làm 4 lô; gà mái<br /> trong độ tuổi đẻ trứng 12 con, cân nặng<br /> 1,5 - 2 kg chia làm 4 lô; động vật thí nghiệm<br /> được Ban Cung cấp Động vật thí nghiệm,<br /> Học viện Quân y cung cấp và nuôi trong<br /> điều kiện đủ thức ăn, nước uống trong<br /> suốt quá trình tiến hành thí nghiệm.<br /> - Huyết thanh ngựa trước và sau khi<br /> gây miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn<br /> hổ mang N. atra do Trung tâm Độc chất,<br /> Bệnh viện Đại học Y Trung Hoa, Đài Loan<br /> cung cấp (theo Đề tài hợp tác khoa học<br /> Nghị định thư giữa Việt Nam và Đài Loan).<br /> * Vật liệu nghiên cứu:<br /> Nọc tổng số của rắn hổ mang N. atra<br /> do Trại rắn Vĩnh Sơn, Vĩnh Phúc cung<br /> cấp, số lượng 1 g; nọc tổng số của 4 loài<br /> rắn độc khác (Hổ đất, Lục xanh, Chàm<br /> quạp và Hổ chúa) do Trung tâm Nuôi<br /> trồng và Bảo tồn Dược liệu Quân khu 9<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016<br /> <br /> (Trại rắn Đồng Tâm) cung cấp, số lượng<br /> mỗi loại 100 mg. Nọc rắn được thu thập<br /> bằng phương pháp kích thích cơ học<br /> tuyến nọc cho rắn tiết nọc vào cốc sạch<br /> (theo quy trình của WHO [9]), tạo hỗn<br /> hợp nọc của ít nhất 30 cá thể rắn mỗi<br /> loài, không phân biệt giới, có độ tuổi và<br /> kích thước khác nhau nhằm bảo đảm tính<br /> đại diện loài.<br /> Tá chất Freund hoàn chỉnh và Freund<br /> không hoàn chỉnh, kháng thể đơn clon<br /> kháng IgG thỏ đánh dấu enzym peroxidase,<br /> kháng thể đơn clon kháng IgY gà đánh<br /> dấu enzym peroxidase và cơ chất OPD<br /> (o-phenylenediamin) (Hãng Sigma).<br /> Các hoá chất khác và vật tư tiêu hao<br /> dùng cho gây miễn dịch và phản ứng<br /> ELISA đều đạt tiêu chuẩn phân tích và<br /> chính hãng sản xuất cung cấp.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu<br /> * Chế tạo kháng nguyên từ nọc rắn:<br /> Nọc rắn ở dạng đông khô được hoà tan<br /> trong dung dịch NaCl 0,9% thành dạng<br /> dung dịch có nồng độ 1 mg/ml. Ly tâm<br /> dung dịch nọc, thu dịch nổi và lọc vô trùng<br /> qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,22 µm.<br /> Trộn dung dịch nọc với tá chất Freund<br /> theo tỷ lệ 1:1 về thể tích tạo thành huyền<br /> dịch kháng nguyên để gây miễn dịch.<br /> Huyền dịch kháng nguyên được chế tạo<br /> mới cho mỗi lần gây miễn dịch và được<br /> giữ ở 40C đến khi sử dụng.<br /> * Gây miễn dịch tạo kháng thể kháng<br /> nọc rắn:<br /> Được tiến hành theo quy trình gây<br /> miễn dịch nhiều mũi nhắc lại theo mô tả<br /> của Selvanayagam và CS [6]. Gây miễn<br /> <br /> dịch lần đầu với kháng nguyên trộn tá<br /> chất Freund hoàn chỉnh, gây miễn dịch<br /> nhắc lại với kháng nguyên trộn tá chất<br /> Freund không hoàn chỉnh. Khoảng cách<br /> giữa các lần gây miễn dịch 3 tuần.<br /> Bảng 1: Liều kháng nguyên sử dụng gây<br /> miễn dịch.<br /> Lô thỏ (T), ô gà (G) T1, G1 T2, G2 T3, G3 T4, G4<br /> Mũi 1<br /> <br /> 50<br /> <br /> 75<br /> <br /> 100<br /> <br /> 125<br /> <br /> Nồng độ<br /> kháng<br /> nguyên<br /> <br /> Mũi 2<br /> <br /> 100<br /> <br /> 150<br /> <br /> 200<br /> <br /> 250<br /> <br /> Mũi 3<br /> <br /> 100<br /> <br /> 150<br /> <br /> 200<br /> <br /> 250<br /> <br /> (g/ml)<br /> <br /> Mũi 4<br /> <br /> 100<br /> <br /> 150<br /> <br /> 200<br /> <br /> 250<br /> <br /> Mũi 5<br /> <br /> 100<br /> <br /> 150<br /> <br /> 200<br /> <br /> 250<br /> <br /> Phương pháp gây miễn dịch:<br /> - Đối với thỏ: tiêm theo đường tiêm<br /> dưới da dọc 2 bên sống lưng thành nhiều<br /> mũi, mỗi mũi khoảng 50 l huyền dịch,<br /> tổng thể tích một lần tiêm là 1 ml huyền<br /> dịch.<br /> - Đối với gà: tiêm trong cơ ngực lớn<br /> thành nhiều mũi, mỗi mũi khoảng 50 l<br /> huyền dịch, tổng thể tích một lần tiêm<br /> 1 ml huyền dịch.<br /> Lấy máu động vật thí nghiệm trước khi<br /> gây miễn dịch và 7 ngày sau mỗi lần gây<br /> miễn dịch để phát hiện sự có mặt của<br /> kháng thể kháng nọc rắn. Máu thỏ được<br /> lấy từ động mạch tai, máu gà lấy từ động<br /> mạch cánh.<br /> Trứng gà được thu thập 7 ngày sau<br /> lần gây miễn dịch thứ ba để phát hiện<br /> kháng thể đặc hiệu trong l ng đỏ trứng.<br /> * Kỹ thuật ELISA gián tiếp phát hiện<br /> kháng thể kháng nọc rắn trong huyết thanh:<br /> - Kháng nguyên nọc rắn tổng số (nồng<br /> độ 20 g/ml pha trong dung dịch đệm<br /> 79<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016<br /> <br /> carbonate-bicarbonate pH 9,6) được cố<br /> định trên bề mặt giếng ELISA bằng phương<br /> pháp hấp phụ thụ động ở 400C/12 giờ.<br /> Tiếp đó, bề mặt giếng ELISA được che<br /> phủ (blocking) bằng dung dịch BSA 1%.<br /> - Huyết thanh (thỏ, gà, ngựa) được pha<br /> loãng bậc 2. Nhỏ 100 l huyết thanh đã<br /> pha loãng vào giếng ELISA đã gắn kháng<br /> nguyên nọc rắn, ủ trong 30 phút ở nhiệt<br /> độ phòng. Kháng thể thỏ đặc hiệu với nọc<br /> rắn có mặt trong mẫu huyết thanh được<br /> phát hiện bằng kháng thể đánh dấu enzym<br /> peroxidase. Sau khi rửa loại bỏ các thành<br /> phần không gắn kết trong giếng ELISA,<br /> hoạt tính của enzym peroxidase (thể hiện<br /> sự có mặt của kháng thể đặc hiệu kháng<br /> nguyên nọc rắn) được khảo sát thông qua<br /> tác dụng xúc tác của enzym gây đổi màu<br /> cơ chất OPD (bằng cách bổ sung cơ chất<br /> OPD vào giếng phản ứng). Đo cường độ<br /> của phản ứng chuyển màu bằng máy đọc<br /> ELISA ở bước sóng 450 nm. Hiệu giá<br /> kháng thể trong huyết thanh được tính là<br /> độ pha loãng huyết thanh lớn nhất mà tại<br /> đó c n cho kết quả dương tính với kháng<br /> nguyên nọc rắn.<br /> <br /> - Tách chiết IgY từ trứng gà theo phương<br /> pháp được Hoàng Trung Kiên và CS mô tả<br /> [5]: tách l ng đỏ trứng khỏi lòng trắng, sau<br /> đó trộn với nước cất lạnh 40C (tỷ lệ 1:9 về<br /> thể tích) qua đêm; thu dịch nổi, lọc qua giấy<br /> lọc Whatman; dịch lọc được kết tủa phân<br /> đoạn lần lượt trong dung dịch amoni sulfat<br /> 25% và 40%; thu cặn, hòa tan trong dung<br /> dịch PBS 1X, tiếp đó thẩm tích (loại bỏ<br /> amoni sulfat) trước khi chạy sắc ký trao đổi<br /> ion. Chế phẩm kháng thể sau tinh sạch<br /> được khảo sát hoạt tính bằng kỹ thuật<br /> ELISA gián tiếp, đồng thời điện di SDSPAGE để kiểm tra độ tinh sạch.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Kết quả nghiên cứu chế tạo kháng<br /> thể kháng nọc rắn hổ mang N. atra từ<br /> thỏ và gà.<br /> <br /> * Đánh giá phản ứng chéo giữa HTKNR<br /> với các nọc rắn khác:<br /> Phản ứng chéo giữa huyết thanh (thỏ,<br /> gà, ngựa) kháng nọc rắn N. atra với nọc<br /> rắn khác loài (rắn Hổ đất, Hổ chúa, Chàm<br /> quạp và Lục xanh) được khảo sát bằng<br /> kỹ thuật ELISA gián tiếp. Kết quả ELISA<br /> dương tính thể hiện sự có mặt của kháng<br /> thể phản ứng chéo.<br /> * Tinh sạch kháng thể:<br /> - Huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu<br /> được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký<br /> ái lực (sử dụng cột protein A cho huyết<br /> thanh thỏ, cột protein G cho huyết thanh<br /> ngựa), sau đó thẩm tích qua đêm ở 40C.<br /> 80<br /> <br /> Hình 1: Biến động hiệu giá kháng thể đặc<br /> hiệu trên thỏ và gà được gây miễn dịch.<br /> Kháng thể đặc hiệu bắt đầu xuất hiện<br /> sau mũi đầu tiên và tăng dần trong quá<br /> trình gây miễn dịch, đạt cao nhất sau 4 - 5<br /> lần tiêm kháng nguyên.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016<br /> <br /> 2. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu trong HTKNR.<br /> <br /> Hình 2: Hiệu giá kháng thể đặc hiệu của 3 HTKNR.<br /> Hiệu giá kháng thể có trong huyết thanh thỏ (T2, T3) và gà (G3) sau 5 lần gây miễn dịch<br /> đều đạt từ 128.000 - 256.000, hiệu giá kháng thể có trong huyết thanh ngựa là 256.000.<br /> 3. Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn N. atra với kháng nguyên nọc<br /> rắn khác loài.<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> (1: nọc rắn Chàm quạp, 2: nọc rắn Lục xanh, 3: nọc rắn Hổ chúa, 4: nọc rắn Hổ đất)<br /> <br /> Hình 3: Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn N. atra với nọc rắn khác loài.<br /> 81<br /> <br />