Nghiên cứu cơ chế gây bệnh thoái hóa não xốp của protein prion do đột biến mất vị trí gắn đồng

Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ GÂY BỆNH THOÁI HÓA NÃO XỐP  <br /> CỦA PROTEIN PRION DO ĐỘT BIẾN MẤT VỊ TRÍ GẮN ĐỒNG <br /> Mai Phương Thảo* <br /> <br /> TÓM TẮT <br /> Mục  tiêu: Nghiên cứu những thay đổi trong quá trình trưởng thành và sự di chuyển của protein prion <br /> (PrP) đột biến mất khả năng gắn đồng trong tế bào. <br /> Đối tượng – Phương pháp: Phân tích tính chất sinh hóa PrP đột biến và sự phân bố protein ở dòng tế bào <br /> chuột N2a (neuroblastoma) bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang tế bào (immunocytochemistry).  <br /> Kết quả: Protein đột biến mất khả năng gắn đồng mang đặc tính glycosyl hóa giống protein bình thường. <br /> Đột biến tại histidine 95 (H95Y) kháng với protease ngay cả khi biểu hiện ở tế bào bình thường không nhiễm <br /> prion và tích tụ chủ yếu tại early và recycling endosome.  <br /> Kết  luận: Chúng tôi xác định được đặc tính kháng protease của đột biến H95Y không liên quan đến quá <br /> trình tổng hợp của protein. Hơn nữa, early và recycling endosome có thể là bào quan chính nơi xảy ra quá trình <br /> biến đổi cấu trúc thành dạng prion gây bệnh. <br /> TỪ  KHÓA:  Thoái hóa não xốp (bệnh prion), protein prion (PrP), protein bệnh lý (PrPSc), gắn đồng, đoạn <br /> trình tự “8 amino acid lặp lại” (OR), kháng PK, H95Y, glycosyl hóa, vận chuyển nội bào, bào quan endosome, <br /> amyloid, thioflavin. <br /> <br /> ABSTRACT <br /> MECHANISMS OF MUTATION IN COPPER BINDING SITES OF PRION PROTEIN LEADING TO <br /> PRION FORMATION <br /> Mai Phuong Thao * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 5‐ 2014: 232 ‐ 242 <br /> Objective:  Elucidating  cellular  maturation  and  distribution  processes  of  mutants  carrying  copper <br /> bindingsite substitution in prion protein. <br /> Materials  –  Methods:  Using  the  mutagenesis  on  histidine  residues,  analyzing  protein  glycosylation, <br /> protease‐resistance and protein distribution in N2a cells by immunofluorescence. <br /> Results: Mutant proteins shared similar glycosylation patterns as wild‐type PrP. Mutation H95Y acquired <br /> PK‐resistance even when expressed in normal cell line. Moreover, H95Y proteins are accumulated in early and <br /> recycling endosomes. <br /> Conclusion:  We  found  that  the  protease‐resistance  of  H95Y  mutation  is  not  related  to  its  synthesis.  In <br /> addition, early and recycling endosomes could be the main sites for prion conversion.  <br /> Key  words:  Prion  diseases,  prion  protein  (PrP),  PrP  scarpie  (PrPSc),  copper  binding,  octapeptide  repeat <br /> region (OR), PK‐resistance, H95Y, glycosylation, endocytosis, endosome, amyloid, thioflavin. <br /> thể  tương  tác  với  nhiều  loại  protein  cũng  như <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ <br /> các yếu tố khác nhau, có thể có liên quan đến cơ <br /> Prion  hay  thoái  hóa  não  dạng  xốp  là  một <br /> chế bệnh sinh của bệnh prion. Từ bề mặt tế bào, <br /> bệnh  lý  gây  ra  do  sự  biến  đổi  cấu  trúc  của <br /> PrPC quay trở lại bào tương bằng con đường vận <br /> protein  PrPC  (cellular)  bình  thường  sang  dạng <br /> chuyển nội bào “endocytosis”(21), đi đến các bào <br /> gây  bệnh  PrPSc  (scrapie).  PrPC  là  một  protein <br /> quan  endosome,  và  cuối  cùng  bị  phân  hủy  tại <br /> màng, bám trên bề mặt tế bào. Tại đây, PrPC có <br /> lysosome hoặc được đưa trở lại bề mặt tế bào để <br /> * Bộ môn Sinh lý học, ĐH Y Dược TpHCM <br /> Tác giả liên lạc: TS Mai Phương Thảo <br /> ĐT: 091832 9999 <br /> <br /> 232<br /> <br />  Email: maithao292@gmail.com <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 <br /> tiếp  tục  thực  hiện  chức  năng  trên  màng  tế  bào. <br /> Ngoài  con  đường  luân  chuyển  này,  các  dạng <br /> PrPC khác cũng được phát hiện trên mô hình tế <br /> bào  cũng  như  in vivo.  Các  nghiên  cứu  gần  đây <br /> cho thấy PrP có khả năng biến đổi qua lại giữa <br /> dạng  gắn  bên  ngoài  màng  tế  bào  và  dạng  nội <br /> bào(8, 9). <br /> Vai  trò  và  chức  năng  của  PrP  màng  tế  bào <br /> vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ nhưng rõ ràng <br /> là PrPC có vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh <br /> sinh  của  prion(8).  Protein  PrP  trên  màng  tế  bào <br /> được  sinh  tổng  hợp  từ  lưới  nội  sinh  chất <br /> (Endoplasmic reticulum, ER) và chiếm dưới 10% <br /> tồng lượng PrP. Giống như các loại protein khác <br /> được tổng hợp từ ER, một lượng PrP nhất định <br /> gấp  cuộn  sai  và  được  di  chuyển  ngược  trở  lại <br /> vào trong nội bào và cuối cùng là bị giáng hóa ở <br /> các  proteasome.  Khi  chức  năng  của  các <br /> proteasome  bị  rối  loạn,  PrP  sẽ  tích  tụ  lại  ở  nội <br /> bào, tuy nhiên cơ chế gây bệnh cụ thể của lượng <br /> PrP  tích  tụ  này  vẫn  còn  phải  làm  sáng  tỏ(3,26). <br /> Nghiên  cứu  của  chúng  tôi  nhằm  mục  đích  cho <br /> thấy  sự  tích  tụ  PrP  nội  bào  có  thể  là  chìa  khóa <br /> kích hoạt bệnh lý thoái hóa thần kinh prion. <br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU <br /> Plasmid dùng để biến nạp vào tế bào <br /> Các  đột  biến  điểm  thay  thế  histidine  bằng <br /> tyrosine  (H60Y,  H68Y,  H76Y,  H84Y,  H95Y)  có <br /> gắn  đuôi  3F4  (L108M,  V111M)  được  nhân  bản <br /> (clone) vào vector pcDNA3.1 mang gen mã hóa <br /> PrP  chuột  (MoPrP(1‐254))  bằng  kit  Quick <br /> Change  site‐directed  mutagenesis  (Stratagene). <br /> Tế  bào  chuột  N2a  (mouse  neuroblastoma  cell <br /> line) và tế bào chuột nhiễm prion ScN2a (prion‐<br /> infected  neuroblastoma  cell  line)  được  nuôi  cấy <br /> trong môi trường Opti‐MEM (GIBCO) chứa 10% <br /> huyết  thanh  bê  (FBS)  và  1%  penicillin‐<br /> streptomycin ở 37°C, 5% CO2. Biến nạp tạm thời <br /> (transient  transfection)  được  thực  hiện  bằng  X‐<br /> treme  gene  DNA  transfection  (Roche <br /> Biochemicals) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. <br /> Sau khi biến nạp 72 giờ, dịch tế bào sẽ được thu <br /> và phân tích. <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Thí nghiệm về tính chất sinh hóa của PrPSc <br /> và PrPC <br /> Các  tế  bào  được  ly  giải  trong  dung  dịch  ly <br /> giải  (chứa  10  mM  Tris–HCl  pH  8.0,  150  mM <br /> NaCl,  0.5%  Nonidet  P‐40  substitute,  0.5% <br /> sodium deoxycholate), phần chất ly giải sẽ được <br /> định  lượng  nồng  độ  protein  bằng  BCA  kit <br /> (Pierce) và được trữ ở nhiệt độ ‐20oC cho đến khi <br /> sử dụng.  <br /> Trong phản ứng cắt bằng enzyme protease K <br /> (PK, Roche) để nhận diện PrPSc, protein được ủ <br /> với PK ở 37oC hoặc ở 25oC. Để ngừng phản ứng, <br /> chúng  tôi  dùng  dung  dịch  phenylmethyl‐<br /> sulphonyl  fluoride  (PMSF)  2mM.  Sau  đó,  các <br /> mẫu  protein  sẽ  được  siêu  ly  tâm  với  vận  tốc <br /> 100,000g  trong  vòng  1  giờ  ở  4°C  (Optima  TL, <br /> Beckman Coulter, Inc.). Khối kết tủa sẽ được tái <br /> hòa tan trong dung dịch nạp mẫu.  <br /> Để  đánh  giá  mức  độ  trưởng  thành  của <br /> protein đột biến, chúng tôi tiến hành khảo sát sự <br /> glycosyl  hóa  của  protein,  sử  dụng  cặp  enzyme <br /> Endoglycosidase H (EndoH) và PNGAse F (New <br /> England  Biolabs).  Phản  ứng  được  thực  hiện  ở <br /> 37oC  và  ủ  trong  16  giờ.  Để  ngừng  phản  ứng, <br /> chúng tôi hòa tan trong dung dịch nạp mẫu. Các <br /> mẫu  này  sẽ  được  chạy  điện  di  SDS‐PAGE  10% <br /> và  lai  với  kháng  thể  3F4  (Covance)  phát  hiện <br /> PrP. Hình ảnh kết quả Western blot này sẽ được <br /> chụp  bằng  phần  mềm  UVI  Soft  (UVITEC, <br /> Cambridge). <br /> <br /> Hóa <br /> tế <br /> bào <br /> (Immunocytochemistry) <br /> <br /> miễn <br /> <br /> dịch <br /> <br /> Tế  bào  N2a  được  nuôi  trên  các  lame  được <br /> phủ  poly‐L‐lysine  trong  vòng  24  giờ  và  được <br /> cố định bằng paraformaldehyde (PFA) 4%. Các <br /> tế  bào  này  sẽ  được  ủ  với  kháng  thể  1  trong <br /> vòng  12  giờ  ở  nhiệt  độ  4oC  trong  dung  dịch <br /> blocking chứa 0.2% Triton X‐100 (nhằm phá vỡ <br /> cấu  trúc  màng  tế  bào,  giúp  các  kháng  thể  có <br /> thể  dễ  dàng  xâm  nhập  nội  bào).  Ngày  hôm <br /> sau, các tế bào được rửa và ủ với kháng thể 2 <br /> có gắn huỳnh quang trong vòng 1 giờ ở  nhiệt <br /> độ  phòng.  Riêng  trong  thí  nghiệm  nhằm  phát <br /> <br /> 233<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014<br /> <br /> hiện PrP ở bề mặt tế bào thì các tế bào được ủ <br /> với kháng thể kháng 3F4 ở 4°C trong vòng 15 <br /> phút  mà  không  cần  dung  dịch  Triton  X‐100 <br /> 0.2%. Để phát hiện PrP nội bào, ban đầu các tế <br /> bào  được  ủ  với  kháng  thể  3F4  trong  vòng  15 <br /> phút  ở  4°C,  và  sau  đó  được  ủ  ở  37oC  trong <br /> vòng  1  giờ  nhằm  giúp  cho  các  protein  được <br /> đánh  dấu  ở  bề  mặt  tế  bào  di  chuyển  vào  bên <br /> trong  tế  bào.  Tiếp  theo,  các  tế  bào  sẽ  được  ủ <br /> với  trypsin  0.5%  (Sigma)  nhằm  loại  bỏ  tất  cả <br /> các protein còn sót lại trên màng(18). Sau đó, các <br /> tế bào được ủ với kháng thể 2 AlexaFlour‐488 <br /> trong dung dịch có chứa Triton X‐100.  <br /> Để  phát  hiện  các  kết  tụ  bằng  Thioflavin‐S <br /> (ThS), tế bào được cố định bằng PFA 4% và rửa <br /> với  dung  dịch  PBS  có  chứa  Triton  X‐100 <br /> 0,2%(19,25).  <br /> Đối  với  các  bào  quan,  chúng  tôi  sử  dụng <br /> kháng thể anti‐Calnexin (lưới nội sinh chất), anti‐<br /> EEA1  (cho  early  endosome),  anti‐Tfn  (cho <br /> recycling  endosome),  anti‐M6PR  (cho  late <br /> endosomes) và anti‐LAMP2 (cho lysosomes). Tất <br /> cả các kháng thể này được cung cấp bởi công ty <br /> Abcam  và  được  sử  dụng  theo  đúng  quy  trình <br /> hướng dẫn của nhà sản xuất. Nhân tế bào được <br /> nhuộm bằng DAPI (VECTOR Laboratories). Các <br /> hình  ảnh được  chụp  và xử  lí  bằng kính hiển  vi <br /> confocal  Leica  DMIR2  và  phần  mềm  Leica <br /> Confocal (Leica). <br /> <br /> Phân tích thống kê <br /> T‐test được dùng để phân tích và so sánh các <br /> kết  quả.  Sự  khác  biệt  có  ý  nghĩa  thống  kê  khi <br /> p <br /> 0,05)  (Hình  1B).  Tuy  nhiên  ở  các  nồng  độ  PK <br /> trung  gian  (3  và  10μg/mL),  H95Y  kháng  PK  rõ <br /> rệt (p