Nghiên cứu định lượng đồng thời ginsenosid RG1, RE, RB1 và RD trong viên nang ukata bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI GINSENOSID<br /> RG1, RE, RB1 VÀ RD TRONG VIÊN NANG UKATA<br /> BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> Nguyễn Chu Huy*; Trịnh Nam Trung*; Vũ Bình Dương*<br /> Nguyễn Văn Bạch*; Đào Văn Đôn*<br /> TÓM TẮT<br /> Phương pháp HPLC định lượng đồng thời ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd trong viên nang cứng<br /> Ukata đã được xây dựng và thẩm định. Pha động gåm acetonitril - nước, cột phân tích Gemini C18<br /> (250 x 4,6 nm, 5 mm), detector UV tại 203 nm và tốc độ dòng 1,5 ml/phút. Các ginsenosid được tách<br /> hoàn toàn trong thời gian 50 phút. Giới hạn định lượng của ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd nằm trong<br /> khoảng 6,0 - 8,0 µg/ml. Diện tích pic và nồng độ các ginsenosid có mối tương quan tuyến tính với hệ<br /> số tương quan ≈ 1. Phương pháp có độ chính xác cao, độ lặp lại tốt với RSD < 2%. Tỷ lệ thu hồi<br /> ginsenosid từ 93 - 100%. Phương pháp này có thể được sử dụng để định lượng ginsenosid Rg1, Re,<br /> Rb1 và Rd trong viên nang cứng Ukata và các sản phẩm khác có chứa tam thất.<br /> * Từ khóa: Ginsenosid; Rg1; Re; Rb1; Rd; HPLC.<br /> <br /> SIMULTANEOUS DETERMINATION OF GINSENOSIDE<br /> RG1, RE, RB1 AND RD IN UKATA CAPSULES BY HPLC<br /> SUMMARY<br /> A HPLC method for the simultaneous determination of ginsenoside Rg1, Re, Rb1 and Rd in Ukata<br /> capsules was validated. Using acetonitrile and water as the mobile phase, Gemini C18 (250 x 4.6<br /> nm, 5 µm) column, UV detection at 203 nm and flow at 1.5 ml/min, the ginsenosides were separated<br /> satisfactorily within 50 minutes. The quantitation limits of ginsenoside Rg1, Re, Rb1 and Rd were about<br /> 6.0 to 8.0 µg/ml. The calibration curve of each ginsenoside had a correlation coefficient close to 1.<br /> The precisions were all less than 2%. The recovery rates of extraction were 93 - 100% for all<br /> ginsenosides. This method should be used to detemine ginsenoside Rg1, Re, Rb1 and Rd in Ukata<br /> capsules and other products containing Panax pseudoginseng.<br /> * Key words: Ginsenoside, Rg1; Re; Rb1; Rd; HPLC.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ở Việt Nam, thuốc chống ung thư chủ<br /> yếu có nguồn gốc hóa dược, phải nhập khẩu<br /> với giá thành cao, không chủ động được<br /> nguồn nguyên liệu, phụ thuộc nhiều vào các<br /> <br /> hãng dược phẩm nước ngoài, trong khi đó<br /> nguồn nguyên liệu tự nhiên sẵn có của Việt<br /> Nam vẫn chưa được tận dụng. Thực trạng này<br /> cho thấy, cần phải nghiên cứu sản xuất thuốc<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Đào Văn Đôn (daovandon@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 14/10/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/11/2013<br /> Ngày bài báo được đăng: 12/12/2013<br /> <br /> 42<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014<br /> <br /> điều trị ung thư từ nguồn nguyên liệu trong<br /> nước, tạo ra được sản phẩm chất lượng tốt,<br /> giá cả hợp lý, phù hợp điều kiện kinh tế Việt<br /> Nam. Xuất phát từ vấn đề trên, Học viện<br /> Quân y đã tiến hành nghiên cứu bào chế<br /> viên nang cứng Ukata với tác dụng hỗ trợ<br /> điều trị ung thư. Sản phẩm có thành phần<br /> tam thất với hoạt chất chính là các ginsenosid<br /> [1]. Đây là những hoạt chất chính góp phần<br /> tạo ra tác dụng của sản phẩm. Vì vậy, chỉ<br /> tiêu định lượng này cần được đánh giá để<br /> đảm bảo sản phẩm đạt chất lượng tốt, góp<br /> phần bảo vệ và chăm sóc sức khoẻ cộng đồng.<br /> NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên vật liệu nghiên cứu.<br /> * Đối tượng nghiên cứu:<br /> - Viên nang cứng Ukata (lô 0812, NSX<br /> 08.08.2012, HSD 08.08.2014) được sản xuất<br /> tại Học viện Quân y, đạt TCCS.<br /> - Thành phần viên nang cứng Ukata: cao<br /> khô bèo hoa dâu 60 mg; cao khô nghệ 100<br /> mg; cao khô tam thất 80 mg, tá dược (talc,<br /> magnesi stearat) vừa đủ 1 viên.<br /> - Mẫu trắng: là mẫu tự tạo không chứa<br /> tam thất.<br /> * Dung môi, hoá chất:<br /> - Chất chuẩn: ginsenosid Rg1 (98,5%), Rb1<br /> (99,0%), Re (99,2%), Rd (99,3%) của SigmaAldrich.<br /> - Methanol, acetonitril (Merck) đạt tiêu<br /> chuẩn HPLC.<br /> - Các hoá chất, dung môi khác: ethanol,<br /> methanol, ethyl acetat, cloroform, diethyl ether,<br /> H2SO4 đặc... đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.<br /> * Thiết bị và dụng cụ phân tích:<br /> Tất cả các thiết bị phân tích đều được chuẩn<br /> hóa theo ISO/IEC 17025 - 2005, bao gồm:<br /> <br /> - Thiết bị phân tích: hệ thống HPLC<br /> Alliance Waters 2695D, 4 kênh dung môi,<br /> bơm mẫu tự động, có buồng gia nhiệt cột,<br /> detector PDA (203 nm), cột sắc ký Gemini<br /> C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm)... Phần mềm xử<br /> lý số liệu Empower® 2.<br /> - Thiết bị dụng cụ khác: cân phân tích<br /> Sartorius độ chính xác ± 0,1 mg, các dụng<br /> cụ thủy tinh, bình định mức, pipet có độ<br /> chính xác phù hợp.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Khảo sát quy trình định lượng:<br /> Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu [2,<br /> 3, 4], chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý mẫu<br /> như sau:<br /> Lấy 20 viên nang cứng Ukata, bóc bỏ vỏ<br /> nang, trộn đều. Xác định khối lượng trung<br /> bình viên. Cân chính xác 1,0 gam bột viên<br /> nang, thêm 15 ml MeOH, hòa tan bằng máy<br /> siêu âm. Ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút.<br /> Hút lấy dịch trong. Cắn tiếp tục hòa tan như<br /> thế thêm 2 lần nữa (10 ml x 2 lần). Tập<br /> trung dịch dịch chiết, bốc hơi chân không<br /> tới cắn, hòa tan cắn bằng 10 ml MeOH. Lọc<br /> qua màng lọc 0,45 µm, đem dịch lọc phân<br /> tích HPLC.<br /> - Điều kiện sắc ký [2, 3, 4]: cột Gemini<br /> C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector PDA ghi<br /> phổ 200 - 400 nm, tốc độ dòng 1,5 ml/phút,<br /> thể tích bơm mẫu 10 µl. Tiến hành khảo sát<br /> pha động ACN:H2O chạy theo chương trình<br /> gradient.<br /> * Thẩm định quy trình định lượng:<br /> Thẩm định quy trình định lượng theo<br /> ICH gồm các chỉ tiêu: tính tương thích của<br /> hệ thống sắc ký, độ chọn lọc - đặc hiệu,<br /> khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát<br /> hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác,<br /> độ đúng.<br /> <br /> 43<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Khảo sát quy trình định lƣợng.<br /> Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và khảo sát điều kiện sắc ký theo phương pháp nghiên cứu,<br /> ghi sắc ký đồ và phân tích kết quả. Lựa chọn điều kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời<br /> 4 ginsenosid như sau: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm). Detector PDA 203nm; tốc độ<br /> dòng 1,5 ml/phút; thể tích bơm mẫu: 10 µl. Pha động ACN:nước chạy theo chương trình sau:<br /> 0 - > 20 phút: 19 - > 20% ACN; 20 - > 30 phút: 20 - > 32% ACN; 30 - > 40 phút: 32 - > 36%<br /> ACN; 40 - > 50 phút: 36 - > 38% ACN.<br /> 2. Thẩm định quy trình định lƣợng.<br /> * Tính tương thích hệ thống sắc ký:<br /> Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp Rg1, Re, Rb1 và Rd có nồng độ 50 µg/ml, tiến hành phân<br /> tích sắc ký HPLC 5 lần liên tiếp theo điều kiện đã lựa chọn.<br /> Bảng 1: Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống sắc ký.<br /> (m/s)<br /> TT<br /> Rg1<br /> <br /> Re<br /> <br /> Rb1<br /> <br /> Rd<br /> <br /> Rg1<br /> <br /> Re<br /> <br /> Rb1<br /> <br /> Rd<br /> <br /> 1<br /> <br /> 26,91<br /> <br /> 27,34<br /> <br /> 39,01<br /> <br /> 44,03<br /> <br /> 121094<br /> <br /> 148579<br /> <br /> 89957<br /> <br /> 95763<br /> <br /> 2<br /> <br /> 27,02<br /> <br /> 27,11<br /> <br /> 38,05<br /> <br /> 43,89<br /> <br /> 120634<br /> <br /> 147556<br /> <br /> 90238<br /> <br /> 94613<br /> <br /> 3<br /> <br /> 26,93<br /> <br /> 26,45<br /> <br /> 39,55<br /> <br /> 44,93<br /> <br /> 119234<br /> <br /> 146867<br /> <br /> 91078<br /> <br /> 93971<br /> <br /> 4<br /> <br /> 26,94<br /> <br /> 27,31<br /> <br /> 38,46<br /> <br /> 44,02<br /> <br /> 121154<br /> <br /> 149668<br /> <br /> 91555<br /> <br /> 94722<br /> <br /> 5<br /> <br /> 27,03<br /> <br /> 27,33<br /> <br /> 39,12<br /> <br /> 44,78<br /> <br /> 119134<br /> <br /> 147578<br /> <br /> 91473<br /> <br /> 93587<br /> <br /> X<br /> <br /> 26,97<br /> <br /> 27,11<br /> <br /> 38,84<br /> <br /> 44,33<br /> <br /> 120250<br /> <br /> 148050<br /> <br /> 90860<br /> <br /> 94531<br /> <br /> RSD<br /> <br /> 0,22<br /> <br /> 1,4<br /> <br /> 1,52<br /> <br /> 1,11<br /> <br /> 0,8<br /> <br /> 0,7<br /> <br /> 0,8<br /> <br /> 0,9<br /> <br /> Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu thời gian lưu và diện tích pic của các<br /> ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd đều nhỏ hơn 2%. Như vậy, hệ thống sắc ký hoàn toàn đáp<br /> ứng yêu cầu để phân tích ginsenosid trên.<br /> * Độ chọn lọc - đặc hiệu:<br /> Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn hỗn hợp ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd trong<br /> MeOH ở nồng độ 50 µg/ml và mẫu thử.<br /> 44<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014<br /> <br /> (a)<br /> <br /> Rb1<br /> <br /> Rd<br /> <br /> Rg1 Re<br /> <br /> (b)<br /> <br /> Rg1<br /> Rb1<br /> <br /> (c) Rd<br /> Re<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ của 4 ginsenosid trong mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) và mẫu thử (c).<br /> Sắc ký đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp ginsenosid và mẫu thử Ukata cho thấy: tại thời điểm<br /> xuất hiện pic của ginsenosid của mẫu chuẩn, không xuất hiện pic tương ứng trên mẫu<br /> trắng. Đồng thời, tại thời điểm đó trên sắc ký đồ của mẫu thử xuất hiện đáp ứng pic tách<br /> hoàn toàn khỏi pic tạp, pic của ginsenosid ở mẫu chuẩn và mẫu thử sắc nét, cân đối. Như<br /> vậy, phương pháp có tính chọn lọc, đặc hiệu cao.<br /> * Khoảng nồng độ tuyến tính:<br /> Chuẩn bị một dãy chuẩn ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd với nồng độ trong khoảng từ 20 500 µg/ml. Tiến hành phân tích HPLC theo điều kiện đã lựa chọn.<br /> Bảng 2: Kết quả xác định mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của ginsenosid.<br /> C (µg/ml)<br /> <br /> 20<br /> <br /> 50<br /> <br /> 100<br /> <br /> 200<br /> <br /> 500<br /> <br /> Spic (Rg1) (μV.s)<br /> <br /> 51063<br /> <br /> 118994<br /> <br /> 227967<br /> <br /> 475735<br /> <br /> 1181541<br /> <br /> Spic (Re) (μV.s)<br /> <br /> 57892<br /> <br /> 144456<br /> <br /> 305441<br /> <br /> 609638<br /> <br /> 1495955<br /> <br /> Spic (Rb1) (μV.s)<br /> <br /> 38869<br /> <br /> 89671<br /> <br /> 175917<br /> <br /> 382500<br /> <br /> 918084<br /> <br /> Spic (Rd) (μV.s)<br /> <br /> 41201<br /> <br /> 91709<br /> <br /> 196457<br /> <br /> 386913<br /> <br /> 961521<br /> <br /> y(Rg1) = 2363 x - 126; R² = 0,9999<br /> Phương trình hồi quy<br /> tuyến tính<br /> <br /> y(Re) = 2997x + 1203,1; R² = 0,9999<br /> y(Rb1) = 1842,1x + 479,92; R² = 0,9994<br /> y(Rd) = 1922,3x + 1086,9; R² = 0,9999<br /> <br /> 45<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014<br /> <br /> Hình 2: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ginsenosid.<br /> Có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd<br /> trong khoảng khảo sát với hệ số tương quan R2 ≈ 1.<br /> * Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dưới:<br /> Dựa vào độ nhiễu đường nền của mẫu trắng và đường chuẩn để ngoại suy giới hạn<br /> phát hiện và giới hạn định lượng ginsenosid. Từ đó, tiến hành pha thử 4 - 5 nồng độ quanh<br /> điểm dự kiến, kết quả cho thấy: giới hạn phát hiện của Rg1 (2 µg/ml), Re (2 µg/ml), Rb1 (3<br /> µg/ml), Rd (3 µg/ml); giới hạn định lượng dưới của 4 ginsenosid Rg1 (6 µg/ml), Re (6 µg/ml),<br /> Rb1 (8 µg/ml), Rd (8 µg/ml).<br /> * Độ chính xác:<br /> Pha các mẫu LQC (40 µg/ml), MQC (120 µg/ml) và HQC (400 µg/ml), mỗi nồng độ pha<br /> 5 mẫu độc lập. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn.<br /> Bảng 3: Diện tích pic và ginsenosid ở nồng độ LQC, MQC và HQC.<br /> Rg1<br /> G i n s e n o sDTi d<br /> (µV×s)<br /> <br /> Re<br /> RSD<br /> (%)<br /> <br /> 950833<br /> <br /> MQC (120<br /> µg/ml)<br /> <br /> 948694<br /> <br /> RSD<br /> (%)<br /> <br /> 1214364<br /> <br /> 949253<br /> HQC (400<br /> µg/ml)<br /> <br /> DT (µV×s)<br /> <br /> Rb1<br /> <br /> 1225750<br /> <br /> RSD<br /> (%)<br /> <br /> 734467<br /> <br /> 1225814<br /> 0,3<br /> <br /> DT<br /> (µV×s)<br /> <br /> Rd<br /> <br /> 732739<br /> <br /> 768187<br /> 0,2<br /> <br /> 767627<br /> <br /> 947301<br /> <br /> 1217309<br /> <br /> 736812<br /> <br /> 772956<br /> <br /> 953879<br /> <br /> 1213870<br /> <br /> 733982<br /> <br /> 770945<br /> <br /> 285441<br /> <br /> 356824<br /> <br /> 223100<br /> <br /> 232148<br /> <br /> 282874<br /> <br /> 355099<br /> <br /> 226715<br /> <br /> 229407<br /> <br /> 284072<br /> 282104<br /> 279924<br /> <br /> 0,7<br /> <br /> 356059<br /> 350338<br /> 354366<br /> <br /> 0,7<br /> <br /> 221572<br /> <br /> RSD<br /> (%)<br /> <br /> 770817<br /> <br /> 734067<br /> 0,5<br /> <br /> DT<br /> (µV×s)<br /> <br /> 0,9<br /> <br /> 230729<br /> <br /> 222634<br /> <br /> 230637<br /> <br /> 223487<br /> <br /> 231432<br /> <br /> 0,3<br /> <br /> 0,4<br /> <br /> 46<br /> <br />