Nghiên cứu định lượng một số hoạt chất anthraquinon và stilben trong Đại hoàng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT<br /> ANTHRAQUINON VÀ STILBEN TRONG ĐẠI HOÀNG<br /> BẰNG SẮC Kí LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> Hoàng Văn Lương*; Nguyễn Văn Long*; Chử Văn Mến*<br /> Nguyễn Thị Thanh Hương*; Phạm Thị Thanh Hương*<br /> TÓM TẮT<br /> Nghiên cứu đã tiến hành định lƣợng đƣợc một số hoạt chất anthraquinon và stilben trong<br /> Đại hoàng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 5 hoạt chất đƣợc định lƣợng<br /> gồm: 4 hoạt chất là dẫn xuất anthraquinon: chrysophanol, emodin, emodin-glucoside và<br /> sennoside A và 1 hoạt chất nhóm stilben là rhaponticin đƣợc định lƣợng trong nghiên cứu này.<br /> Tiến hành phân tách trên cột pha đảo C18 với chƣơng trình gradient sử dụng dung môi A (dung<br /> dịch 0,05 M axít phosphoric trong nƣớc) và dung môi B (acetonitrile), bƣớc sóng 280 nm, tốc độ<br /> dòng 1,0 ml/phút. Chƣơng trình rửa giải gồm: 0 - 5 phút (20% B); 18 phút (28% B); 25 phút<br /> (42% B); 30 phút (100% B) cho kết quả tách tốt. Thẩm định phƣơng pháp cho kết quả độ tuyến<br /> tính cao (r > 0,9995) và độ thu hồi trong khoảng 98,0 - 102,6%. Giới hạn định lƣợng trong khoảng<br /> 0,05 - 0,28 μg/ml. Phƣơng pháp trên đƣợc áp dụng để phân tích 31 mẫu Đại hoàng gồm nhiều loài<br /> khác nhau. Kết quả: hàm lƣợng hoạt chất biến động nhiều trong các mẫu, hàm lƣợng của<br /> sennoside, rhaponticin, emodin- glucoside, emodin và chrysophanol tƣơng ứng là: 2,53 ± 4,26;<br /> 16,40 ± 29,50; 0,58 ± 0,48; 0,93 ± 0,83 và 3,72 ± 2,97 mg/g.<br /> * Từ khóa: Đại hoàng; Sắc ký lỏng hiệu năng cao.<br /> <br /> STUDY ON THE QUANTITATION OF SOME ANTHRAQUINONE<br /> AND STILBENE COMPOUNDS IN RHEI RHIZOMA BY HPLC<br /> summary<br /> We quantitated some anthraquinone and stilben active compounds in Rhei Rhizoma using high<br /> performance liquid chromatography. Five bioactive compounds were quantitated including 4<br /> anthraquinone: chrysophanol, emodin, emodin-glucoside and sennoside A and 1 stilbene compound:<br /> rhaponticin. The chromatographic separation was performed on a C18 column by gradient elution<br /> with 0.05 M phosphoric acid in water and acetonitrile, the wavelength was set at 280 nm, the<br /> flow rate was set at 1 ml/min, gradient condition as followed: 0 - 5 min (20% B); 18 min (28% B);<br /> 25 min (42% B); 30 min (100% B) gave the satisfied separation. The methodological validation<br /> gave acceptable linearities (r > 0.9995) and recoveries (ranging from 98.0 - 102.6%). The limits<br /> of detection (LOD) of these compounds ranged from 0.05 to 0.28 μg/ml. The developed method<br /> was applied to the quantitation of 31 samples of different Rhei Rhizoma species. The results<br /> showed that the contents of bioactive compounds were fluctuated among samples, the contents<br /> of sennoside, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin and chrysophanol: 2.53 ± 4.26, 16.40 ±<br /> 29.50; 0.58 ± 0.48, 0.93 ± 0.83 and 3.72 ± 2.79 mg/g, respectively.<br /> * Key words: Rhei Rhizoma; HPLC.<br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 20/03/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/04/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 15/04/2014<br /> <br /> 7<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Đại hoàng (Rhei Rhizoma) là một nhóm<br /> loài trong chi, Rheum thuộc họ rau Răm<br /> (Polygonaceae). Có 3 loài của chi Rheum<br /> đƣợc chính thức công nhận trong Dƣợc<br /> điển Việt Nam, Hàn Quốc và Trung Quốc là<br /> R. tanguticum, R. palmatum và R. officinale<br /> [1, 2, 3]. Theo Dƣợc điển Nhật Bản, ngoài<br /> 3 loài trên, ngƣời ta còn công nhận thêm<br /> Rheum coreanum và những loài lai giữa<br /> các loài trên là dƣợc liệu Đại hoàng [4].<br /> Ngoài ra, các loài không chính thức nhƣ<br /> Rheum undulatum, Rheum rhaponticum,<br /> Rumex crispus, Rumex aquatica và<br /> Reynoutria elliptica cũng thƣờng bị sử<br /> dụng nhầm nhƣ là Đại hoàng. Trong một<br /> số trƣờng hợp, việc xác định loài dựa trên<br /> phân tích mô học giữa các loài của mẫu<br /> Đại hoàng trên thị trƣờng cực kỳ khó<br /> khăn. Các nhà nghiên cứu và thầy thuốc<br /> <br /> đông y thƣờng bị nhầm lẫn bởi sự không<br /> rõ ràng của nhiều loài trong sử dụng<br /> dƣợc liệu Đại hoàng. Do vậy, đánh giá<br /> chất lƣợng Đại hoàng dựa trên thành<br /> phần hoạt chất đóng vai trò rất quan trọng<br /> trong kiểm soát chất lƣợng của dƣợc liệu<br /> Đại hoàng.<br /> Dƣợc liệu Đại hoàng có nhiều hoạt chất<br /> có tác dụng nhuận tràng, lợi mật, bảo vệ<br /> gan, kháng virut, kháng viêm, chống ung<br /> thƣ... [5, 6, 7]. Đó là các anthraquinone nhƣ:<br /> chrysophanol, emodin [8], dianthrone<br /> nhƣ sennoside A [9] hay stilbene nhƣ<br /> rhaponticin [10]. Trong nghiên cứu này,<br /> phƣơng pháp HPLC đƣợc phát triển và<br /> thẩm định để phân tích 5 hoạt chất là<br /> chrysophanol, emodin, emodin-glucoside,<br /> rhaponticin và sennoside A (hình 1), làm<br /> cơ sở để định lƣợng các hoạt chất sinh<br /> học trong 31 mẫu Đại hoàng từ nhiều<br /> nguồn gốc khác nhau.<br /> <br /> Hình 1: Cấu trúc hóa học của các hoạt chất chính trong Đại hoàng: 1. Sennoside A,<br /> 2. Rhaponticin, 3. Emodin-glucoside, 4. Emodin, 5. Chrysophanol.<br /> 8<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Hóa chất và thiết bị.<br /> - Hóa chất và nguyên liệu:<br /> + Hóa chất: chất chuẩn chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin và<br /> sennoside A đƣợc GS. Bae Ki Hwan, Khoa Dƣợc, Trƣờng Đại học Chung Nam, Hàn<br /> Quốc cung cấp. Xác định độ tinh khiết bằng HPLC và khẳng định lại bằng sắc ký lỏng<br /> khối phổ; chuẩn nội (eugenol), acetonitrile, methanol, nƣớc cất, axit phosphoric đạt tiêu<br /> chuẩn cho HPLC, các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích.<br /> + Mẫu Đại hoàng đƣợc thu hái từ nhiều vùng khác nhau của Trung Quốc và Hàn<br /> Quốc (bảng 1), mẫu đƣợc GS. Jae Hyun Lee, Khoa Y học Cổ truyền, Đại học Dong<br /> Guk thẩm định và lƣu trữ tại Khoa Dƣợc, Đại học Quốc gia Chung Nam, Hàn Quốc.<br /> - Thiết bị: máy HPLC Shimadzu gồm bơm LC-20AD, detector SPD-20A UV/Vis, hệ<br /> thống tiêm mẫu tự động SIL-20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-20A (Shimadzu, Japan). Thực<br /> hiện phân tích trên cột C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm, Optimapak, RStech Corp, Korea).<br /> Bảng 1: Danh mục mẫu sử dụng trong nghiên cứu.<br /> TÊN<br /> <br /> KÝ HIỆU<br /> <br /> TÊN<br /> <br /> KHOA HỌC<br /> <br /> MẪU<br /> <br /> KHOA HỌC<br /> <br /> 09B1001<br /> <br /> R. tanguticum<br /> <br /> 09B1012<br /> <br /> R. officinale<br /> <br /> 09B1026<br /> <br /> R. tanguticum<br /> <br /> 09B1002<br /> <br /> R. palmatum<br /> <br /> 09B1013<br /> <br /> R. palmatum<br /> <br /> 09B1027<br /> <br /> R. tanguticum<br /> <br /> 09B1003<br /> <br /> R. palmatum<br /> <br /> 09B1014<br /> <br /> R. undulatum<br /> <br /> 09B1028<br /> <br /> R. palmatum<br /> <br /> 09B1004<br /> <br /> R. palmatum<br /> <br /> 09B1015<br /> <br /> R. undulatum<br /> <br /> 09B1029<br /> <br /> R. officinale<br /> <br /> 09B1005<br /> <br /> R. palmatum<br /> <br /> 09B1016<br /> <br /> R. undulatum<br /> <br /> 09B1030<br /> <br /> R. undulatum<br /> <br /> 09B1006<br /> <br /> R. tanguticum<br /> <br /> 09B1017<br /> <br /> R. undulatum<br /> <br /> 09B2038<br /> <br /> R. undulatum<br /> <br /> 09B1007<br /> <br /> R. tanguticum<br /> <br /> 09B1021<br /> <br /> R. palmatum<br /> <br /> 09B2039<br /> <br /> R. undulatum<br /> <br /> 09B1008<br /> <br /> R. tanguticum<br /> <br /> 09B1022<br /> <br /> R. tanguticum<br /> <br /> 09B2041<br /> <br /> R. undulatum<br /> <br /> 09B1009<br /> <br /> R. officinale<br /> <br /> 09B1023<br /> <br /> R. tanguticum<br /> <br /> 09B2042<br /> <br /> R. undulatum<br /> <br /> 09B1010<br /> <br /> R. officinale<br /> <br /> 09B1024<br /> <br /> R. tanguticum<br /> <br /> 09B1011<br /> <br /> R. officinale<br /> <br /> 09B1025<br /> <br /> R. tanguticum<br /> <br /> KÝ HIỆU MẪU<br /> <br /> KÝ HIỆU MẪU<br /> <br /> TÊN<br /> KHOA HỌC<br /> <br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> - Điều kiện sắc ký:<br /> Cột: cột phân tích pha đảo Optimapak C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) của Công ty<br /> RS Tech (Hàn Quốc); bƣớc sóng phát hiện 280 nm; pha động: dung môi A: dung dịch<br /> axít phosphoric 0,05 M trong nƣớc; dung môi B: acetonitrile; tốc độ dòng 1 ml/phút, thể<br /> tích tiêm 10 μl.<br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> Với chƣơng trình rửa giải:<br /> THỜI GIAN (phút)<br /> <br /> %A<br /> <br /> %B<br /> <br /> 05<br /> <br /> 80<br /> <br /> 20<br /> <br /> 5 18<br /> <br /> 80  72<br /> <br /> 20  28<br /> <br /> 18  25<br /> <br /> 72  58<br /> <br /> 28  42<br /> <br /> 25  30<br /> <br /> 58  0<br /> <br /> 42  100<br /> <br /> 30  35<br /> <br /> 0  80<br /> <br /> 100  20<br /> <br /> 35  40<br /> <br /> 80<br /> <br /> 20<br /> <br /> - Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử:<br /> + Nội chuẩn (IS): dung dịch eugenol<br /> nồng độ 1.000 µg/ml trong methanol.<br /> + Mẫu chuẩn: dãy các dung dịch<br /> chuẩn nồng độ chính xác chrysophanol<br /> (từ 2 - 200 µg/ml), emodin (1 - 100 µg/ml),<br /> emodin-glucoside (0,5 - 50 µg/ml),<br /> rhaponticin (2 - 200 µg/ml) và sennoside<br /> A (0,5 - 50 µg/ml) trong dung dịch chuẩn<br /> nội eugenol (200 µg/ml) trong methanol.<br /> + Mẫu thử: cân chính xác 100 mg bột<br /> dƣợc liệu Đại hoàng, cho vào bình định<br /> mức 10 ml. Thêm khoảng 9 ml ethanol<br /> 70% và 200 μl dung dịch chuẩn nội, bổ<br /> sung ethanol 70% vừa đủ, cân, lắc siêu<br /> âm 60 phút, cân lại, bổ sung khối lƣợng<br /> mất bằng ethanol 70%, ly tâm, gạn lấy<br /> lớp trên, lọc qua màng lọc 0,45 μm.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> Với điều kiện sắc ký và phƣơng pháp<br /> xử lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thu<br /> đƣợc cho các píc tách rõ ràng, nhiễu nền<br /> thấp thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu thử<br /> Đại hoàng và hỗn hợp chuẩn. Trên sắc<br /> <br /> ký đồ, mẫu thử có thời gian lƣu trùng với<br /> thời gian lƣu của píc sennoside A,<br /> rhaponticin, emodin-glucoside, emodin,<br /> chrysophanol trong sắc ký đồ của mẫu<br /> chuẩn lần lƣợt là 12,25; 13,35; 17,56;<br /> 34,42; 36,06 phút (hình 2). Tại thời gian<br /> lƣu píc sennoside A, rhaponticin,<br /> emodin-glucoside, emodin, chrysophanol<br /> trên các sắc đồ mẫu thử và mẫu chuẩn,<br /> so sánh phổ hấp thụ UV thu đƣợc của<br /> píc, kết quả: phổ mẫu thử và mẫu chuẩn<br /> trùng khít lên nhau với hệ số phù hợp lần<br /> lƣợt 0,9997; 0,9996; 0,9998; 0,9992 và<br /> 0,9994. Chứng tỏ: píc thu đƣợc trên sắc<br /> ký đồ của mẫu thử tinh khiết và các<br /> thành phần khác có trong mẫu thử không<br /> ảnh hƣởng đến quá trình phân tích 5<br /> chất đối chiếu sennoside A, rhaponticin,<br /> emodin-glucoside,emodin, chrysophanol.<br /> Kết quả trên cho phép tiến hành định<br /> tính, định lƣợng.<br /> - Tính thích hợp của hệ thống sắc ký:<br /> để đánh giá tính thích hợp của hệ thống<br /> sắc ký, pha mẫu chuẩn theo chỉ dẫn ở<br /> trên. Tiêm 6 lần mẫu chuẩn vào hệ thống<br /> HPLC, tiến hành sắc ký với điều kiện đã<br /> chọn.<br /> 10<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> Bảng 2: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống.<br /> RSD CỦA THỜI<br /> GIAN LƢU<br /> <br /> RSD CỦA<br /> DIỆN TÍCH PÍC<br /> <br /> SỐ ĐĨA LÝ THUYẾT<br /> TRUNG BÌNH<br /> <br /> HỆ SỐ BẤT ĐỐI<br /> TRUNG BÌNH (T)<br /> <br /> Sennoside A<br /> <br /> 0,12<br /> <br /> 0,11<br /> <br /> 12340<br /> <br /> 1,10<br /> <br /> Rhaponticin<br /> <br /> 0,14<br /> <br /> 0,15<br /> <br /> 13260<br /> <br /> 1,07<br /> <br /> Emodin-glucoside<br /> <br /> 0,16<br /> <br /> 0,17<br /> <br /> 14580<br /> <br /> 1,11<br /> <br /> Emodin<br /> <br /> 0,18<br /> <br /> 0,20<br /> <br /> 14620<br /> <br /> 1,08<br /> <br /> Chrysophanol<br /> <br /> 0,19<br /> <br /> 0,22<br /> <br /> 15146<br /> <br /> 1,06<br /> <br /> HOẠT CHẤT<br /> <br /> Các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng phù hợp và đảm bảo<br /> ổn định cho phép phân tích định lƣợng sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside,<br /> emodin, chrysophanol.<br /> <br /> Hình 2: Sắc ký đồ và so sánh phổ của mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b, c): (1): sennoside<br /> A; (2): rhaponticin; (3): emodin-glucoside (4): emodin; (5): chrysophanol.<br /> - Khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng:<br /> <br /> 11<br /> <br />