Nghiên cứu định lượng stevioside trong cỏ ngọt (stevia rebaudiana) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG STEVIOSIDE TRONG CỎ NGỌT<br /> (STEVIA REBAUDIANA) BẰNG PHƢƠNG PHÁP<br /> SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> Vũ Bình Dương*; Chử Văn Mến*; Nguyễn Văn Long*<br /> Vũ Tuấn Anh*; Nguyễn Đức Thiện**<br /> TÓM TẮT<br /> Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp mới và đơn giản để định lượng<br /> stevioside trong cỏ ngọt (Stevia rebaudiana, họ Cúc - Asteraceae) được phát triển và thẩm định<br /> đầy đủ. Phương pháp này áp dụng vào phân tích hàm lượng stevioside trong các mẫu cỏ ngọt<br /> thu mua ở các nguồn khác nhau. Kết quả cho thấy hàm lượng của stevioside trong cỏ ngọt thay<br /> đổi nhiều giữa các mẫu (dao động 6,44 - 33,97 mg/g tùy theo nguồn thu hái).<br /> * Từ khóa: Cỏ ngọt; Stevioside; HPLC.<br /> <br /> DETERMINATION OF STEVIOSIDE IN STEVIA REBAUDIANA<br /> BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY<br /> SUMMARY<br /> A new and simple high performance liquid chromatography method for the quantitative analysis<br /> of stevioside in Stevia (Stevia rebaudiana) was developed and fully validated. The method was<br /> applied to analyze stevioside in Stevia. The results showed that the content of stevioside was<br /> highly fluctuated among samples collected from markets.<br /> * Key words: Stevia; Stevioside; HPLC.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) là dược liệu<br /> có nguồn gốc từ Paraguay, được nhập<br /> nội và trồng phổ biến ở Việt Nam [1]. Lá<br /> cỏ ngọt chứa một số glycoside loại diterpen [2], có độ ngọt gấp 300 lần đường<br /> mía. Cỏ ngọt có vị ngọt rất đậm, có ích<br /> cho người đái tháo đường và béo phì [1].<br /> Dịch chiết cỏ ngọt cho nhiều tác dụng<br /> dược lý tốt như điều hòa huyết áp [3], hạ<br /> <br /> đường huyết [4], kháng khuẩn [5] và hoạt<br /> tính thụ thai [6].<br /> Stevioside là hoạt chất chính trong cỏ<br /> ngọt với hàm lượng cao và độ ngọt mạnh.<br /> Hiện nay, Học viện Quân y đang bào chế<br /> một số chế phẩm có sử dụng nguyên liệu<br /> từ cỏ ngọt. Hàm lượng hoạt chất bị ảnh<br /> hưởng bởi nhiều yếu tố như nguồn gốc,<br /> thu hái, đất trồng, mùa thu hoạch và cách<br /> chế biến. Để đảm bảo chất lượng cho các<br /> sản phẩm, việc tiêu chuẩn hóa nguyên liệu<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Cục Y tế, Bộ Công an<br /> Người phản hồi (Corresponding): Vò B×nh D-¬ng (vbduong2978@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 15/02/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/04/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 15/04/2014<br /> <br /> 13<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> đầu vào rất quan trọng. Với mục đích góp<br /> phần tiêu chuẩn hóa nguyên liệu cỏ ngọt<br /> ở Việt Nam, tiến hành xây dựng và thẩm<br /> định phương pháp định lượng stevioside<br /> trong cỏ ngọt bằng HPLC. Đồng thời, ứng<br /> dụng phương pháp để đánh giá hàm<br /> lượng của Stevioside trong một số mẫu<br /> cỏ ngọt thu mua trên thị trường.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Hóa chất và thiết bị.<br /> * Hóa chất và nguyên vật liệu:<br /> Stevioside chuẩn (98%, Sigma Andrich).<br /> Acetonitrile, methanol, nước cất, axít<br /> phosphoric đạt tiêu chuẩn cho sắc ký lỏng<br /> hiệu năng cao, các hóa chất khác đạt tiêu<br /> chuẩn phân tích.<br /> * Thiết bị:<br /> Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu,<br /> bao gồm bơm LC-20AD, detector SPD-20A<br /> UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-20A (Shimadzu,<br /> Nhật Bản).<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Điều kiện sắc ký:<br /> Cột: cột phân tích pha đảo Optimapak<br /> C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm), Công ty<br /> RStech Corp, Hàn Quốc; bước sóng phát<br /> hiện 200 nm; pha động gồm dung dịch<br /> axít phosphoric 0,1% trong nước và<br /> acetonitrile với chương trình đẳng dòng<br /> 33% B trong 30 phút; tốc độ dòng 1,0<br /> ml/phút, thể tích tiêm 10 μl.<br /> * Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử:<br /> Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn gốc được<br /> chuẩn bị bằng cách hòa tan stevioside<br /> vào hỗn hợp methanol:nước (50:50) để<br /> <br /> có nồng độ 2,5 mg/ml. Các dung dịch<br /> chuẩn làm việc được chuẩn bị bằng cách<br /> pha loãng dung dịch gốc stevioside đến<br /> nồng độ thích hợp.<br /> Mẫu thử: cỏ ngọt khô được nghiền tới<br /> bột mịn, cho qua rây, trộn đều, cân chính<br /> xác 1,0 gram bột, cho vào bình định mức<br /> 10 ml, thêm hỗn hợp methanol:nước<br /> (30:70), lắc đều, bổ sung 30% methanol<br /> tới vạch. Cân chính xác khối lượng, chiết<br /> siêu âm trong 60 phút ở 30oC, lấy ra, cân<br /> lại và bổ sung hỗn hợp methanol: nước<br /> (30:70) tới khối lượng ban đầu, lắc kỹ, lọc<br /> qua màng 0,45 µm, dịch lọc được dùng<br /> để tiêm mẫu.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> Với điều kiện sắc ký và phương pháp<br /> xử lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thu<br /> được cho các pic tách rõ ràng, nhiễu nền<br /> thấp thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu thử<br /> cỏ ngọt và mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ,<br /> mẫu thử có thời gian lưu trùng với thời gian<br /> lưu của pic stevioside trong sắc ký đồ của<br /> mẫu chuẩn với thời gian lưu 6,48 phút<br /> (hình 1). Tại thời gian lưu pic stevioside<br /> trên sắc đồ mẫu thử và mẫu chuẩn, đã so<br /> sánh phổ hấp thụ UV thu được của pic.<br /> Kết quả cho thấy phổ mẫu thử và mẫu<br /> chuẩn trùng khít lên nhau với hệ số phù<br /> hợp 0,9998. Điều này chứng tỏ: pic thu<br /> được trên sắc ký đồ của mẫu thử tinh<br /> khiết và các thành phần khác có trong<br /> mẫu thử không ảnh hưởng đến quá trình<br /> phân tích stevioside, qua đó cho phép<br /> tiến hành định tính, định lượng.<br /> 15<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ của chuẩn stevioside (a) và mẫu cỏ ngọt (b).<br /> 1. Lựa chọn bƣớc sóng.<br /> Các bước sóng khác nhau được đánh giá tỷ lệ tín hiệu/nhiễu của pÝc chuẩn stevioside<br /> và bước sóng tối ưu là bước sóng có tỷ lệ tín hiệu/nhiễu cao nhất.<br /> Bảng 1: Tỷ lệ tín hiệu/nhiễu của stevioside tại các bước sóng khác nhau.<br /> BƯỚC SÓNG (nm)<br /> <br /> TÍN HIỆU/NHIỄU<br /> <br /> 200<br /> <br /> 175.312,53<br /> <br /> 210<br /> <br /> 89.474,10<br /> <br /> 220<br /> <br /> 12.780,53<br /> <br /> 230<br /> <br /> 2.981,40<br /> <br /> 240<br /> <br /> 959,38<br /> <br /> 250<br /> <br /> 230,00<br /> <br /> 260<br /> <br /> 88,38<br /> <br /> 270<br /> <br /> 79,55<br /> <br /> 2. Tính tƣơng thích của hệ thống sắc ký.<br /> Tính tương thích hệ thống sắc ký được khảo sát dựa vào việc phân tích 5 lần một<br /> mẫu chuẩn trên máy HPLC với cùng điều kiện đã nêu. Đánh giá dựa vào sai số tương<br /> đối và độ lệch chuẩn tương đối của 5 phép thử song song đối với thời gian lưu, diện<br /> tích píc.<br /> 16<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> Bảng 2: Kết quả đánh giá tính tương thích của hệ thống sắc ký.<br /> STEVIOSIDE (250 µg/ml)<br /> <br /> THỜI GIAN LƯU (phút)<br /> <br /> DIỆN TÍCH PÍC<br /> <br /> 1<br /> <br /> 6,484<br /> <br /> 1,555,114<br /> <br /> 2<br /> <br /> 6,481<br /> <br /> 1,554,135<br /> <br /> 3<br /> <br /> 6,487<br /> <br /> 1,555,790<br /> <br /> 4<br /> <br /> 6,480<br /> <br /> 1,554,100<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6,482<br /> <br /> 1,553,481<br /> <br /> X<br /> <br /> 6,483<br /> <br /> 1,554,524<br /> <br /> SD<br /> <br /> 0,003<br /> <br /> 917,851<br /> <br /> RSD(%)<br /> <br /> 0,042<br /> <br /> 0,059<br /> <br /> 3. Phƣơng trình đƣờng chuẩn, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng<br /> (LOQ).<br /> Hòa tan stevioside trong hỗn hợp methanol:nước (50:50) để được nồng độ 2.500<br /> µg/ml (dung dịch chuẩn mẹ dùng pha dung dịch chuẩn làm việc). Dung dịch chuẩn làm<br /> việc được pha loãng tới nồng độ thích hợp để thiết lập đường chuẩn về mối tương<br /> quan giữa diện tích pic stevioside với nồng độ. Xây dựng phương trình tuyến tính<br /> được dưới dạng y = ax + b, trong đó y là diện tích píc và x là nồng độ stevioside. Đối<br /> với giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ), hòa loãng dung dịch chuẩn<br /> mẹ với nước cất nồng độ thích hợp và tiêm vào hệ thống HPLC để phân thích. Đánh<br /> giá LOD dựa trên pic thấp nhất có thể phát hiện trên sắc đồ có giá trị tỷ lệ tín<br /> hiệu/nhiễu bằng 3. Đánh giá LOQ dựa trên nồng độ thấp nhất có thể định lượng được<br /> có giá trị tín hiệu/nhiễu bằng 10.<br /> <br /> l<br /> <br /> Hình 3: Đường chuẩn của stevioside.<br /> 17<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> Bảng 3: Phương trình đường chuẩn, độ tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn<br /> định lượng của stevioside.<br /> GIÁ TRỊ<br /> <br /> THAM SỐ<br /> Hệ số góc<br /> <br /> 5,95<br /> <br /> Intercept (giao trục tung)<br /> <br /> -1,12<br /> <br /> Hệ số tuyến tính<br /> <br /> 0,9998<br /> <br /> LOQ (µg/ml)<br /> <br /> 0,47<br /> <br /> LOD (µg/ml)<br /> <br /> 0,14<br /> <br /> Khoảng tuyến tính (µg/ml)<br /> <br /> 1,0 - 500,0<br /> <br /> 4. Độ thu hồi.<br /> Thực hiện thí nghiệm độ thu hồi để đánh giá mức độ chính xác của phương pháp<br /> bằng cách thêm một lượng xác định chuẩn vào mẫu thử đã biết trước hàm lượng. Hỗn<br /> hợp được chiết và phân tích ngay. Chuẩn bị chất chuẩn thêm vào ở 3 nồng độ khác<br /> nhau, tại mỗi nồng độ, tiến hành lặp lại 5 lần.<br /> Bảng 4: Độ thu hồi của stevioside.<br /> CHẤT<br /> <br /> Stevioside<br /> <br /> THÊM (µg/ml)<br /> <br /> PHÁT HIỆN (µg/ml)<br /> <br /> ĐỘ THU HỒI<br /> TRUNG BÌNH (%)<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 0,0<br /> <br /> 155,5<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 5,0<br /> <br /> 160,3<br /> <br /> 96,0<br /> <br /> 3,87<br /> <br /> 25,0<br /> <br /> 180,8<br /> <br /> 101,2<br /> <br /> 2,67<br /> <br /> 50,0<br /> <br /> 205,9<br /> <br /> 100,8<br /> <br /> 1,52<br /> <br /> 5. Độ đúng và độ độ lặp lại.<br /> Độ đúng và độ lặp lại trong ngày thực hiện bằng cách phân tích dung dịch mẫu đã<br /> biết trước nồng độ 5 lần/ngày. Độ đúng và độ lặp lại giữa các ngày thực hiện bằng<br /> cách phân tích dung dịch mẫu đã biết trước nồng độ trong 5 ngày liên tiếp.<br /> Bảng 5: Độ đúng và độ lặp lại của stevioside.<br /> CHẤT<br /> <br /> Stevioside<br /> <br /> TRONG NGÀY (n = 5)<br /> NỒNG ĐỘ<br /> BIỂU KIẾN Nồng độ phát hiện Độ đúng<br /> (µg/ml)<br /> (µg/ml<br /> <br /> GIỮA CÁC NGÀY (n = 5)<br /> <br /> Mean ± SD, n = 5<br /> <br /> (%)<br /> <br /> Độ lặp<br /> (%)<br /> <br /> Nồng độ phát hiện<br /> (µg/ml)<br /> Mean ± SD, n = 5<br /> <br /> Độ đúng<br /> (%)<br /> <br /> Độ lặp<br /> (%)<br /> <br /> 100,0<br /> <br /> 100,93 ± 2,65<br /> <br /> 100,93<br /> <br /> 2,62<br /> <br /> 100,55 ± 2,68<br /> <br /> 100,55<br /> <br /> 2,67<br /> <br /> 50,0<br /> <br /> 50,37 ± 1,23<br /> <br /> 100,74<br /> <br /> 2,44<br /> <br /> 50,94 ± 1,49<br /> <br /> 101,88<br /> <br /> 2,92<br /> <br /> 25,0<br /> <br /> 24,81 ± 1,16<br /> <br /> 99,24<br /> <br /> 4,64<br /> <br /> 24,73 ± 1,37<br /> <br /> 98,92<br /> <br /> 5,54<br /> <br /> 6. Độ ổn định.<br /> Độ ổn định trong thời gian ngắn: đánh giá độ ổn định ở nhiệt độ phòng sau 4 - 24<br /> giờ (tùy thuộc vào khoảng thời gian xử lý phân tích mẫu trong ngày). Pha mẫu chuẩn<br /> làm việc có nồng độ 100, 50, 10 µg/ml. Tiến hành định lượng tại các thời điểm 0, 1, 5,<br /> 10, 15, 30 ngày. Để xác định độ ổn định của mẫu thử, tiến hành chiết mẫu, bảo quản<br /> và phân tích mẫu đó tại thời điểm như trường hợp mẫu chuẩn.<br /> 18<br /> <br />