Nghiên cứu đột biến ở gen MUTYH trên mô hình cấu trúc protein 3D

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN Ở GEN MUTYH TRÊN MÔ HÌNH CẤU TRÚC<br /> PROTEIN 3D<br /> Nguyễn Hữu Huy*, Lê Minh Khôi**, Nguyễn Thị Băng Sương**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Protein MUTYH là enzyme DNA glycosylase có vai trò quan trọng trong hệ thống sửa chữa cắt bỏ<br /> base giúp ngăn chặn các đột biến do các gốc oxy hóa tự do. Các đột biến ở gen MUTYH gây nên bệnh đa polyp<br /> liên quan đến gen MUTYH (MAP - MUTYH -associated polyposis) dẫn đến ung thư đại trực tràng. Hầu hết các<br /> đột biến trên gen MUTYH là đột biến điểm nên phương pháp hiệu quả nhất để phát hiện đột biến là giải trình tự.<br /> Hiện nay, đánh giá ảnh hưởng của đột biến lên chức năng protein là rất cần thiết để hiểu rõ mối tương quan giữa<br /> kiểu gen/kiểu hình và để tìm ra các biện pháp chữa trị.<br /> Mục tiêu: Phát hiện đột biến ở gen MUTYH và dự đoán ảnh hưởng của đột biến lên chức năng protein<br /> MUTYH.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Thực hiện giải trình tự gen MUTYH cho 28 bệnh nhân. Sử dụng<br /> các phần mềm sinh tin học để đánh giá tác động của đột biến.<br /> Kết quả: Phát hiện 2 đột biến c.384 T>A, c.536 A>G và đánh giá tác động của đột biến lên protein MUTYH<br /> Kết luận: Chúng tôi đã ứng dụng thành công quy trình chẩn đoán đột biến gen MUTYH và sử dụng các<br /> phần mềm sinh tin học để xây dựng mô hình cấu trúc 3D protein MUTYH, từ đó đưa ra một số dự đoán về ảnh<br /> hưởng của đột biến.<br /> Từ khoá: MUTYH, Mô hình cấu trúc protein 3D.<br /> ABSTRACT<br /> INVESTIGATION OF MUTATIONS OF THE MUTYH GENE INPROTEIN 3D STRUCTURE<br /> MODELLING<br /> Nguyen Huu Huy, Le Minh Khoi, Nguyen Thi Bang Suong<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - Supplement of No 1 - 2016: 75 - 79<br /> <br /> Introduction: MUTYH glycosylase, involved in base excision repair, prevents mutations associated with<br /> oxidative damage. Mutations in the MUTYH gene are known to cause MUTYH-associated polyposis (MAP) and<br /> lead to colorectal cancer. Most of the mutations in the MUTYH gene are point mutations therefore the most<br /> effective mutation detection method is sequencing.Evaluating functional effects of mutations is essential for<br /> understanding genotype/phenotype relations and for curing diseases.<br /> Objective: Detect a mutation and predict effect of the mutation on a protein funtions.<br /> Materials and Methods: DNA genome of 28 patients, have the MUTYH gene was sequenced<br /> Bioinformatic software is used to predict effects of the mutation.<br /> Results: Detect c.384 T>A,c.536 A>G mutations on MUTYH gene and analyse effects of these mutations on<br /> MUTYH protein.<br /> Conclusion: In this study, based on some bioinformatics softwares about protein three-dimesion (3D)<br /> modelling, we brought out predictions about effects and influences of two mutations of the MUTYH gene.<br /> Keywords: MUTYH, Protein 3D structure modeling.<br /> <br /> * Đại học Khoa học tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh ** Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc :: PGS TS. Nguyễn Thị Băng Sương ĐT: 0914007038 Email: suongnguyenmd@gmail.com<br /> Khoa học Cơ bản 75<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016<br /> <br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ công cụ sinh tin học hỗ trợ cho việc phân tích<br /> đột biến ở mức độ insilico được phát triển dựa<br /> Gen MUTYH (mutY Homolog (E.coli)) nằm<br /> vào mô hình cấu trúc không gian protein 3D<br /> trên nhiễm sắc thể số 1 ở vị trí 1p34.3-p32.1, dài<br /> với mục tiêu xác định mối liên hệ giữa đột<br /> 11,2 kb và có 16 exon. Gen MUTYH mã hóa cho<br /> biến và tình trạng bệnh lý.Từ cơ sở đó, chúng<br /> enzyme glycosylase MUTYH có chức năng sửa<br /> tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu nhằm mục<br /> chữa DNA bị hư hại do oxy hóa theo cơ chế sửa<br /> tiêu: Phát hiện đột biến ở gen MUTYH và dự đoán<br /> sai cắt bỏ base. Ở người, gốc tự do 8-oxo7,8-<br /> ảnh hưởng của đột biến lên chức năng protein<br /> dihydro2'deoxyguanosine (8-oxo-dG) có xu<br /> MUTYH.<br /> hướng bắt cặp với với adenine thay vì với<br /> cytosine dẫn đến tạo thành đột biến đảo chuyển ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> G:C>T:A. MUTYH có chức năng cắt bỏ base Đối tượng nghiên cứu.<br /> adenine là bước đầu tiên trong hệ thống sửa 28 bệnh nhân đa polyp đại trực tràng không<br /> chữa cắt bỏ base giúp ngăn chặn đột biến đảo<br /> phát hiện đột biến gen APC được tiếp tục tiến<br /> chuyển G:C>T:A (2,7). Nhiều nghiên cứu đã chứng<br /> hành giải trình tự gen MUTYH tại Trung tâm Y<br /> minh các đột biến dòng mầm làm suy giảm chức<br /> sinh học phân tử, trường Đại học Y dược<br /> năng của gen MUTYH sẽ làm tích lũy các đột<br /> TP.HCM.<br /> biến soma tại gen Kras và APC dẫn đến ung thư<br /> đại trực tràng. Đột biến ở gen MUTYH sẽ gây ra<br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> bệnh đa polyp liên quan đến gen MUTYH (MAP Tách chiết DNA genome từ mẫu máu<br /> - MUTYH -associated polyposis)(4). Biểu hiện lâm Mẫu máu xử lý chống đông bằng EDTA,<br /> sàng của bệnh là có từ 10 đến vài trăm polyp ở tách chiết trong 24 giờ. Quy trình tách chiết DNA<br /> đại trực tràng, nếu không được điều trị thì nguy genome từ 200 µl máu ngoại vi được tiến hành<br /> cơ mắc ung thư đại trực tràng là 43 - 100%(3). Tuy theo QiAgen Kit. Đo nồng độ và độ tinh sạch của<br /> nhiên do triệu chứng bệnh rất giống với bệnh đa DNA tách chiết, những mẫu có tỷ lệ giá trị mật<br /> polyp tuyến gia đình do đột biến dòng mầm ở độ quang ở bước sóng 260/280 nm đạt từ 1,8 đến<br /> gen APC nên bệnh nhân bị đa polyp đại trực 2,0 được dùng để tiến hành phản ứng PCR và<br /> tràng cần kiểm tra đột biến dòng mầm ở cả 2 gen giải trình tự gen.<br /> APC và MUTYH(6).<br /> Kĩ thuật giải trình tự gen<br /> Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về Tiến hành phản ứng PCR khuếch đại 16<br /> các đột biến trên gen MUTYH. Ước tính đã có exon của gen MUTYH bằng 9 cặp mồi<br /> 303 đột biến trên gen MUTYH được ghi nhận Các thành phần phản ứng bao gồm: Mồi<br /> trên cơ sở dữ liệu Leiden Open Variations xuôi 0,2 µM, Mồi ngược 0,2 µM, đệm PCR 1X,<br /> Database (http://www.LOVD.nl). Các đột biến MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,2 mM, TakaraTaq 0,5U,<br /> trên gen MUTYH chủ yếu là đột biến điểm DNA genome bản mẫu 1 µl trong tổng thể tích<br /> nằm rải rác trong suốt chiều dài gen nên giải 15 µl.<br /> trình tự 16 exon và vùng intron liền kề được<br /> xem là phương pháp tiêu chuẩn trong chẩn Chu trình nhiệt: Biến tính ở 980C trong 5<br /> đoán bệnh MAP. Các nghiên cứu trong và phút, sau đó là 30 chu kỳ gồm 980C trong 10 giây;<br /> ngoài nước hiện nay không chỉ dừng lại ở mức 580C trong 30 giây; 720C trong 1 phút, và giai<br /> tầm soát đột biến mà đang hướng tới việc tìm đoạn kết thúc gồm 720C trong 5 phút.<br /> hiểu tác động của đột biến lên chức năng Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự<br /> protein, đặc biệt trong nghiên cứu các bệnh lý từng đoạn sản phẩm khuếch đại<br /> di truyền và ung thư. Hiên nay, đã có nhiều<br /> <br /> <br /> <br /> 76 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Phân tích kết quả giải trình tự và dự đoán tác<br /> động của đột biến<br /> Kết quả giải trình tự được phân tích bằng<br /> phần mềm CLC Main Workbench v5.5 và so<br /> sánh với trình tự gen MUTYH lấy từ Genbank.<br /> Sử dụng các phần mềm Swissmodel<br /> (http://Swissmodel.expasy.org/interactive),<br /> Pymol, Coot để xây dựng và phân tích cấu trúc<br /> 3D protein đột biến, phần mềm mCSM<br /> (http://bleoberis.bioc.cam.ac.uk/mcsm/stability_p<br /> Hình 2. Kết quả giải trình tự Exon 7 của bệnh nhân<br /> rediction) được sử dụng để tính toán ảnh hưởng<br /> FAP47<br /> của đột biến sai nghĩa lên cấu trúc và tương tác<br /> protein. Nhận xét: Trong quá trình giải trình tự exon<br /> 7 của bệnh nhân FAP47 đã phát hiện tại vị trí<br /> KẾT QUẢ<br /> c.536 là Nucleotide G trong khi đó trình tự<br /> Kết quả giải trình tự Genbank vị trí này là A. Điều này chứng tỏ bệnh<br /> nhân có đột biến đồng hợp tại vị trí c.536 A>G,<br /> Trong tổng số 51 bệnh nhân đa polyp đại<br /> làm thay đổi amino acid Tyrosine thành Cystein<br /> trực tràng, chúng tôi tiến hành giải trình tự gen<br /> tại vị trí 179 của protein MUTYH (p.Y179C).<br /> MUTYH cho 28 bệnh nhân không tìm thấy đột<br /> biến gen APC và phát hiện 2 bệnh nhân có đột Kết quả phân tích đột biến<br /> biến. Đột biến p.Y128X<br /> Để phân tích ảnh hưởng của đột biến<br /> p.Y128X chúng tôi sử dụng phần mềm<br /> Swissmodel để xây dựng mô hình cấu trúc 3D<br /> đầy đủ của protein MUTYH bình thường và<br /> protein MUTYH bị đột biến p.Y128X.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Kết quả giải trình tự Exon 4 của bệnh nhân<br /> FAP23<br /> Nhận xét: Trong quá trình giải trình tự<br /> exon 4 của bệnh nhân FAP23 đã phát hiện tại vị<br /> trí c.384 là Nucleotide A trong khi đó trình tự<br /> Genbank vị trí này là T. Điều này chứng tỏ bệnh<br /> Hình 3. Cấu trúc protein MUTYH đột biến p.Y128X<br /> nhân có đột biến đồng hợp tại vị trí c.384 T>A,<br /> làm thay đổi amino acid Tyrosine thành stop (Vùng cấu trúc màu đỏ là vùng còn lại và<br /> codon tại vị trí 128 của protein MUTYH vùng màu xanh là vùng bị mất đi)<br /> (p.Y128X). Nhận xét: Khi so sánh với cấu trúc đầy đủ<br /> của protein MUTYH thì đột biến p.Y128X ảnh<br /> hưởng nghiêm trọng đến cấu trúc của protein.<br /> <br /> <br /> Khoa học Cơ bản 77<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016<br /> <br /> Đột biến tạo stop codon tại exon 4 đã làm mất đi Tyr88 và nguyên tử OG của Ser308. Tyr88 đồng<br /> hầu hết vùng domain xúc tác và toàn bộ vùng thời cũng tạo liên kết hydro với O4’ của 8-oxoG.<br /> domain giúp nhận biết 8-oxoG nằm ở đầu C Ở protein MUTYH thì amino acid Tyr179 sẽ hình<br /> khiến protein MUTYH bị mất chức năng nhận thành liên kết hydro với Ser447 tương tự như ở<br /> biết và cắt bỏ base adenine bắt cặp sai với 8- protein MutY. Vị trí Ser447 ở protein MUTYH<br /> oxoG. tương ứng với Ser308 ở protein MutY của<br /> Đột biến p.Y128X Bacillus stearothermophilus.<br /> Để phân tích ảnh hưởng của đột biến (8-oxoG: màu hồng, Cys88 và Ser308 của<br /> p.Y179C, ngoài sử dụng cấu trúc protein MutY màu xanh, Cys179 và Ser447 của MUTYH:<br /> MUTYH được dựng bằng Swissmodel chúng tôi màu đỏ)<br /> sử dụng thêm cấu trúc protein MutY của Bacillus<br /> stearothermophilus (3G0Q) bởi vì cấu trúc này<br /> gồm protein MutY đang liên kết với mạch đôi<br /> DNA chứa 8-oxoG. Chúng tôi tiến hành chồng<br /> cấu trúc (superimpose) protein MUTYH và<br /> protein MutY. Vị trí đột biến p.Y179C ở protein<br /> MUTYH tương ứng với p.Y88C ở protein MutY.<br /> Phần mềm Pymol được sử dụng để mô phỏng<br /> protein MUTYH bị đột biến và phân tích ảnh<br /> hưởng của đột biến lên cấu trúc protein.<br /> <br /> Hình 5. So sánh cấu trúc protein MutY đột biến<br /> p.Y88C và protein MUTYH p.Y179C<br /> Nhận xét: Ở protein MutY, khi Tyr88 đột<br /> biến thành Cys88 thì khoảng cách giữa Cys88<br /> cách xa Ser308 (tăng từ 3,4 lên 6,3Å) nên không<br /> còn tạo thành liên kết hydro giúp ổn định liên<br /> kết giữa Ser308 và 8-oxoG vì thế ảnh hưởng trực<br /> tiếp đến chức năng của protein MutY. Tương tự<br /> như vậy ở protein MUTYH khi Tyr179đột biến<br /> thành Cys179 thì khoảng cách giữa Cys179 cách<br /> Hình 4. So sánh cấu trúc protein MutY và protein xa Ser447 (tăng từ 2,9 lên 6Å) nên không còn tạo<br /> MUTYH thành liên kết hydro giúp ổn định liên kết giữa<br /> (8-oxoG: màu hồng, Tyr88 và Ser308 của Ser447 và 8-oxoG vì thế sẽ ảnh hưởng trực tiếp<br /> MutY màu xanh, Tyr179 và Ser447 của MUTYH: đến chức năng của protein MUTYH.<br /> màu đỏ) Khi kiểm tra sự ổn định của cấu trúc protein<br /> Nhận xét: Để nhận biết cơ chất 8-oxoG cần MUTYH chứa đột biến Y179C, công cụ<br /> có sự tương tác giữa nhiều amino acid trong mCSMcho thấy chỉ số Delta-Delta-G của đột biến<br /> vùng xúc tác cũng như vùng đầu C. Ở protein Y179C là -0.366 Kcal/mol làm giảm độ bền của<br /> MutY, bề mặt Hoogsteen (chứa nguyên tử N7) protein. Chúng tôi cũng sử dụng công cụ mCSM<br /> của 8-oxoG được nhận biết bởi liên kết hydro để kiểm tra ảnh hưởng lên tương tác protein-<br /> giữa nguyên tử N7 của 8-oxoGvà nguyên tử OG protein thì chỉ số Delta-Delta-G của đột biến<br /> của Ser308, liên kết này được định hướng và ổn Y179C là -0.442 Kcal/mol làm giảm tương tác<br /> định nhờ liên kết hydro giữa nhóm OH của protein-protein. Đồng thời đột biến cũng ảnh<br /> <br /> <br /> 78 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> hưởng lên tương tác protein-DNAvì Delta-Delta- Swissmodel. Đây là chương trình thực hiện việc<br /> G của đột biến Y179C là -0.237 Kcal/mol làm xây dựng cấu trúc không gian 3D của protein<br /> giảm tương tác protein - DNA. dựa trên các cấu trúc tương đồng biết trước.<br /> BÀN LUẬN Swissmodel được phát triển từ năm 1993 và đã<br /> trở thành một công cụ hiệu quả trong việc xây<br /> Hệ thống sửa chữa cắt bỏ base (Base excision dựng mô hình cấu trúc 3D protein(5). Từ cấu trúc<br /> repair – BER) là hệ thống quan trọng bảo vệ sự protein MUTYH có được, các phần mềm insilico<br /> toàn vẹn của DNA trước các tác nhân oxy hóa khác như Coot, Pymol tiếp tục được sử dụng để<br /> ROS. BER được bắt đầu bởi DNA glycosylase thực hiện chồng cấu trúc protein (superimpose),<br /> nhận biết base bị oxy hóa và cắt bỏ nucleotide bị mô phỏng đột biến trên cấu trúc protein<br /> hư hỏng, cho phép khôi phục lại chuỗi DNA ban MUTYH. Dựa vào đó, chúng tôi đã phân tích<br /> đầu nhờ hoạt động của endonuclease, được ảnh hưởng của 2 đột biến p.Y179C và<br /> polymerase, và ligases. Một chất oxy hóa gây đột p.Y128X lên cấu trúc không gian của protein<br /> biến rất phổ biến là 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8- cũng như những thay đổi về liên kết hydro trong<br /> oxoguanine or 8-oxoG) có thể bắt cặp với cả C và cấu trúc bậc 2 của protein MUTYH.<br /> A. Nếu không được sửa chữa kịp thời thì trong<br /> lần sao chép tiếp theo sẽ gây ra đột biến đảo KẾT LUẬN<br /> chuyển G-C thành T-A. Protein MUTYH là một Nghiên cứu đã ứng dụng thành công qui<br /> glycosylase DNA có thể nhận ra và loại bỏ trình chẩn đoán đột biến gen MUTYH và sử<br /> adenine bắt cặp sai với 8-oxoG, hoặc 2-OH- dụng mô hình hóa cấu trúc không gian 3D của<br /> adenine khởi sự con đường BER. Các đột biến protein MUTYH để nghiên cứu tác động của 2<br /> trên gen MUTYH sẽ gây ảnh hưởng đến chức đột biến phát hiện trên gen này. Các đột biến<br /> năng của protein MUTYH làm tích lũy các đột này đã ảnh hưởngđến cấu trúc protein của gen<br /> biến trong bộ gen gây ung thư đại trực tràng và MUTYH, từ đó có thể ảnh hưởng tới chức năng<br /> tăng nguy cơ mắc nhiều loại ung thư khác. Đột và dẫn đến biểu hiện bệnh.<br /> biến gen MUTYH là đột biến gen lặn trên nhiễm TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> sắc thể thường vì thế các trường hợp biểu hiện 1. Cleary, Sean P, et al (2009), “Germline MutY human homologue<br /> bệnh đều là người có đột biến đồng hợp hoặc mutations and colorectal cancer: a multisite case-control study”,<br /> Gastroenterology, 136(4), 1251-1260<br /> đột biến dị hợp kép. 2 đột biến phổ biến nhất là 2. David SS et al (2007), “Base-excision repair of oxidative DNA<br /> c.536A>G (p.Y179C) ở exon 7 và c.1187G>A damage”, Nature, 447: 941–950<br /> 3. Kim DW, Kim IJ, Kang HC, et al (2007), “Germline mutations of the<br /> (p.G396D) ở exon 13, là đột biến sai nghĩa chiếm MYH gene in Korean patients with multiplecolorectal adenomas”. Int<br /> tỷ lệ 1%-2% dân số, chiếm đến 90% đột biến gen J Colorectal Dis, 22:1173–8.<br /> 4. Nielsen M, Morreau H, Vasen HF, et al (2011), “MUTYH-associated<br /> MUTYH ở quần thể người Bắc Âu(4). Các đột polyposis (MAP)”. Crit Rev Oncol Hematol, 79 (1): 1-16.<br /> 5. Schwede T, Kopp J, Guex N, & Peitsch MC (2003),“SWISS-<br /> biến trên gen MUTYH chủ yếu là đột biến sai MODEL: an automated protein homology-modeling server”, Nucleic<br /> nghĩa dẫn đến thay đổi acid amin này thành acid acids research, 31(13): 3381-3385.<br /> 6. Sieber OM, Lipton L, Crabtree M, et al (2003), “Multiple colorectal<br /> min khác, hiếm gặp hơn là các đột biến mất hoặc adenomas, classic adenomatous polyposis, and germ-line mutations<br /> thêm cặp Nu và đột biến vô nghĩa. in MYH”, N Engl J Med, 348(9):791–799.<br /> 7. Ushijima Y, Tominaga Y, Miura T, Tsuchimoto D, Sakumi K,<br /> Khi tiến hành giải trình tự trên bệnh nhân đa Nakabeppu Y (2005), “A functional analysis of the DNA glycosylase<br /> activity of mouse MUTYH protein excising 2-hydroxyadenine<br /> polyp đại trực tràng ở Việt Nam chúng tôi đã opposite guanine in DNA”, Nucleic Acids Res, 33(2):672-82.<br /> phát hiện 2 đột biến p.Y179C và p.Y128X. Đột<br /> biến p.Y128X đã được Cleary công bố trên tạp Ngày nhận bài báo: 20/11/2015<br /> chí Gastroenterology vào năm 2009(1). Chúng tôi Ngày phản biện nhận xét bài báo: 25/11/2015<br /> đã tiến hành mô hình hóa cấu trúc không gian Ngày bài báo được đăng: 01/03/2016<br /> 3D của protein MUTYH bằng phần mềm<br /> <br /> <br /> <br /> Khoa học Cơ bản 79<br />