TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 88-93<br />
<br />
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG<br />
VI KHUẨN PHÂN HỦY 1,2-DICLOROETHANE PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM<br />
Phạm Thị Vui, Phạm Thị Hoa, Phạm Bảo Yên, Nguyễn Quang Huy*<br />
Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, *huynq17@gmail.com<br />
TÓM TẮT: 1,2-dicholoroethane (1,2-DCE) là một hoạt chất có trong các thuốc bảo vệ thực vật và là chất<br />
có khả năng gây ung thư đối với người và gây ô nhiễm cho môi trường. Việc loại bỏ 1,2-DCE trong môi<br />
trường được tiến hành bằng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó, bằng phương pháp sinh học thông<br />
qua việc sử dụng các vi khuẩn có trong tự nhiên mang lại hiệu quả kinh tế và tính bền vững cao. Từ các<br />
mẫu đất và nước thải thu được ở các khu vực có sử dụng thuốc bảo vệ thực vật tại Hà Nội, chúng tôi đã<br />
phân lập được 45 chủng vi khuẩn trên môi trường khoáng bổ sung 1,2-DCE là nguồn cacbon duy nhất.<br />
Hai chủng vi khuẩn ký hiệu R9, S15 được xác định là các chủng có hoạt tính mạnh nhất. Dựa vào đặc<br />
điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và kết quả giải trình tự gen 16S ARNr cho<br />
thấy chủng R9 thuộc chi Klebsiella, chủng S15 thuộc chi Pseudomonas với độ tương đồng 99% với các<br />
loài trong ngân hàng gen. Chủng R9 phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ từ 23 đến 30°C, còn chủng S15 là<br />
30-37°C. Nồng độ cơ chất 1,2-DCE tối ưu cho hai chủng R9, S15 sinh trưởng là 5 mM.<br />
Từ khóa: Klebsiella, Pseudomonas, 1,2-dicholoroethane, môi trường, ô nhiễm, phân hủy, phân lập.<br />
MỞ ĐẦU<br />
<br />
Hiện nay, việc sản xuất và sử dụng các hợp<br />
chất halogen trong đó có hợp chất 1,2dichloroethane (1,2-DCE) trong các ngành<br />
công, nông nghiệp ngày một gia tăng. Hợp chất<br />
này được sử dụng trong thành phần các thuốc<br />
bảo vệ thực vật hoặc là các loại dung môi, hóa<br />
chất tổng hợp. Theo các nghiên cứu của Fetzner<br />
& Lingens (1994) [3], Olaniran et al. (2004) [6]<br />
hợp chất 1,2-DCE dễ cháy, có tính tan thấp<br />
trong nước và hầu như không thể phân hủy tự<br />
nhiên trong môi trường. Nghiên cứu của<br />
Doucette et al. (2010) [2] và Hunkeler et al.<br />
(2005) [5] cho thấy, hợp chất này có khả năng<br />
gây ung thư cho người cũng như các sinh vật<br />
trong hệ sinh thái. Các phương pháp vật lý và<br />
hóa học đã được áp dụng trong việc phân hủy<br />
1,2-DCE, thường có giá thành cao và chưa<br />
mang tính bền vững. Sử dụng phương pháp sinh<br />
học thông qua các nhóm vi sinh vật khác nhau<br />
có khả năng phân hủy 1,2-DCE trong tự nhiên<br />
là một giải pháp đang được chú ý trong thời<br />
gian gần đây [3, 10]. Các nghiên cứu của<br />
Govender & Pillay (2011) [4], Olaniran et al.<br />
(2004) [6], Song et al. (2003) [7] đều chỉ ra rằng<br />
trong tự nhiên tồn tài nhiều loài vi sinh vật có<br />
khả năng phân hủy 1,2-DCE như Bacillus<br />
subtilis,<br />
Comamonas<br />
testosterone,<br />
Pseudomonas plecoglossicida và Burkholderia<br />
88<br />
<br />
sp.. Một số loài vi khuẩn như Pseudomonas<br />
pavonacae, Xantobacter autotrophicus GJ10,<br />
Ancylobacter aquaticus có khả năng sử dụng<br />
1,2-DCE như là nguồn cacbon duy nhất trong<br />
quá trình sinh trưởng và trong chúng mang các<br />
gen mã hóa cho các enzyme phân giải 1,2-DCE<br />
[8]. Tại Việt Nam, các nghiên cứu phân lập các<br />
chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng chuyển<br />
hóa hợp chất chứa clo cũng như phân giải 1,2DCE còn chưa nhiều. Trong nghiên cứu này,<br />
chúng tôi trình bày các kết quả về phân lập một<br />
số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy 1,2DCE tại Việt Nam.<br />
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
<br />
Vật liệu<br />
Các mẫu đất và nước được thu thập từ các<br />
địa điểm: làng hoa Tây Tựu, Từ Liêm và điểm<br />
tập trung rác thải tại khu vực Cầu Diễn, Từ<br />
Liêm, Hà Nội.<br />
Chất1,2 Dichloroethane được mua của hãng<br />
Prolabo, Hoa Kỳ. Các hóa chất khác đều đạt<br />
tiêu chuẩn cho nghiên cứu.<br />
Phương pháp<br />
Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật<br />
Môi trường khoáng cơ bản (MGB) được<br />
chuẩn bị theo Hunkeler et al. (2005) [5] gồm<br />
K2HPO4.3H2O: 42,5 g; NaH2PO4.2H2O: 10 g và<br />
<br />
Pham Thi Vui, Pham Thi Hoa, Pham Bao Yen, Nguyen Quang Huy<br />
<br />
(NH4)2SO4: 20 g; nước cất 1 lít. Thành phần các<br />
nguyên tố vi lượng được chuẩn bị ở nồng độ<br />
gấp 10 lần (10X) bổ sung vào MGB bao gồm<br />
MgSO4.7H2O: 2 g; FeSO4.7H2O: 120 mg;<br />
MnSO4.4H2O: 3 mg;<br />
ZnSO4.H2O:18 mg;<br />
CoCl2.6H2O: 10 mg và nước cất 1 lít.<br />
Các chủng vi khuẩn được phân lập bằng<br />
phương pháp làm giàu: mẫu thu thập được đưa<br />
vào môi trường MGB có bổ sung các nguyên tố<br />
vi lượng và 1,2-DCE nồng độ 5 mM và nuôi<br />
cấy lắc trong 5 ngày, tốc độ lắc 160 vòng/phút ở<br />
nhiệt độ 30oC theo Govender & Pillay (2011)<br />
[4]. Cấy chuyển 1 ml dung dịch nuôi cấy sang<br />
môi trường mới và tiếp tục nuôi trong 5 ngày.<br />
Pha loãng dịch nuôi và cấy trải trên môi trường<br />
MGB thạch có bổ sung 1,2-DCE. Lựa chọn các<br />
khuẩn lạc phát triển tốt sau 24 giờ cho các<br />
nghiên cứu tiếp theo.<br />
Phương pháp đo vòng sinh trưởng trên môi<br />
trường MGB thạch được sử dụng kết hợp với<br />
khả năng phát triển và tạo màu trên môi trường<br />
có bromothymol blue nhằm chọn lọc các chủng<br />
có khả năng phân giải tốt 1,2-DCE. Môi trường<br />
chọn lọc có bổ sung thạch và chất chỉ thị màu<br />
bromothymol blue nồng độ 20 g L-1 được dùng<br />
trong tuyển chọn và bán định lượng khả năng<br />
phân hủy 1,2-DCE. Sự sinh trưởng của vi khuẩn<br />
được đánh giá qua mật độ quang học OD 620<br />
nm (Bionate, Anh).<br />
Hình thái và các đặc điểm sinh hóa của các<br />
chủng phân hủy 1, 2 DCE<br />
Sử dụng phương pháp nhuộm Gram để nhận<br />
biết ban đầu về hình thái và phân loại các chủng<br />
vi khuẩn. Sử dụng kit API (bioMérieux, Pháp)<br />
để xác định các đặc điểm hóa sinh. Trình tự 16S<br />
rARN của các chủng vi khuẩn phân lập được<br />
đọc trực tiếp trên máy giải trình tự được thực<br />
hiện tại công ty Macrogen (Hàn quốc). Kết quả<br />
giải trình tự được so sánh với trình tự 16S<br />
rARN các loài đã có trong ngân hàng gen quốc<br />
tế để xác định đến tên loài.<br />
Chụp ảnh kính hiển vi điện tử được thực<br />
hiện tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trường<br />
Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội.<br />
Tối ưu các điều kiện môi trường sự phát triển<br />
của vi khuẩn<br />
Các chủng nghiên cứu được nuôi cấy trong<br />
<br />
môi trường MGB bổ sung thêm cao nấm men<br />
0,1% ở các nhiệt độ 16oC, 23oC, 30oC và 37oC.<br />
Nồng độ cơ chất 1,2-DCE được thí nghiệm từ 5<br />
đến 20 mM trong môi trường. Đánh giá khả<br />
năng phát triển sau thời gian 48 giờ.<br />
Khả năng phân hủy hợp chất clo (1,2-DCE)<br />
Khả năng phân hủy hợp chất 1,2-DCE được<br />
xác định gián tiếp thông qua hàm lượng Cl- tạo<br />
ra trong dịch ngoại bào của vi khuẩn. Vi sinh<br />
vật sử dụng cơ chất 1,2-DCE, chúng cắt đứt liên<br />
kết giữa Cacbon và Clo giải phóng Cl-. Xác<br />
định hàm lượng Cl- ngoại bào theo phương pháp<br />
của Bergmann & Sanik (1957) [1].<br />
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br />
<br />
Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng<br />
phân hủy 1,2-DCE<br />
Từ các mẫu đất và nước thu thập tại các khu<br />
vực khác nhau sau 2 lần làm giàu liên tiếp (5<br />
ngày/lần) trên môi trường khoáng bổ sung 1,2DCE chúng tôi đã phân lập được 45 loại khuẩn<br />
lạc khác nhau ký hiệu từ R1 đến R15 và từ S1<br />
đến S30. Các chủng phân lập đều có hình thái<br />
khuẩn lạc dạng tròn hoặc dẹt, màu sắc chủ yếu<br />
là màu trắng đục hoặc trong, một số có hình<br />
dạnh bông. Trong số 45 chủng phân lập các<br />
chủng ký hiệu R7, R9, R15 và S15 có khả năng<br />
phát triển tốt nhất. Tiếp tục tuyển chọn trên môi<br />
trường MGB thạch bổ sung bromothymol blue,<br />
các chủng R9 và S15 chứng tỏ khả năng phát<br />
triển tốt trên môi trường có 1,2-DCE là nguồn<br />
cacbon duy nhất thông qua việc phân giải mạnh<br />
cơ chất 1,2-DCE khi làm thay đổi pH môi<br />
trường, biến màu xanh ban đầu thành màu vàng<br />
mạnh hơn so với hai chủng còn lại (hình 1).<br />
Chúng tôi lựa chọn hai chủng S9, R15 cho các<br />
nghiên cứu tiếp theo về các đặc điểm sinh học,<br />
phân loại cũng như khả năng phân giải 1,2DCE.<br />
Hình thái và đặc điểm sinh lý, sinh hóa các<br />
chủng phân lập<br />
Các đặc điểm về hình thái và sinh lý sinh<br />
hóa là các chỉ tiêu quan trọng trong việc phân<br />
loại vi sinh vật. Kết quả quan sát dưới kính hiển<br />
vi cho thấy tế bào chủng R9 được nhận diện là<br />
Gram (+), có hình que ngắn trong khi tế bào<br />
chủng S15 có hình que dài mang các đặc tính<br />
của vi khuẩn Gram (-) (hình 2).<br />
89<br />
<br />
TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 88-93<br />
<br />
Hình 1. Sự phân giải 1,2-DCE trên MGB thạch có bổ sung Bromothymol Blue<br />
của một số chủng phân lập<br />
<br />
Hình 2. Hình thái tế bào các chủng nghiên cứu dưới kính hiển vi điện tử (×5000)<br />
Các đặc điểm về sinh lý sinh hóa của hai<br />
chủng R9 và S15 được trình bày trong bảng 1.<br />
Kết quả cho thấy, hai chủng vi khuẩn này có<br />
hoạt tính của các enzyme thủy phân phân giải<br />
các chất như cellulose, gelatin. Cả hai chủng<br />
đều có khả năng sử đa dạng nhiều nguồn cacbon<br />
khác nhau từ glucose đến maltose hoặc<br />
N-acetyl-glucosamine.<br />
Chủng S15 có phản ứng thủy phân Arginine<br />
dương tính cho thấy khả năng cao chủng<br />
này thuộc chi Pseudomonas. Thử nghiệm khả<br />
năng phân hủy các hợp chất halogen khác với<br />
sự phát triển mạnh trên môi trường MGB có<br />
bổ sung các hợp chất 2,2-Dichloropropionate,<br />
<br />
90<br />
<br />
3,4-Dichloroaniline cho thấy cả R9 và S15 đều<br />
có có khả năng sinh trưởng phát triển điều này<br />
cho thấy khả năng đa dạng sử dụng các hợp chất<br />
có chứa clo của hai chủng phân lập.<br />
Kết quả giải trình tự gen 16S ARNr của<br />
hai chủng cho thấy, trình tự 16S ARNr<br />
của chủng S15 có kích thước khoảng 1492bp và<br />
có độ tương đồng 99% với chủng Pseudomonas<br />
pseudoalcaligenes trong khi trình tự đoạn<br />
gen mã hóa 16S ARNr của chủng R9 có kích<br />
thước khoảng 1499bp và tương ứng 99% với<br />
trình tự gen 16S ARNr loài Klebsiella<br />
pneumoniae đã được công bố trên Ngân hàng<br />
gen thế giới.<br />
<br />
Pham Thi Vui, Pham Thi Hoa, Pham Bao Yen, Nguyen Quang Huy<br />
<br />
Bảng 1. Đặc điểm sinh hóa của các chủng nghiên cứu theo Kit API 20<br />
Một số đặc điểm sinh học<br />
Hoạt tính protease<br />
Hoạt tính catalase<br />
Hoạt tính cellulase<br />
Khả năng chuyển hóa nitrate nitrite<br />
Tryptophane<br />
Lên men (Glucose)<br />
Thủy phân Aginine<br />
Hoạt tính Urease<br />
Thủy phân Esculin (β-glucosidase)<br />
Thủy phân Gelatine<br />
β-galactosidase<br />
Khả năng sử dụng cơ chất<br />
Glucose<br />
Arabinose<br />
Mannose<br />
Manitol<br />
N-acetyl-glucosamine<br />
Maltose<br />
Gluconate<br />
Caprate<br />
Adipate<br />
Malate<br />
Citrate<br />
Phenyl-acetate<br />
Khả năng sử dụng một số cơ chất có chứa clo<br />
2, 2-Dichloropropionate<br />
3, 4- Dichloroaniline<br />
<br />
Chủng S9<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
-<br />
<br />
Chủng S15<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
-<br />
<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
-<br />
<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
-<br />
<br />
+<br />
+<br />
<br />
+<br />
-<br />
<br />
(+). Có phát triển; (-). Không phát triển.<br />
<br />
Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ (a) và nồng độ 1,2-DCE lên sự phát triển (b)<br />
của hai chủng phân lập<br />
Ảnh hưởng nhiệt độ và nồng độ cơ lên sự<br />
phát triển của các chủng phân lập<br />
Nhiệt độ ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát triển<br />
<br />
của các chủng phân hủy 1,2-DCE cũng như việc<br />
ứng dụng phương pháp sinh học trong xử lý ô<br />
nhiễm 1,2-DCE do ô nhiễm cơ chất này ở sâu<br />
<br />
91<br />
<br />
TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 88-93<br />
<br />
dưới các mạch nước ngầm hay dưới đáy sông<br />
hồ, nơi có nhiệt độ thấp, còn khi ở nhiệt độ cao,<br />
cơ chất này bay hơi rất độc [3]. Tiến hành<br />
nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ với hai<br />
chủng phân lập trong thời gian 48 giờ, kết quả<br />
cho thấy, chủng R9 phát triển tốt trong khoảng<br />
nhiệt độ từ 23 đến 30oC trong khi nhiệt độ phát<br />
triển của chủng S15 là từ 30 đến 37oC (hình 3a).<br />
Đây cũng là khoảng nhiệt độ phù hợp với điều<br />
kiện phân lập hai chủng.<br />
Nồng độ cơ chất trong môi trường có ảnh<br />
hưởng đáng kể đến sự phát triển của các chủng<br />
nghiên cứu, nồng độ quá cao hay quá thấp đều<br />
có thể làm chậm hay gây ức chế quá trình sinh<br />
trưởng của loài, Trong các nồng độ thí nghiệm<br />
cho thấy cả hai chủng đều có thể phát triển<br />
trong môi trường bổ sung 1,2-DCE với nồng độ<br />
từ 5 đến 20 mM. Sau thời gian nuôi cấy 48 giờ,<br />
trong khi chủng R9 phát triển tốt nhất ở nồng 5<br />
mM, thì nồng độ 10 mM cho thấy sự sinh<br />
trưởng tốt của chủng S15 (hình 3b).<br />
KẾT LUẬN<br />
<br />
Từ các mẫu đất và nước đã phân lập tuyển<br />
chọn được hai chủng R9, S15 trên môi trường<br />
MGB có bổ sung cơ chất 1,2-DCE là nguồn<br />
cacbon duy nhất.<br />
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào, đặc<br />
điểm sinh lý, sinh hóa và kết quả giải trình tự<br />
gen 16S ARNr cho thấy, chủng R9 thuộc chi<br />
Klebsiella, chủng S15 thuộc chi Pseudomonas<br />
với độ tương đồng 99%.<br />
Chủng R9 phát triển tốt trong khoảng nhiệt<br />
độ từ 23 đến 30°C, còn chủng S15 từ 30-37°C.<br />
Nồng độ cơ chất 1,2-DCE tối ưu cho hai chủng<br />
R9, S15 sinh trưởng là 5 mM.<br />
Lời cảm ơn: Đề tài được hoàn thành với sự<br />
hỗ trợ kinh phí của đề tài KLEPT 12-01 thuộc<br />
phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ<br />
Enzym và Protein, ĐHQG Hà Nội tài trợ. Đề tài<br />
có sử dụng các trang thiết bị tại Phòng Enzym<br />
học và Phân tích hoạt tính sinh học, Phòng thí<br />
nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và<br />
Protein.<br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO<br />
<br />
1. Bergmann J. G., Sanik J., 1957.<br />
Determination of trace amount of chlorine<br />
92<br />
<br />
in naphtha, Analytical Chemistry, 29(2):<br />
241-243.<br />
2. Doucette W. J., Hall A. J., Gorder K. A.,<br />
2010. Emissions of 1, 2-Dichloroethane<br />
from holiday decorations as a source of<br />
indoor air contamination. Ground Water<br />
Monitoring & Remediation, 30(1): 67-73.<br />
3. Fetzner S., Lingens F., 1994. Bacterial<br />
dehalogenases: biochemistry, genetics and<br />
biotechnological<br />
applications.<br />
Microbiological Reviews, 58: 641- 658.<br />
4. Govender<br />
A.,<br />
Pillay<br />
B.,<br />
2011.<br />
Characterization of 1, 2-dichloroethane<br />
(DCA) degrading bacteria isolated from<br />
South African waste water. African Journal<br />
of Biotechnology, 10(55): 11567-11573.<br />
5. Hunkeler D., Aravena R., Berry S. K., Cox<br />
E., 2005. Assessment of degradation<br />
pathways in an aquifer with mixed<br />
chlorinated hydrocarbon contamination<br />
using stable isotope analysis. Environmental<br />
Science & Technology, 39(16): 5975-81.<br />
6. Olaniran A. O., Pillay D., Pillay B., 2004.<br />
Haloalkane and haloacid dehalogenases<br />
from aerobic bacterial isolates indigenous to<br />
contaminated sites in Africa demonstrate<br />
diverse<br />
substrate<br />
specificities.<br />
Chemosphere, 55: 27-33.<br />
7. Song J. S., Lee D. H., Lee K., Kim C. K.,<br />
2003. Characteristics of several bacterial<br />
isolates<br />
capable<br />
of<br />
degrading<br />
chloroaliphatic compounds via hydrolytic<br />
dechlorination.<br />
The<br />
Journal<br />
of<br />
Microbiology, 41: 277- 283.<br />
8. Van J. E. T., Tang L., Spelberg J. H.,<br />
Smilda T., Poelarends G. J., Bosma T., Van<br />
Merode A. E. J., Janssen D. B., 2001.<br />
Halohydrin dehalogenases are structurally<br />
and mechanistically related to short-chain<br />
dehalogenases/reeducates.<br />
Journal<br />
of<br />
Bacteriology, 183: 5058-5066.<br />
9. Wildeman S. D., Verstraete W., 2003. The<br />
quest for microbial reductive dechlorination<br />
of C2 to C4 chloroalkanes is warranted.<br />
Applied Microbiology and Biotechnology,<br />
61(2): 94-102.<br />
<br />