Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM<br />
ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO<br />
CỦA MỘT SỐ DƢỢC LIỆU<br />
Đỗ Thị Quỳnh Quyên*, Nguyễn Thị Hồng Phúc**, Nguyễn Thị Minh Thuận*, Võ Thị Bạch Huệ*<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Mở đầu: Các chất ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE) thường được sử dụng để điều trị Alzheimer.<br />
Nghiên cứu n|y được thực hiện nhằm tìm ra thuốc điều trị Alzheimer tiềm năng với cơ chế ức chế AChE từ dược<br />
liệu góp phần ngăn chặn tiến triển của bệnh.<br />
Phương pháp: Khảo sát tác dụng ức chế AChE trên in vitro của cao chiết cồn 80% từ 12 dược liệu bằng<br />
phương ph{p đo quang Ellman sử dụng cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB trong đĩa 96 giếng ở bước sóng<br />
415nm. Chọn mẫu dược liệu có tác dụng mạnh nhất để tiếp tục khảo sát thành phần hóa học.<br />
Kết quả: Đề tài chọn được cao toàn phần Dừa cạn có tác dụng ức chế 50,26% ở nồng độ 1mg/ml. Khảo sát<br />
thành phần hóa thực vật của dừa cạn, từ c{c cao ph}n đoạn thu được 3 ph}n đoạn có hoạt tính ức chế enzym<br />
AChE tiềm năng.<br />
Kết luận: Những kết quả này là tiền đề cho những nghiên cứu s}u hơn về hướng tác dụng ức chế AChE của<br />
dược liệu Dừa cạn. Đồng thời có thể dựa vào quy trình sàng lọc đã được x{c định để tiếp tục thử nghiệm trên các<br />
mẫu dược liệu khác nhằm tìm ra dược liệu có tiềm năng cao hơn.<br />
Từ khóa: Ức chế enzym acetylcholinesterase, Dừa cạn, in vitro<br />
<br />
ABSTRACT<br />
IN VITRO SCREENING FOR ACETYLCHOLINESTERASE INHIBITION ACTIVITY<br />
FROM SOME MEDICINAL PLANTS<br />
Do Thi Quynh Quyen, Nguyen Thi Hong Phuc, Nguyen Thi Minh Thuan, Vo Thi Bach Hue<br />
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 235 - 240<br />
Introduction: Acetylcholinesterase inhibitors (AChEIs) are commonly used for Alzheimer’s treatment. This<br />
research aims to find potential agents from medicinal plants helping prevent progressive Alzheimer's disease.<br />
Methods: Evaluation of the AChE inhibitory activity of alcoholic 80% extracts of 12 plants was performed in<br />
vitro by using Ellman method with acetylthiocholine iodide as substrate and dithiodinitrobenzoic acid as reagent<br />
in 96-well plates at 415 nm. The strongest effectively extracts were taken to investigate its chemical compositions.<br />
Results: The present study demonstrated that total extract of Catharanthus roseus possessed 50,26%<br />
inhibitiory activity at concentration of 1mg/ml. Investigation of the plant composition Catharanthus roseus from<br />
total extract obtained 3 fraction extracts having a potential AChEi activity.<br />
Conclusion: Results are a prerequisite for further studies toward AChEi activity of Catharanthus roseus.<br />
Furthermore, the screening model of AChE inhibitory activity in vitro established could be used for other<br />
medicinal plants to find the higher potential AChEi agents.<br />
Keyword: Acetylcholinesterase inhibitors, Catharanthus roseus, in vitro<br />
<br />
*Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh **Khoa Dƣợc, Đại học Nguyễn Tất Thành<br />
Tác giả liên lạc: Võ Thị Bạch Huệ ĐT: 0908420240<br />
Email: vothibachhue@gmail.com<br />
<br />
Chuyên Đề Dƣợc<br />
<br />
235<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Cùng với sự phát triển của cuộc sống hiện<br />
đại thì sa sút trí tuệ - căn bệnh vẫn đƣợc biết đến<br />
với c{i tên Alzheimer đ ng trở nên phổ biến.<br />
Sinh bệnh học của Alzheimer rất phức tạp liên<br />
qu n đến rất nhiều yếu tố nhƣ myloid bet<br />
Aβ (5), protein tau(9), viêm thần kinh(11), sự tổn<br />
thƣơng củ c{c syn p cũng nhƣ c{c tế bào thần<br />
kinh(3) < Vì thế việc sử dụng các loại thuốc cổ<br />
truyền với nhiều mục tiêu có lẽ sẽ có ƣu thế hơn<br />
so với việc sử dụng một loại thuốc điều trị một<br />
triệu chứng bệnh lý.<br />
Acetylcholin (ACh) có vai trò quan trọng<br />
trong hoạt động của hệ thần kinh, nó là chất dẫn<br />
truyền thần kinh tại khe synap và nồng độ ACh<br />
đƣợc duy trì ổn định bởi enzym<br />
acetylcholinesterase (AChE), một enzym có chức<br />
năng l|m ngƣng lại các hoạt động của chất dẫn<br />
truyền thần kinh ACh thông qua việc thủy phân<br />
ACh tạo thành cholin và acid acetic. Ở các bệnh<br />
nhân Alzheimer, nồng độ ACh bị suy giảm đ{ng<br />
kể(1). Do vậy, các thuốc ức chế AChE đóng v i trò<br />
quan trọng trong việc ngăn chặn sự tiến triển của<br />
bệnh Alzheimer. Các thuốc ức chế cholinesterase<br />
trên thị trƣờng hiện n y đ số là thuốc t}n dƣợc<br />
nhƣng gi{ th|nh thuốc tƣơng đối cao và có<br />
những tác dụng phụ không mong muốn. Nhu<br />
cầu nghiên cứu phát triển các thuốc mới có<br />
nguồn gốc từ dƣợc liệu để hỗ trợ v| điều<br />
trị Alzheimer l| điều cần thiết. Vì vậy nghiên<br />
cứu n|y đƣợc tiến hành nhằm tìm r ph}n đoạn<br />
chiết tiềm năng từ dƣợc liệu góp phần ngăn<br />
chặn tiến triển chứng suy giảm trí nhớ cũng nhƣ<br />
bệnh Alzheimer.<br />
<br />
NGUYÊN LIỆU – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN<br />
CỨU<br />
Nguyên liệu<br />
12 dƣợc liệu đƣợc lựa chọn từ kinh nghiệm<br />
dân gian, từ các tài liệu tổng quan về c{c dƣợc<br />
liệu và hoạt chất có tác dụng ức chế AChE đã<br />
đƣợc sàng lọc tại nhiều nƣớc trên thế giới(4,7,10).<br />
C{c dƣợc liệu n|y đƣợc thu thập tại TpHCM và<br />
<br />
236<br />
<br />
các tỉnh miền Trung Việt Nam theo danh sách<br />
trong bảng 1.<br />
ảng : Danh mục c{c dược liệu được tiến hành khảo<br />
s{t sơ bộ tác dụng ức chế AChE<br />
TT<br />
<br />
Tên dược<br />
liệu<br />
Cỏ sữa<br />
<br />
Tên khoa học<br />
<br />
Họ<br />
<br />
Euphorbia thymifolia Euphorbiaceae Toàn cây<br />
<br />
Cỏ cứt lợn Ageratum conyzoides<br />
Đan sâm<br />
Dừa cạn<br />
Gùi<br />
<br />
Bộ phận<br />
dùng<br />
<br />
Salvia miltiorrhiza<br />
<br />
Asteraceae<br />
<br />
Toàn cây<br />
trên mặt<br />
đất<br />
<br />
Lamiaceae<br />
<br />
Rễ củ<br />
<br />
Cantharanthus roseus Apocynaceae Toàn cây<br />
Willughbeia<br />
Apocynaceae<br />
Dây<br />
cochinchinensis<br />
<br />
Khương<br />
Thân rễ<br />
Notopterygium incisum Apiaceae<br />
hoạt<br />
Mần trầu<br />
Poaceae<br />
Toàn cây<br />
Eleusine indica<br />
Muồng hòe Cassia surattensis<br />
Fabaceae<br />
Lá<br />
Riềng<br />
Alpinia officinarum Zingiberaceae Thân rễ<br />
Anemarrhena<br />
Tri mẫu<br />
Liliaceae<br />
Thân rễ<br />
asphodeloides<br />
Trinh nữ<br />
Fabaceae<br />
Toàn cây<br />
Mimosa pudica<br />
Xuyên tiêu Zanthoxylum nitidum<br />
Rutaceae<br />
Vỏ quả<br />
<br />
Nguyên liệu đƣợc định danh dựa vào hình<br />
ảnh, tài liệu tham khảo để tránh nhầm lẫn.<br />
Hóa chất<br />
AChE<br />
loại<br />
C3389<br />
(Sigma-Aldrich),<br />
Acetylthiocholin iodid (ATCI) (Sigma-Aldrich),<br />
Acid<br />
5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic<br />
(DTNB)<br />
(Sigma-Aldrich). Các dung môi n-hexan,<br />
chloroform, ethyl cet t EtOAc đạt tinh khiết<br />
phân tích.<br />
Phƣơng pháp nghiên cứu<br />
<br />
Sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE các mẫu<br />
dược liệu in vitro<br />
Chuẩn bị mẫu: 30g dƣợc liệu khô sau khi xay<br />
nhỏ thành bột đƣợc rây qua rây 2mm và tiến<br />
hành chiết nóng với dung môi là cồn 80%. Dịch<br />
chiết thu đƣợc cô loại dung m i thu đƣợc cao<br />
toàn phần mẫu thử. Pha cao mẫu thử trong<br />
DMSO 10% ở nồng độ 1mg/ml.<br />
Đ{nh gi{ t{c dụng ức chế enzym AChE của<br />
mẫu dƣợc liệu bằng phƣơng ph{p đo qu ng in<br />
vitro dựa trên nguyên tắc củ phƣơng ph{p<br />
Ellman(2): Cơ chất ATCI bị thủy phân bởi enzym<br />
AChE tạo thiocholin. Sản phẩm thiocholin phản<br />
ứng với thuốc thử acid DTNB tạo thành hợp chất<br />
<br />
Chuyên Đề Dƣợc<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
acid 5-thio-2-nitro benzoic có m|u v|ng Cƣờng<br />
độ màu của chất này tỷ lệ thuận với hoạt độ<br />
enzym AChE. Dự v|o độ hấp thu của mẫu thử<br />
đƣợc x{c định ở bƣớc sóng 415nm để đ{nh gi{<br />
khả năng ức chế hoạt tính enzym AChE của<br />
dƣợc liệu.<br />
Hoạt tính ức chế AChE in vitro của mẫu<br />
thử đƣợc x{c định bằng giá trị phần trăm hoạt<br />
tính enzym bị ức chế I% v| đƣợc x{c định<br />
theo công thức:<br />
I% = (1 – AbsT/AbsC) x 100<br />
<br />
(CT1)<br />
<br />
Trong đó:<br />
I%: phần trăm hoạt tính AChE bị ức chế.<br />
AbsT và AbsC lần lƣợt l| độ hấp thu của mẫu<br />
thử và mẫu chứng.<br />
Mỗi mẫu thử đƣợc thực hiện lặp lại 3 lần,<br />
mỗi lần làm trên 3 giếng.<br />
Thành phần hỗn hợp phản ứng đƣợc trình<br />
bày ở bảng 2.<br />
ảng : Thành phần hỗn hợp phản ứng đo quang in<br />
vitro<br />
Mẫu Mẫu Mẫu đối<br />
Mẫu trắng<br />
thử trắng chứng<br />
chứng (µl)<br />
(µl) thử (µl)<br />
(µl)<br />
<br />
STT<br />
<br />
Thành phần<br />
<br />
1<br />
<br />
Đệm phosphat<br />
pH 8<br />
<br />
80<br />
<br />
100<br />
<br />
2<br />
<br />
Mẫu thử<br />
<br />
20<br />
<br />
20<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
3<br />
<br />
DMSO 10%<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
20<br />
<br />
20<br />
<br />
4<br />
<br />
Enzym AChE<br />
0,25U/ml<br />
<br />
20<br />
<br />
0<br />
<br />
20<br />
<br />
0<br />
<br />
5<br />
<br />
ACTI 2,4mM<br />
<br />
40<br />
<br />
40<br />
<br />
40<br />
<br />
40<br />
<br />
6<br />
<br />
DTNB 2,4mM<br />
<br />
Tổng thể tích (µl)<br />
<br />
80<br />
<br />
100<br />
<br />
40<br />
<br />
40<br />
<br />
40<br />
<br />
40<br />
<br />
200<br />
<br />
200<br />
<br />
200<br />
<br />
200<br />
<br />
Quy trình thử nghiệm đƣợc tóm tắt theo sơ<br />
đồ ở hình 1.<br />
Để có cơ sở đ{nh gi{ hoạt tính ức chế<br />
AChE in vitro của mẫu nghiên cứu, berberin<br />
clorid đƣợc lựa chọn làm mẫu đối chứng<br />
dƣơng Hợp chất n|y đã đƣợc nghiên cứu<br />
và chứng minh sở hữu hoạt tính ức chế<br />
AChE in vitro khá mạnh. Thực tế, berberin<br />
clorid cũng đã đƣợc sử dụng làm mẫu đối<br />
chứng dƣơng trong một số nghiên cứu(6,8).<br />
<br />
Chuyên Đề Dƣợc<br />
<br />
ình : Sơ đồ quy trình thử nghiệm hoạt tính ức chế<br />
AChE in vitro<br />
Từ kết quả sàng lọc trên, chọn mẫu dƣợc liệu<br />
có tác dụng cao nhất để tiếp tục khảo sát hóa học<br />
và sàng lọc c{c ph}n đoạn nhỏ có tác dụng dƣợc<br />
lý mạnh nhất trong dƣợc liệu này.<br />
Khảo sát thành phần hóa thực vật của mẫu<br />
dƣợc liệu theo định hƣớng tác dụng ức chế<br />
enzym AChE in vitro<br />
<br />
Chiết xuất và phân lập<br />
Dƣợc liệu đƣợc chiết ngấm kiệt với cồn<br />
80% (tỷ lệ dƣợc liệu và dung môi là 1: 15). Sau<br />
khi cô quay thu hồi thu đƣợc cao toàn phần.<br />
Từ cao toàn phần, lắc phân bố với các dung<br />
môi hoặc hỗn hợp dung môi (n-hexan,<br />
chloroform, ethyl cet t để phân tách thành<br />
c{c ph}n đoạn có độ phân cực khác nhau.<br />
Theo dõi qu{ trình t{ch ph}n đoạn bằng sắc<br />
ký lớp mỏng S u đó, ph{t hiện các vết bằng<br />
phƣơng ph{p soi UV ở bƣớc sóng 254nm,<br />
365nm và bằng thuốc thử vanillin – sulfuric<br />
(VS). Sau khi, loại dung m i thu đƣợc các<br />
ph}n đoạn đơn giản. Từ c{c ph}n đoạn này,<br />
tiến hành phân lập bằng phƣơng ph{p sắc ký<br />
cột ch}n kh ng để t{ch th|nh c{c ph}n đoạn<br />
nhỏ hơn<br />
Khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE của các<br />
phân đoạn đã phân lập được<br />
Tiến hành khảo sát tác dụng ức chế enzym<br />
AChE củ c{c ph}n đoạn thu đƣợc từ phƣơng<br />
<br />
237<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br />
<br />
pháp sắc ký cột ch}n kh ng theo quy trình nhƣ<br />
đối với các mẫu c o dƣợc liệu để chọn ra phân<br />
đoạn có tác dụng cao nhất.<br />
<br />
trình theo sơ đồ trong hình 2 và hình 3.<br />
<br />
KẾT QUẢ<br />
Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế AChE in<br />
vitro<br />
ảng : Kết quả đ{nh gi{ hoạt tính ức chế AChE của<br />
12 dược liệu nghiên cứu<br />
STT<br />
<br />
Tên dược liệu<br />
Cỏ sữa<br />
Cỏ cứt lợn<br />
Dừa cạn<br />
Đan sâm<br />
Gùi<br />
Khương hoạt<br />
Mần trầu<br />
Muồng hòe<br />
Riềng<br />
Tri mẫu<br />
Trinh nữ<br />
Xuyên tiêu<br />
<br />
% ức chế<br />
9,23<br />
50,26<br />
8,54<br />
2,91<br />
3,67<br />
-<br />
<br />
* Ghi chú: (-) không có tác dụng hoặc tác dụng không rõ<br />
ràng<br />
<br />
Nhận xét: Kết quả ở bảng 3 cho thấy trong 12<br />
mẫu dƣợc liệu khảo sát chỉ có 5 mẫu dƣợc liệu có<br />
khả năng enzym ức chế AchE, 7 mẫu dƣợc liệu<br />
không có tác dụng hoặc tác dụng không rõ ràng.<br />
Trong 5 mẫu dƣợc liệu có tác dụng trên in vitro,<br />
Dừa cạn có tác dụng kháng enzym AChE rõ rệt<br />
(50,26%) so với các mẫu còn lại. Vì thế, Dừa cạn<br />
đƣợc chọn để tiếp tục khảo sát hóa học và phân<br />
lập ph}n đoạn nhỏ có tác dụng mạnh nhất trong<br />
dƣợc liệu này.<br />
<br />
ình : Quy trình chiết xuất cao alkaloid toàn phần<br />
từ dược liệu Dừa cạn<br />
<br />
Khảo sát thành phần hóa thực vật của cây Dừa<br />
cạn theo định hƣớng tác dụng ức chế enzym<br />
AChE<br />
<br />
Chiết xuất và tách phân đoạn<br />
Theo kết quả sơ bộ thành phần hóa thực vật<br />
dƣợc liệu Dừa cạn nhận thấy mẫu dịch chiết cồn<br />
80% có alkaloid là thành phần nổi bật. Vì thế, khi<br />
chiết xuất và phân lập sẽ tập trung vào thành<br />
phần alkaloid củ dƣợc liệu.<br />
Quy trình chiết xuất và xử lý sơ bộ cao<br />
alkaloid toàn phần từ dƣợc liệu Dừa cạn đƣợc<br />
<br />
238<br />
<br />
ình : Quy trình xử lý sơ bộ cao alkaloid toàn phần<br />
Dựa vào sắc ký lớp mỏng và khối lƣợng các<br />
c o thu đƣợc, chọn cao n-hexan 2 và cao EtOAc 2<br />
<br />
Chuyên Đề Dƣợc<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
để tiến hành sắc ký cột chân không.<br />
<br />
UV 365<br />
<br />
UV 245<br />
<br />
Thuốc thử VS<br />
<br />
Thuốc thử Dragendorff<br />
<br />
ình 4: Sắc ký lớp mỏng kiểm tra c{c cao ph}n đoạn<br />
Kết quả: Từ cao n-hex n 2 thu đƣợc 8 phân<br />
đoạn nhỏ đƣợc kí hiệu từ H1 – H8. Từ cao<br />
EtOAc 2 thu đƣợc 18 ph}n đoạn nhỏ kí hiệu từ<br />
E1 – E18.<br />
<br />
Áp dụng phƣơng ph{p đ{nh gi{ hoạt tính ức<br />
chế AChE in vitro đã đƣợc x{c định để khảo sát<br />
tác dụng củ c{c ph}n đoạn phân lập đƣợc từ<br />
hai cột sắc ký trên. Kết quả đƣợc trình bày ở<br />
bảng 4 và bảng 5.<br />
<br />
Khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE của các<br />
phân đoạn đã phân lập được<br />
ảng : Kết quả đ{nh gi{ hoạt tính kháng enzym AChE của c{c ph}n đoạn cột cao n-hexan 2<br />
Phân đoạn (1mg/ml)<br />
% ức chế<br />
Phân đoạn (1mg/ml)<br />
% ức chế<br />
<br />
H1<br />
4,97<br />
H5<br />
30,22<br />
<br />
H2<br />
13,15<br />
H6<br />
17,20<br />
<br />
H3<br />
6,31<br />
H7<br />
16,74<br />
<br />
H4<br />
-7,26<br />
H8<br />
29,90<br />
<br />
ảng : Kết quả đ{nh gi{ hoạt tính kháng enzym AchE của c{c ph}n đoạn cột cao EtOAc 2<br />
Phân đoạn (1mg/ml)<br />
% ức chế<br />
Phân đoạn (1mg/ml)<br />
% ức chế<br />
Phân đoạn (1mg/ml)<br />
% ức chế<br />
<br />
E1<br />
-6,47<br />
E7<br />
23,98<br />
E13<br />
40,24<br />
<br />
E2<br />
13,54<br />
E8<br />
19,27<br />
E14<br />
67,26<br />
<br />
Nhận xét: Ở nồng độ 1mg/ml, c{c ph}n đoạn<br />
của cao EtOAc 2 cho kết quả ức chế enzym tốt<br />
hơn so với c{c ph}n đoạn của cao n-hexan 2.<br />
Nhƣ vậy c{c ph}n đoạn có độ phân cực trung<br />
bình đến mạnh sẽ có tác dụng dƣợc lý tốt hơn<br />
c{c ph}n đoạn kém phân cực. Trong đó, ph}n<br />
đoạn E17 có kết quả ức chế enzym ở mức khá<br />
c o 78,79% , c{c ph}n đoạn E14 v| E16 cũng cho<br />
kết quả ở mức tƣơng đối (67,26 và 68,45%). Có<br />
h i ph}n đoạn cho kết quả âm có thể là vì dung<br />
môi không thể hòa tan hoàn toàn mẫu làm cho<br />
<br />
Chuyên Đề Dƣợc<br />
<br />
E3<br />
25,61<br />
E9<br />
25,70<br />
E15<br />
61,97<br />
<br />
E4<br />
13,10<br />
E10<br />
16,46<br />
E16<br />
68,45<br />
<br />
E5<br />
18,99<br />
E11<br />
22,69<br />
E17<br />
78,79<br />
<br />
E6<br />
16,93<br />
E12<br />
35,65<br />
E18<br />
37,16<br />
<br />
dung dịch phản ứng bị đục và dẫn tới sai lệch<br />
kết quả.<br />
<br />
BÀN LUẬN<br />
Khảo sát tác dụng ức chế AChE trên in<br />
vitro của cao chiết cồn 80% từ 12 dƣợc liệu<br />
bằng phƣơng pháp đo quang Ellman sử dụng<br />
cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB trong đĩa 96<br />
giếng ở bƣớc sóng 415nm. Chọn mẫu dƣợc<br />
liệu có tác dụng mạnh nhất để tiếp tục khảo<br />
sát thành phần hóa học. Đề tài này đã định<br />
hƣớng để tiếp tục khảo sát sâu hơn về cây Dừa<br />
<br />
239<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
