TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015<br />
<br />
NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP KỸ THUẬT SEMINESTED PCR<br />
PHÁT HIỆN NẤM CANDIDA ALBICANS<br />
Đỗ Ngọc Ánh*; Hoàng Cao Sạ**<br />
Đoàn Ngọc Giang Lâm***; Phạm Văn Minh*<br />
TÓM TẮT<br />
Mục tiêu: xác định điều kiện và thử nghiệm áp dụng kỹ thuật seminested PCR phát hiện nấm<br />
Candida albicans. Phương pháp: thiết lập kỹ thuật seminested PCR trên cơ sở gen đích mã hóa<br />
®<br />
rARN của chủng nấm Candida albicans ATCC 90028 và đánh giá thử trên 27 chủng nấm Candida<br />
albicans phân lập ở Việt Nam. Kết quả: xác định đƣợc điều kiện phản ứng PCR1, PCR2 cũng<br />
2+<br />
nhƣ ngƣỡng phát hiện, tính đặc hiệu của kỹ thuật. PCR 1: nồng độ Mg 1,5 mM, dNTPs 150 µM,<br />
o<br />
2+<br />
nồng độ mồi 0,2 - 0,3 pmol/µl và nhiệt độ gắn mồi là 55 C. PCR2: nồng độ Mg 2,0 mM, dNTPs<br />
o<br />
200 µM, nồng độ mồi 0,2 pmol/µl và nhiệt độ gắn mồi 55,2 C. Kỹ thuật seminested PCR có<br />
khả năng phát hiện chính xác nấm C. abicans ở ngƣỡng ≥ 10 pg/µl. Sau khi đƣợc thiết lập,<br />
đánh giá kỹ thuật trên ADN của 27 chủng C. albicans phân lập ở Việt Nam, kết quả cho thấy,<br />
cả 27 chủng đều cho band đặc hiệu có kích thƣớc 410 bp nhƣ mong đợi. Kết luận: kỹ thuật<br />
seminested PCR thu đƣợc cho phép xác định chính xác nấm Candida albicans.<br />
* Từ khóa: Candida albicans; Seminested PCR.<br />
<br />
Development of Seminested PCR for Detection of Candida Albicans<br />
Summary<br />
Aims: To establish and evaluate a system of seminested polymerase chain reaction (PCR)<br />
®<br />
assays to identify Candida albicans. Methods: DNA of Candida albicans ATCC 90028 and<br />
27 samples from Vietnam was extracted and used as a template in PCR assays targeting<br />
the ribosomal DNA of Candida albicans. Results: PCR1 and PCR2 assays were optimized to<br />
2+<br />
detect exactly rRNA gene of Candida albicans. PCR1 with 1.5 mM Mg , 150 µM of each<br />
o<br />
deoxyribonucleotide, 0.2 - 0.3 pmol/µl of each primer and annealing temperature 55 C. PCR2<br />
2+<br />
with 1.5 mM Mg , 200 µM of each deoxyribonucleotide, 0.2 pmol/µl of each primer and annealing<br />
o<br />
temperature 55.2 C. The limited concentration for detection of C. albicans was not less than<br />
10 pg per µl DNA of C. albicans in total volume of PCR1 assay. We obtained positive reactions<br />
for all 27/27 samples from patients who had been previously diagnosed with Candidiasis of<br />
C. albicans by conventional techniques. Conclusions: The seminested PCR assays described<br />
here can support the diagnosis of Candida albicans.<br />
* Key words: Candida albicans; Seminested PCR.<br />
* Học viện Quân y<br />
** Bệnh viện Đa khoa Nam Định<br />
*** Bệnh viện TWQĐ 108<br />
Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Ngọc Ánh (dranhk61@gmail.com)<br />
Ngày nhận bài: 30/05/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 09/07/2015<br />
Ngày bài báo được đăng: 20/07/2015<br />
<br />
27<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Candida sp. là nấm men sống hội sinh<br />
trong đƣờng tiêu hóa và đƣờng sinh dục,<br />
có ở 70% dân số và ít nhất khoảng 75%<br />
phụ nữ bị nhiễm nấm này một lần trong đời<br />
[5, 6]. Tuy nhiên, ở những cơ thể có nhiều<br />
yếu tố thuận lợi, nấm này sẽ chuyển từ<br />
hội sinh sang gây bệnh. Bệnh do nấm<br />
Candida sp. có thể đƣợc phân thành hai<br />
nhóm: nhóm gây tổn thƣơng ở da, niêm<br />
mạc và nhóm gây bệnh nội tạng. Bệnh<br />
nấm Candida sp. nội tạng rất trầm trọng,<br />
chúng đe dọa mạng sống và tû lệ tử vong<br />
lên có thể lên tới 30% [9]. Đối với nhiễm<br />
Candida sp. máu, tỷ lệ tử vong có thể lên<br />
tới 50% [7, 8], đặc biệt đối với trẻ sơ sinh<br />
[10]. Vì những lý do trên, Candida sp. đã<br />
trở thành tác nhân gây bệnh nguy hiểm<br />
đối với ngƣời. Việc xác định chính xác căn<br />
nguyên gây bệnh đóng vai trò quan trọng<br />
trong lựa chọn phƣơng pháp điều trị.<br />
Do đó, ở ngƣời nghi nhiễm Candida sp.,<br />
nấm và loài nấm gây bệnh cần đƣợc phát<br />
hiện, xác định sớm để có biện pháp điều<br />
trị kịp thời. Trong số các Candida sp.,<br />
Candida albicans là loài nấm phổ biến nhất.<br />
Một số nấm khác có thể gặp nhƣng ít hơn<br />
là Candida glabrata, Candida krusei,<br />
Candida dubliniensis, Candida parapsilosis<br />
và Candida tropicalis [4].<br />
Các phƣơng pháp xét nghiệm chẩn đoán<br />
nấm đƣợc sử dụng chủ yếu hiện nay là:<br />
phƣơng pháp xét nghiệm trực tiếp, phƣơng<br />
pháp nuôi cấy, phƣơng pháp huyết thanh.<br />
Ƣu điểm của phƣơng pháp xét nghiệm<br />
trực tiếp bằng soi tƣơi là nhanh, đơn giản,<br />
dễ thực hiện, độ đặc hiệu cao nhƣng độ<br />
nhạy thấp. Nuôi cấy có độ chính xác cao<br />
28<br />
<br />
hơn soi tƣơi nhƣng phải sau 3 - 5 ngày<br />
mới có kết quả [3]. Phát hiện kháng<br />
nguyên vỏ tuy độ nhạy cao hơn nhƣng độ<br />
đặc hiệu thấp, tỷ lệ dƣơng tính giả và âm<br />
tính giả cao. Mặt khác, trong trƣờng hợp<br />
nấm gây bệnh ở máu, mô chẩn đoán<br />
bằng các phƣơng pháp này gặp nhiều<br />
khó khăn. Hơn nữa, ngay cả khi đã phân<br />
lập đƣợc nấm, việc xác định loài nấm đó<br />
là loài gì bằng phƣơng pháp truyền thống<br />
cũng gặp nhiều khó khăn, cần nhiều thời<br />
gian [3].<br />
Hiện nay, công nghệ sinh học phân tử<br />
phát triển đã giúp xác định nhanh loài của<br />
một vi sinh vật với độ nhạy và độ đặc hiệu<br />
cao. Tuy nhiên, vấn đề ứng dụng kỹ thuật<br />
sinh học phân tử trong chẩn đoán nấm ở<br />
Việt Nam còn mới mẻ. Nhằm góp phần<br />
phát triển kỹ thuật sinh học phân tử vào<br />
chẩn đoán nấm ở Việt Nam, chúng tôi<br />
tiến hành nghiên cứu này nhằm:<br />
- Xác định các đi u kiện c a k thuật<br />
seminested PCR phát hiện nấm Candida<br />
albicans.<br />
- Th nghiệm áp dụng k thuật seminested<br />
PCR đ xác định một s ch ng nấm Candida<br />
albicans phân lập Việt Nam.<br />
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br />
NGHIÊN CỨU<br />
<br />
1. Đối tượng nghiên cứu.<br />
- 01 chủng nấm chuẩn Candida albicans<br />
ATCC®90028.<br />
- 27 chủng nấm Candida albicans phân<br />
lập từ máu, dịch âm đạo ở Việt Nam.<br />
2. Vật liệu nghiên cứu.<br />
- Dụng cụ: máy PCR (Eppendorf, Đức),<br />
máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettech, Đức),<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015<br />
<br />
máy soi và chụp gel Dolphin Doc (Wealtec,<br />
Mỹ), bộ điện di.<br />
- Sinh phẩm hóa chất: môi trƣờng<br />
Sabouraud, dung dịch NaCl 0,9%, dung<br />
dịch mực tàu, bộ kít tách ADN tổng số<br />
(QIAGEN, Mỹ), gel agarose, dung dịch TBE<br />
0,5%, dung dịch enzym giới hạn MspI<br />
(Fermentas), các hóa chất cần thiết khác.<br />
- Cặp mồi cho phản ứng PCR: cặp mồi<br />
ITS1 (forward, 5’-TCC GTA GGT GAA CCT<br />
GCG G-3’) và ITS4 (reverse, 5’-TCC TCC<br />
GCT TAT TGA TAT GC-3’) đã đƣợc chọn<br />
(SH Mirhendi và CS, 2001) đƣợc sử dụng<br />
cho vòng 1, kích thƣớc đoạn gen thu đƣợc<br />
535bp. Đoạn gen này chứa một phần đoạn<br />
18S, một phần đoạn 28S, toàn bộ các đoạn<br />
giao gen ITS1, 5.8S và ITS2. Cặp mồi CalF<br />
(5’-TCAACTTGTCACACCAGATTATT-3’) và<br />
ITS4 đƣợc sử dụng cho vòng 2, kích thƣớc<br />
đoạn gen thu đƣợc 410 bp.<br />
3. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br />
* Phân lập mẫu nấm s<br />
nghiên cứu:<br />
<br />
dụng trong<br />
<br />
mix, ADN tổng số, mồi và nƣớc cất khử ion<br />
vừa đủ 25 μl. Thời gian chạy phản ứng<br />
PCR1 nhƣ sau: 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút;<br />
25 chu kỳ mỗi chu kỳ gồm 95oC/45 giây,<br />
55oC/45 giây, 72oC/1 phút; 1 chu kỳ 72oC/10<br />
phút. Sản phẩm phản ứng PCR1 đƣợc bảo<br />
quản ở 4oC cho tới khi thực hiện phản<br />
ứng PCR2. Phản ứng PCR2 có điều kiện<br />
tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR1, nhƣng nhiệt<br />
độ gắn mồi 55,2oC và số chu kỳ 30 lần.<br />
* Ki m tra sản phẩm PCR:<br />
Điện di sản phảm PCR và sản phẩm<br />
cắt giới hạn trên thạch agarose 1,2% và<br />
2% trong môi trƣờng đệm TBE với thời<br />
gian 45 phút ở điện thế 100V.<br />
* Ki m tra ngưỡng phát hiện:<br />
Pha ADN nấm thành các dung dịch treo<br />
có nồng độ từ 10 -7 - 10-1 ng/µl. Lấy 2 µl<br />
dung dịch ADN ở trên chạy PCR trong<br />
điều kiện nhƣ nhau. Ngƣỡng phát hiện là<br />
giới hạn thấp nhất mà kết quả PCR2 còn<br />
nhìn rõ bằng mắt thƣờng trên điện di.<br />
* Ki m tra tính đặc hiệu:<br />
<br />
Nấm C. albicans chuẩn đƣợc phân lập<br />
từ ống chứa theo hƣớng dẫn của nhà<br />
sản xuất (ATCC, Mỹ). Các chủng nấm<br />
C. albicans của Việt Nam đƣợc phân lập<br />
từ máu và dịch âm đạo cña bệnh nhân<br />
nhiễm nấm bằng cách cấy trên môi trƣờng<br />
thạch sabouraud có kháng sinh.<br />
<br />
Thực hiện phản ứng PCR1 với cặp<br />
mồi ITS1 và ITS4 trên ADN của các vi<br />
nấm men Candida non-albicans và vi khuẩn<br />
S. aureus, A. baumannii, K. pneumoniae,<br />
E. coli, P. aeruginosa, M. tuberculosis,<br />
ADN của virut viêm gan B và của ngƣời…<br />
để kiểm tra tính đặc hiệu.<br />
<br />
* Tách ADN và nhân đoạn gen đặc hiệu:<br />
<br />
4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.<br />
<br />
Tách chiết ADN nấm C. albicans theo<br />
quy trình của Hãng QUIAGEN (Mỹ). Sau đó,<br />
dùng ADN làm khu«n cho phản ứng PCR.<br />
Thành phần phản ứng PCR gồm: master<br />
<br />
- Địa điểm nghiên cứu: labo Trung tâm<br />
Nghiên cứu Y Dƣợc học Quân sự và labo<br />
nấm Bộ môn Ký sinh trùng, Học viện<br />
Quân y.<br />
29<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015<br />
<br />
- Thời gian nghiên cứu: từ 4 - 2013<br />
đến 5 - 2015.<br />
<br />
5. Phân tích và xử lý số liệu.<br />
- Kết quả đo nồng độ ADN trên máy<br />
NanoDrop 1000. Các kết quả đƣợc ghi chép,<br />
lƣu trữ và quy đổi theo đơn vị khác nhau.<br />
- Điện di và phân tích kết quả phản<br />
ứng PCR cùng với thang ADN chuẩn<br />
(100 bp).<br />
- So sánh và phân tích kết quả giải<br />
trình tự trên Ngân hàng Gen http://blast.<br />
ncbi.nlm.nih.gov.<br />
- Xây dựng cây phả hệ bằng phần mềm<br />
PHYLIP.<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br />
BÀN LUẬN<br />
<br />
1. Kết quả xác định điều kiện cho<br />
phản ứng PCR.<br />
* Kết quả xác định đi u kiện cho phản<br />
ứng PCR vòng ngoài (PCR1):<br />
Đ i với phản ứng PCR1, chúng tôi đã<br />
nghiên cứu và xác định được đi u kiện<br />
<br />
cho phản ứng này thực hiện t t, ổn định<br />
khi nồng độ Mg2+ 1,5 mM, dNTPs 150 µM,<br />
mồi 0,2 - 0, 3 pmol/µl và nhiệt độ gắn mồi<br />
55oC… [1].<br />
* Kết quả xác định đi u kiện cho phản<br />
ứng PCR vòng trong (PCR2):<br />
Sau khi xác định đƣợc các điều kiện<br />
cho phản ứng PCR1 nhƣ trên, thực hiện<br />
phản ứng PCR1 nhƣng với 25 chu kỳ và<br />
lấy sản phẩm bằng thực hiện phản ứng<br />
PCR2 để xác định các điều kiện.<br />
- Kết quả xác định nhiệt độ gắn mồi và<br />
nồng độ Mg2+:<br />
Để tối ƣu nhiệt độ gắn mồi Ta, chúng<br />
tôi dựa theo lý thuyết Ta = Tm ± 5°C [2].<br />
Với cặp mồi CalF và ITS4, ta có Tm = 56 58°C và Ta = 51 - 63°C. Thực tế, chúng tôi<br />
chọn nhiệt độ gắn mồi Ta = 52 - 58°C.<br />
Để xác định nhiệt độ gắn mồi, chuẩn bị 11<br />
phản ứng seminested PCR giống nhau về<br />
thành phần (trong đó [Mg2+ = 2.0 mM])<br />
nhƣng chạy PCR theo gradient nhiệt độ<br />
gắn mồi mặc định cài đặt trên máy PCR.<br />
<br />
Hình 1: Kết quả PCR với nhiệt độ gắn mồi 52 - 58°C và nồng độ Mg2+= 2,0 mM.<br />
30<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015<br />
<br />
Ở dải nhiệt độ 52 - 58°C, tất cả các<br />
giếng đều lên band đặc hiệu có kích<br />
thƣớc 410 bp. Quan sát kỹ thấy, giếng 7<br />
tƣơng ứng với nhiệt độ gắn mồi 55,2°C<br />
cho band đặc hiệu sáng và rõ nét nhất.<br />
<br />
Hình 3: Kết quả PCR2 với nhiệt độ gắn<br />
mồi và nồng độ Mg2+ khác nhau.<br />
Hình 2: Kết quả PCR với nhiệt độ gắn mồi<br />
55,2°C với nồng độ Mg2+ = 2,0 mM.<br />
Dựa trên kết quả thu đƣợc, chúng tôi<br />
sử dụng nhiệt độ gắn mồi 55,2°C để đánh<br />
giá lại sự ổn định của phản ứng PCR2.<br />
Để thực hiện điều này, chuẩn bị 4 phản<br />
ứng seminested PCR giống nhau và<br />
chạy PCR1 và PCR2 trong điều kiện nhƣ<br />
nhau với nhiệt độ gắn mồi PCR2 là 55,2°C.<br />
Kết quả cho thấy cả 4 giếng đều lên 1 band<br />
đặc hiệu duy nhất. Vì vậy, 55,2°C đƣợc<br />
chọn làm nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng<br />
PCR2.<br />
Trong các điều kiện nhiệt độ gắn mồi<br />
và nồng độ Mg2+ khác, phản ứng PCR2<br />
không ổn định hoặc có band phụ.<br />
<br />
- Kết quả xác định các đi u kiện nồng<br />
độ mồi, dNTPs, Taq DNA polymerase:<br />
Các đi u kiện khác đ phản ứng PCR2<br />
thực hiện t t là: nồng độ mồi trong hỗn<br />
dịch đem thực hiện phản ứng 0,2 pmol/µl,<br />
nồng độ Taq ADN polymerase 0,025 UI/µl<br />
và dNTPs là 200 µM.<br />
* Kết quả xác định ngưỡng phát hiện<br />
và tính đặc hiệu:<br />
Để kiểm tra ngƣỡng phát hiện của kỹ<br />
thuật seminested PCR, tiến hành pha<br />
loãng để tạo panel nồng độ ADN của nấm<br />
Candida albicans giảm dần theo lũy thừa<br />
10 từ 1 - 10-5ng/µl và đƣa vào thực hiện<br />
phản ứng PCR1, PCR2 với các điều kiện<br />
đã tối ƣu nhƣ trên.<br />
<br />
31<br />
<br />