Nghiên cứu xây dựng quy trình điều chế cao lỏng lược vàng (Callisia fragrans (Lindl.) Woodson)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Nghiên cứu xây dựng quy trình điều chế cao lỏng lược vàng (Callisia fragrans (Lindl.) Woodson) tiến hành nghiên cứu với mong muốn tạo nên ý nghĩa điều trị cho cây lược vàng. Bước đầu tiên để hiện thực hóa mục tiêu là phát triển các dạng bào chế hiện đại từ cây Lược vàng, đặc biệt là các dạng bào chế dùng ngoài.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu xây dựng quy trình điều chế cao lỏng lược vàng (Callisia fragrans (Lindl.) Woodson)

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐIỀU CHẾ CAO LỎNG LƯỢC VÀNG (CALLISIA FRAGRANS (LINDL.) WOODSON) Hoàng Đức Mạnh, Nguyễn Gia Thuận, Võ Thị An Thuyên Trần Thị Mỹ Hoa, Nguyễn Thị Bích Ngọc Khoa Dược, Đại học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh GVHD: ThS.DS. Nguyễn Hữu Phước TÓM TẮT Theo Đông Y, cây Lược vàng (Callisia fragrans (Lindl.) Woodson) được cho là một trong các loại dược liệu có tác dụng cầm máu, tiêu viêm tốt. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu với mong muốn tạo nên ý nghĩa điều trị cho cây Lược vàng. Bước đầu tiên để hiện thực hóa mục tiêu là phát triển các dạng bào chế hiện đại từ cây Lược vàng, đặc biệt là các dạng bào chế dùng ngoài. Trong nghiên cứu này, lá cây Lược vàng sẽ được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt và phương pháp ngâm lạnh có hỗ trợ siêu âm, với dung môi là ethanol ở các nồng độ khác nhau. Bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis, cao lỏng Lược vàng được xác định hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo quercetin cho kết quả 0,72 mg quercetin/ml cao lỏng. Từ khóa: Callisia fragrans, flavonoid, lược vàng, quercetin, UV-Vis Đặt vấn đề Cây Lược vàng (Callisia fragrans (Lindl.) Woodson) hay còn gọi là địa lan vòi, vốn được trồng rộng rãi tại Việt Nam. Lược vàng được truyền miệng rằng chúng có thể trị được rất nhiều bệnh: bỏng, viêm khớp, bệnh ngoài da, tim mạch,… với tác dụng chủ yếu là kháng viêm [1]. Vì vậy, nhiều bài nghiên cứu khoa học đã được ra đời, tìm ra nhiều thành phần có trong Lược vàng, đặc trưng là nhóm flavonoid [1–3] . Tuy nhiên, để có cơ sở phát triển nguồn dược liệu Lược vàng thành các dạng bào chế hiện đại, việc nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất và chuẩn hóa cao Lược vàng là cần thiết. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích bước đầu tìm ra quy trình chiết xuất và xử lý dịch chiết để điều chế cao lỏng Lược vàng. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu Nguyên vật liệu 739
Bột nửa thô dược liệu Lược vàng với độ ẩm là 1,3%, được cung cấp bởi công ty Thảo dược Tấn Phát (22/21 đường số 21, phường 8, quận Gò Vấp) đạt tiêu chuẩn cơ sở. Chất đối chiếu thứ cấp quercetin do Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương cung cấp với hàm lượng 86%, tái kiểm ngày 31/12/2022. Ethanol 96%, natri acetat, acid acetic, nhôm clorua có nguồn gốc từ Trung Quốc và được cung cấp bởi phòng thí nghiệm khoa Dược – HUTECH. Trang thiết bị bao gồm máy đo quang phổ SPECTROSCOPY UV-VIS U-3900 (Nhật), Cân phân tích Ohaus PA214 (Mỹ), các thiết bị còn lại đều là thiết bị thường qui có sẵn tại phòng thí nghiệm của trường Đại học Công nghệ TP.HCM – HUTECH. Phương pháp nghiên cứu Khảo sát lựa chọn dung môi Các dung môi, tỷ lệ dung môi cần khảo sát: nước, ethanol 25%, ethanol 50%, ethanol 80%. Phương pháp chiết xuất là ngâm lạnh có hỗ trợ bằng siêu âm. Cho 25 g bột dược liệu vào erlen 500ml. Lần lượt cho vào 250 ml các dung môi cần khảo sát với tỷ lệ dược liệu, dung môi là 1:10, siêu âm với tần số 37 kHz trong 45 phút. Sau đó lọc qua bông, ép bã. Lọc và cô dịch chiết trên bếp cách thủy đến khi thu được cắn khô (khối lượng không đổi khi cô). Hòa tan cắn trong 50ml ethanol 96% và tiến hành định lượng flavonoid toàn phần tính theo quercetin. Khảo sát phương pháp chiết xuất Phương pháp chiết xuất được khảo sát: ngấm kiệt và ngâm lạnh có hỗ trợ bằng siêu âm. Dung môi dùng để chiết xuất là ethanol 80%. Phương pháp ngâm lạnh có hỗ trợ bằng siêu âm được thực hiện tương tự quy trình nêu tại mục 2.2.1. Phương pháp ngấm kiệt: làm ẩm 50 g bột dược liệu với dung môi ethanol 80% trong 1 giờ; cho dược liệu đã làm ẩm vào bình ngấm kiệt tiêu chuẩn thể tích 500 ml; thêm dung môi cách mặt dược liệu 3 cm và ngâm lạnh 48 giờ; rút dịch chiết với tốc độ 30 giọt/phút đến khi thu được 350 ml thì ngưng thêm dung môi; rút hết dịch chiết và ép bã, gộp dịch chiết; lọc và cô dịch chiết trên bếp cách thủy đến khi thu được cắn khô (khối lượng không đổi khi cô); cắn được hòa tan trong 50 ml ethanol 96% và tiến hành định lượng flavonoid toàn phần tính theo quercetin. Điều chế cao lỏng Lược vàng và định lượng flavonoid toàn phần tính theo quercetin trong cao lỏng Lược vàng Quá trình chiết xuất ở quy mô 1 kg dược liệu Lược vàng bằng phương pháp ngấm kiệt được thực hiện ở nhiệt độ thường. Dịch chiết sau khi chiết xuất cô cách thủy đến khi còn 1 lít (cao lỏng). Cao lỏng 740
Lược vàng được pha loãng 2,5 lần bằng dung môi pha mẫu, tạo thành dung dịch thử và định lượng hàm lượng quercetin với phương pháp quang phổ UV-Vis sau khi tạo phức với AlCl3 [2,4] Dung môi pha mẫu: Hỗn hợp methanol - acid acetic 95:5 (tt/tt), dùng trong 24 giờ. Dung dịch thử: hút chính xác 10,00 ml chế phẩm cắn hòa tan trong ethanol 96% cho vào bình định mức 25ml pha loãng với dung môi pha mẫu, lắc đều và để yên trong 45 phút. Dung dịch chuẩn đối chiếu: Cân chính xác 12,5 mg quercetin cho vào bình định mức 50 ml, siêu âm trong 15 phút và điền đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Phản ứng tạo phức được thực hiện trong bình định mức với thành phần các chất phản ứng được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1. Thành phần tham gia phản ứng tạo phức đo quang trong phép định lượng flavonoid toàn phần tính theo quercetin Mẫu Thành phần Chuẩ Trắng Trắng Thử thêm Thử n Chuẩn Thử chuẩn Chuẩn đối chiếu 1 1 0 0 1 (ml) Dung dịch thử (ml) 0 0 5 5 5 AlCl3 10% (ml) 1 0 1 0 1 CH3COONa 1% 1 1 1 1 1 (ml) Dung môi pha mẫu Vừa đủ 25 ml Các mẫu được để ổn định 45 phút ở nhiệt độ phòng tạo điều kiện cho quá trình tạo phức xảy ra hoàn toàn. Sau đó đo độ hấp thu ở bước sóng 412 nm. Khảo sát tính tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu của quercetin 741
Tính tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu của quercetin Pha dãy dung dịch quercetin ở các nồng độ khác nhau 0,05; 0,10 ; 0,15 ; 0,20 ; 0,25 mg/ml, phối hợp với thuốc thử và đo độ hấp thu ở bước sóng 412 nm. Thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thu của của chuẩn quercetin có dạng y = ax + b [4] Kết quả và bàn luận Dung môi chiết xuất Kết quả khảo sát dung môi chiết xuất được trình bày trong Bảng 2 Bảng 2. Tỷ lệ cắn khô (%) thu được từ cây Lược vàng được chiết bằng các dung môi khảo sát Mẫu Nước Ethanol 25% Ethanol 50% Ethanol 80% 1 3,52 3,90 4,30 5,06 2 3,30 3,32 3,96 4,62 3 3,60 3,56 4,40 4,34 Trung bình 3,47 3,59 4,22 4,67 SD 0,0099 0,0271 0,0400 0,0257 Kết quả từ Bảng 2 cho thấy, lượng cắn khô thu được khi chiết bằng ethanol 80% cao nhất, tiếp đến là ethanol 50% là cao nhất. Tuy nhiên, khi kiểm định phép kiểm t-test thì sự khác nhau này không có ý nghĩa thống kê (p=0,08 với mức ý nghĩa 0,05). Xét về tính chất cắn, cắn thu được khi chiết bằng nước, ethanol 25% và ethanol 50% có thể chất dẻo, rất khó hòa tan trở lại trong nước so với cắn chiết bằng ethanol 80%. Sau khi cắn được hòa tan trong ethanol 96%, các mẫu được đo độ hấp thu ở 412 nm và kết quả được ghi nhận trong Bảng 3 Bảng 3. Độ hấp thu ở 412 nm của dịch hòa tan cắn thu được từ cây Lược vàng được chiết bằng các dung môi khảo sát 742
Ethanol Mẫu Chuẩn Nước Ethanol 50% Ethanol 80% 25% 1 0,8103 0,4109 0,4087 0,4325 0,6217 2 - 0,3911 0,4591 0,5125 0,5981 3 - 0,4008 0,4162 0,4678 0,5702 Trung bình - 0,4009 0,4280 0,4709 0,5967 SD 0,0099 0,0271 0,0400 0,0257 So sánh sự khác nhau về độ hấp thu của cắn chiết bằng ethanol 50% và ethanol 80% khi hoà tan vào ethanol 96% bằng phép kiểm t-test cho thấy có sự khác nhau có ý nghĩa về độ hấp thu của 2 mẫu (p=0,009 với mức ý nghĩa 0,05). Như vậy, tuy lượng cắn chiết bằng ethanol 80% không nhiều hơn cắn chiết bằng ethanol 50% nhưng hàm flavonoid chiết được bằng ethanol 80% nhiều hơn khi chiết bằng ethanol 50%. Từ các kết quả trên, dung môi ethanol 80% được sử dụng để khảo sát phương pháp chiết xuất và điều chế cao lỏng Lược vàng. Phương pháp chiết xuất Kết quả so sánh hai phương pháp ngâm lạnh có hỗ trợ của sóng siêu âm và phương pháp ngấm kiệt khi chiết Lược vàng được trình bày trong Bảng 4 Bảng 4. Tỷ lệ cắn khô thu được (%) và độ hấp thu tại 412 nm của dịch hòa tan cắn ứng với hai phương pháp chiết xuất Lược vàng Tỷ lệ cắn khô (%) Độ hấp thu tại 412 nm PP hỗ trợ PP hỗ trợ PP ngấm Chuẩn PP ngấm Mẫu sóng siêu sóng siêu kiệt (0,25M) kiệt âm âm 1 7,06 5,06 0,8103 0,8217 0,6217 743
2 6,62 4,62 - 0,7702 0,5981 3 6,34 4,34 - 0,8163 0,5702 Trung 6,67 4,67 - 0,8027 0,5967 bình SD 0,3629 0,3629 0,0283 0,0257 Phép kiểm ANOVA đối với tỷ lệ cắn khô và độ hấp thu tại 412 nm đều chứng minh rằng có sự khác nhau có ý nghĩa khi so sánh 2 phương pháp chiết (mức ý nghĩa  = 0,05). Qua đó cho thấy, phương pháp ngấm kiệt có khả năng chiết được nhiều hoạt chất hơn. Phương pháp ngấm kiệt khó nâng quy mô sản xuất , tuy nhiên phương pháp này không sử dụng các máy móc, thiết bị chuyên dụng (máy siêu âm). Vì vậy, phương pháp ngấm kiệt được sử dụng để điều chế cao Lược vàng. Định lượng flavonoid toàn phần tính theo quercetin trong cao Lược vàng Dịch chiết bằng dung môi ethanol 80% từ 1 kg bột Lược vàng theo phương pháp ngấm kiệt được cô đặc đến thể tích 1 lít (tương ứng với thể cao lỏng). Để định lượng flavonoid toàn phần tính theo quercetin bằng phương pháp đo độ hấp thu UV-Vis, thí nghiệm khảo sát tính tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu của quercetin đã được thực hiện. Kết quả được trình bày trong Hình 1 Hình 1. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của chuẩn quercetin Phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thu của quercetin được tìm ra là y = 2,861x + 0,1118, với y là độ hấp thu ở bước sóng 412 nm và x là nồng độ quercetin trong mẫu đo. Phương trình hồi quy cho thấy có tính tuyến tính cao với hệ số xác định R2 = 0,9995. 744
Từ phương trình trên, nồng độ quercetin trong cao lỏng Lược vàng được xác định trên 6 mẫu đo và kết quả thể hiện trong Bảng 5 Bảng 5. Độ hấp thu ở 412 nm của dịch hòa tan cắn thu được từ dược liệu Lược vàng và hàm lượng flavonoid tính theo quercetin (mg/ml) Mẫu Hàm lượng flavonoid tính Độ hấp thu tại 412 nm (y) thử theo quercetin (mg/ml) (x) 1 0,9210 0,7220 2 0,9214 0,7223 3 0,9208 0,7218 4 0,9205 0,7216 5 0,9217 0,7225 6 0,9215 0,7223 Trung bình TB = 0,7221 SD SD = 0,0003 RSD RSD = 0,04% Kết luận và kiến nghị Sau khi khảo sát dung môi và phương pháp chiết xuất, chúng tôi có các kết luận sau đây: (i) Trong các dung môi cần khảo sát, dung môi ethanol 80% cho tỷ lệ cắn chiết được so với dược liệu cao nhất là 4,67 (%) và có độ hấp thu cao nhất là 0,5967; (ii) phương pháp ngấm kiệt có tỷ lệ cắn khô chiết được cao hơn hẳn (6,67%) so với phương pháp ngâm lạnh hỗ trợ sóng siêu âm (4,67%); (iii) Cao lỏng Lược vàng đã được điều chế bằng phương pháp ngấm kiệt và chứa hàm lượng quercetin là 0,72 mg/ml. Do điều kiện thời gian, chúng tôi không thể khảo sát đủ tất cả các phương pháp chiết xuất. Phương pháp ngâm, chiết xuất hồi lưu cũng nên được xem xét để đưa vào khảo sát. 745
Lời cảm ơn Nghiên cứu này được hướng dẫn bởi ThS. Ds. Nguyễn Hữu Phước, cùng với sự hỗ trợ về điều kiện phòng thí nghiệm của Đại học Công nghệ TPHCM – HUTECH. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Chernenko TV, Ul’chenko NT, Glushenkova AI, et al. Chemical investigation of Callisia fragrans. Chem Nat Compd 2007;43:253–5. doi:10.1007/s10600-007-0098-x 2 Le T, Cao DK, Pham TV, et al. Changes in total phenol, flavonoid contents and anti-Lactobacillus activity of Callisia fragrans due to extraction solvent. Ho Chi Minh City, Vietnam: 2018. 040011. doi:10.1063/1.5033411 3 Olennikov DN, Ibragimov TA, Zilfikarov IN, et al. Chemical composition of Callisia fragrans juice 1. Phenolic compounds. Chem Nat Compd 2008;44:776–7. doi:10.1007/s10600-009-9174-8 4 Chang C-C, Yang M-H, Wen H-M, et al. Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colometric methods. Journal of Food and Drug Analysis 2020;10. doi:10.38212/2224- 6614.2748 5 Lien N, Minh C, Thu N. Định lượng flavonoid toàn phần trong cao khô Rau đắng đất (Glinus oppositifolius (L.) Aug. DC.) bằng phương pháp quang phổ UV-Vis. Tạp chí Khoa học & Công nghệ số 5 746