Nghiên cứu xây dựng và phát triển quy trình sản xuất giống mía sạch bệnh theo quy mô công nghiệp bằng công nghệ tế bào

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br /> <br /> NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH<br /> SẢN XUẤT GIỐNG MÍA SẠCH BỆNH THEO QUY MÔ CÔNG NGHIỆP<br /> BẰNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO<br /> TS. Hà Thị Thuý, ThS. Trần Thị Hạnh,<br /> Vũ Anh Tuấn, GS.TS. Đỗ Năng Vịnh<br /> Viện Di truyền Nông nghiệp<br /> SUMMARY<br /> Study on building and development of disease-free sugarcane propagation<br /> processes by industrial methods using plant cell technology<br /> Standardization of protocol for micropropagation of sugarcane was established through in vitro<br /> culture using young meristem of sugarcane as an explant. The multiple shoot regenration at various<br /> frequencies was observed by using different concentrations and combination of growth regulators. The<br /> highest percentage of callus induction was observed in MS medium supplemented with 3mg/l 2,4D. The<br /> best response in term of multiple shoot induction was observed on MS medium with BAP 1.5mg/l +<br /> Kinetin 0.2mg/l + 15% coconut milk. MS medium containing 0.5mg/l NAA showed nearly 100% rooting<br /> response of in vitro regenrated shoots within two week of inoculated. Best hardening response was<br /> obtained in Sand + Soil humus + husk burn + ¼ biofertilizer.<br /> Keywords: callus in vitro culture, new sugarcane cultivars, micropropagation sugarcane<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ *<br /> <br /> Nhân giống truyền thống thường kèm theo<br /> vấn đề sâu bệnh, thoái hoá giống đặc biệt là các<br /> bệnh về virus.... Công nghệ vi nhân giống được<br /> xem là phương pháp hiệu quả nhất để làm sạch<br /> bệnh, làm trẻ hóa, phục tráng và tăng năng suất<br /> giống, để nhân nhanh trên quy mô lớn đối với các<br /> giống mới tạo được, rút ngắn quá trình chọn<br /> giống và đưa giống mới vào sản xuất (Feldmenn<br /> et al.,1994 ; Lal et al,1996; Lorenzo et al., 2001;<br /> <br /> Kaiser and Makhdoom, 2004; Jalaja et al.,<br /> 2008;). Giống mía sạch bệnh nhân bằng cấy mô<br /> làm tăng năng suất từ 30 % đến 68,7% so với<br /> giống nhân bằng ngọn thông thường (Li Yang Rui and Yuan- An Wei, 2006).<br /> Nhân nhanh giống mía có thể thực hiện bằng<br /> 2 phương thức cấy mô: Nuôi cấy đỉnh sinh<br /> trưởng và tái sinh phôi vô tính từ tế bào mô sẹo<br /> phiến lá non. Cây con tạo được đồng nhất về di<br /> truyền và rất ít khi bị biến dị trừ trường hợp nuôi<br /> cấy quá dài hoặc xử lý đột biến in vitro<br /> (Taylor,1993; Kale et al., 2004).<br /> Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy chồi đỉnh để tạo<br /> giống mía sạch bệnh đã được sử dụng rộng rãi<br /> trong công nghiệp mía đường để nhân nhanh<br /> giống sạch bệnh với khả năng làm tăng năng suất<br /> mía lên 20 - 30 % sau 3-4 vụ thu hoạch so với<br /> giống mía nhân bằng phương pháp truyền thống<br /> (Gosal et al., 1998; Chattha et al., 2001; Cheema<br /> and Hussain, 2004).<br /> Tóm lại, công nghệ tế bào đã được khẳng<br /> định là rất hiệu quả đối với công nghiệp mía<br /> đường trên toàn cầu. Mục tiêu ứng dụng của công<br /> nghệ tế bào mía bao gồm:<br /> - Loại trừ bệnh và nhân nhanh các giống mía<br /> sạch bệnh<br /> <br /> Người phản biện: GS.TSKH. Trần Duy Quý.<br /> <br /> - Làm trẻ hóa và tăng năng suất giống, chống<br /> thoái hóa do lão hóa sinh lý trong quá trình nhân<br /> vô tính<br /> <br /> Tổng sản lượng mía cây trên toàn thế giới<br /> năm 2008 là 1.743.092.995 tấn. Mười nước sản<br /> xuất mía lớn nhất thế giới theo thứ tự là Brasil,<br /> Ấn<br /> Độ,<br /> Trung<br /> Quốc,<br /> Thái<br /> Lan,<br /> Mexico, Colombia, Australia, Argentina và Mỹ,<br /> trong đó, Brasil sản xuất 648.921.280 tấn, Ấn Độ<br /> sản xuất 348.187.900 tấn; TQ sản xuất<br /> 124.917.502 tấn, Thái Lan 73.501.610 tấn<br /> (Source: Food And Agricultural Organization of<br /> United Nations: Economic And Social<br /> Department: The Statistical Division, 2009).<br /> Năng suất mía trung bình toàn cầu là 68 tấn/ha,<br /> năng suất trung bình vùng Châu Á - Thái Bình<br /> Dương là 56.7 tấn/ha, trong khi năng suất trung<br /> bình ở Úc là khoảng 92 tấn/ha, ở nước ta chỉ đạt<br /> khoảng 52 tấn/ha.<br /> <br /> 839<br /> <br /> VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br /> <br /> - Rút ngắn quá trình tạo giống và đẩy mạnh<br /> thương mại hóa giống mới, nhanh chóng thay<br /> giống cũ và thiết lập các điền trang trồng mía<br /> mới.<br /> - Bảo quản và trao đổi quỹ gen.<br /> Phục vụ tạo giống mới thông qua biến dị tế<br /> bào sôma và chuyển gen.<br /> Các nghiên cứu chọn tạo giống mía ở nước<br /> ta còn rất hạn chế. Theo Viện Nghiên cứu và Phát<br /> triển Mía Đường, ở nước ta hiện nay có khoảng<br /> 21 giống mía chủ yếu đang được trồng sản xuất<br /> như My5514; F156; Comus; Hòa Lan tím; Hòa<br /> Lan; F134; H39-3633; R570; QĐ11; QĐ15;<br /> VĐ81-3254; VĐ86-368; ROC10; ROC16;<br /> ROC22; VN84-422; VN84-4137; VN85-1427;<br /> VN85-1859;K84-200; DLM24) với năng suất từ<br /> 70 - 130 tấn/ha, trong số đó nhiều giống đã có<br /> biểu hiện thoái hóa và nhiễm bệnh. Việc nhập nội<br /> giống ồ ạt cũng là một nguyên nhân kéo theo<br /> nguồn sâu bệnh hại từ nước ngoài. Phương án<br /> nhập nội số lượng ít và sau đó sử dụng công nghệ<br /> tế bào nhân nhanh đã được đề xuất (Hà Thị Thúy<br /> và cs.2000).<br /> Ở nước ta, một số Viện nghiên cứu như Viện<br /> Di truyền nông nghiệp, Viện Cây lương thực và<br /> Cây thực phẩm, Đại học Nông nghiệp Hà Nội,<br /> Viện Nghiên cứu và Phát triển Mía Đường đã có<br /> một số thành công trong nhân nhanh các giống<br /> mía mới bằng cấy mô. Tuy vậy, quy mô nhân<br /> giống còn rất hạn hẹp, phạm vi phục vụ mới chỉ<br /> khu trú ở một số địa phương.<br /> Viện Di truyền nông nghiệp đã triển khai<br /> nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô<br /> phục vụ Chương trình mía đường từ rất sớm.<br /> Viện đã công bố nhiều công trình nghiên cứu có<br /> liên quan đến các khía cạnh khác nhau của công<br /> nghệ nhân giống mía (Hà Thị Thúy và Cs,1998;<br /> 1999; 2000a).<br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Vật liệu<br /> <br /> - Các giống sản xuất đại trà ở khu vực miền<br /> Bắc: QĐ11, QĐ15, QĐ17, QĐ 93-159, My55-14,<br /> VĐ55, VĐ79-177, ROC16, ROC10, ROC22....<br /> - Các giống mới nhập nội.<br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> <br /> - Phương pháp chọn giống ưu tú phục vụ<br /> nhân nhanh thông qua các giống về năng suất, trữ<br /> <br /> 840<br /> <br /> đường, khả năng thích ứng, mùa vụ thu hoạch,<br /> vùng thích nghi, phản ứng sâu bệnh.<br /> - Phương pháp chọn cá thể trội để nhân<br /> nhanh: cao cây, dài lóng, đường kính thân,<br /> khối lượng cây, số cây hữu hiệu/khóm, mức<br /> độ sâu bệnh...<br /> - Phương pháp làm sạch bệnh và phục tráng<br /> giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng chồi<br /> ngọn và chồi nách.<br /> - Phương pháp chẩn đoán bệnh bằng ELISA,<br /> RT-PCR, PCR đối với bệnh chồi cỏ mía, bệnh<br /> khảm và sọc lá mía.<br /> - Phương pháp xây dựng các hệ thống tái<br /> sinh in vitro hiệu quả cao đối với nhân giống in<br /> vitro: phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh có 2 - 3 lá<br /> mầm; phương pháp tái sinh mô sẹo từ mô non ở<br /> chân phiến lá, chồi non.<br /> - Phương pháp nhân giống bằng khí canh,<br /> thủy canh sau cấy mô.<br /> - Phương pháp đánh giá hệ số nhân giống ở<br /> các giai đoạn in vitro và sau in vitro.<br /> - Các phương pháp công nghệ vườn ươm:<br /> Giá thể, phân bón, chế độ tưới tiêu, ánh sáng,<br /> nhiệt độ<br /> Các phương pháp nhân giống vô tính sau in<br /> vitro đối với cây cấy mô. Đánh giá hệ số nhân<br /> giống và năng suất của cây thu được ở mỗi<br /> phương pháp nhân nhanh.<br /> - Các phương pháp thí nghiệm đồng ruộng,<br /> khảo kiểm nghiệm giống và thống kê sinh học<br /> nông nghiệp<br /> - Các phương pháp đánh giá sâu bệnh hại,<br /> năng suất, hàm lượng đường<br /> III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 3.1. Đánh giá, chọn lọc, thu thập giống làm vật<br /> liệu nhân nhanh<br /> <br /> Kết quả điều tra đánh giá và chọn lọc các<br /> giống tại một số khu vực trồng mía chính ở miền<br /> Bắc chúng tôi nhận thấy, tại Nghệ An các giống<br /> mía chủ yếu đang trồng là ROC10, My5514,<br /> QĐ11, ROC16, VN84-4137, F156, trong đó các<br /> giống ROC10, My5514 chiếm tỷ lệ đáng kể<br /> (71,17%). Việc nghiên cứu phục tráng các giống<br /> này là cần thiết. Tại Hòa Bình, chúng tôi đã xác<br /> định được các giống mía HB1 (ROC23), HB2,<br /> HB3 có năng suất cao, đạt năng suất trên 100 tấn<br /> đến 170 tấn/ha. Tại Thanh Hóa các giống trồng<br /> <br /> Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br /> <br /> chủ yếu là QĐ 93-159, My55-14, VĐ55, VĐ79177, ROC10, QĐ 94, VL6, VĐ 00236, trong đó<br /> giống ROC 10 vốn rất được ưa thích vì năng suất<br /> cao trên 100 tấn/ha nhưng hiện tại được trồng với<br /> diện tích ít do giống bị thoái hóa cây nhỏ, năng<br /> suất thấp.<br /> Từ các bộ giống đang được trồng đại trà ở các<br /> vùng nguyên liệu mía này chúng tôi tiến hành<br /> chọn các cá thể tốt, ưu việt trong quần thể để thu<br /> thập, lấy mẫu đưa vào ống nghiệm. Danh sách các<br /> giống được lấy mẫu đưa vào ống nghiệm gồm:<br /> My5514; ROC 10; HB1 (ROC23); HB2; HB3;<br /> QĐ 93-159; QĐ 94; VĐ 79; VĐ 55; VĐ 00326.<br /> Ngoài thu thập các giống đang sản xuất đại trà<br /> đề tài còn tiến hành thu thập thêm các giống mía<br /> mới nhập nội, giống có triển vọng để đưa vào<br /> nhân nhanh trong điều kiện in vitro. Hiện tại đề tài<br /> đã thu thập được 3 giống của Brazil: Brazil 7515<br /> (Br7515); Brazil 2 (Br2); Brazil 3280 (Br3280), 3<br /> giống của Trung Quốc: Quảng Tây 02-208; Quảng<br /> Tây 60; Liễu Thành 03-1137. Các giống mới thu<br /> thập về được đưa trồng ngoài vườn ươm, sau khi<br /> cây con mọc được sử dụng làm nguồn vật liệu cho<br /> nuôi cấy mô. Các giống hiện đang được trồng và<br /> theo dõi đánh giá ngoài đồng ruộng và đã được<br /> đưa mẫu nhân trong phòng thí nghiệm.<br /> 3.2. Nghiên cứu tạo vật liệu sạch bệnh<br /> 3.2.1. Nghiên cứu tạo vật liệu sạch bệnh ở các<br /> giống mía tuyển chọn bằng nuôi cấy chồi đỉnh<br /> và chồi nách<br /> 3.2.1.1. Chọn mẫu và xử lý mẫu<br /> <br /> Chọn những khóm mía to khoẻ không bị sâu<br /> bệnh, lấy ngọn hoặc chặt những cây non có từ 24 lóng. Cây mía còn non sức nẩy mầm và khả<br /> năng tái sinh cao, ít hoạt chất thứ cấp làm đen<br /> môi trường hơn so với ngọn già. Ngọn mía được<br /> cắt bỏ phiến lá, bóc bỏ tất cả phần bẹ lá già và<br /> các lá đã tiếp xúc với không khí và có màu lục,<br /> lau sạch bằng cồn etanol 700. Sau đó đưa ngọn<br /> vào buồng vô trùng, bóc bỏ lần lượt các lớp bẹ và<br /> lá non bên ngoài cho đến khi chỉ còn lại phần<br /> ngọn với lá non trắng nõn nằm sát chồi đỉnh.<br /> Sau đó tách lấy phần chồi nách, chồi đỉnh hoặc<br /> lá non trắng nõn nằm sát đỉnh sinh trưởng làm vật<br /> liệu nuôi cấy. Đối với cây mía, mắt mía non (chồi<br /> ngủ) và chồi đỉnh thường được bao bọc trong nhiều<br /> lớp bẹ lá, do vậy rất sạch. Dựa vào những đặc tính<br /> cơ bản đó mà chúng tôi đưa mẫu vào ống nghiệm<br /> mà không sử dụng hoá chất khử trùng.<br /> <br /> Kích thước mẫu nuôi cấy như sau:<br /> - Chồi nách: Đường kính 1,0cm  1,0cm.<br /> - Chồi đỉnh: Bóc bỏ lá non, lấy chồi non<br /> đường kính 1,5cm  1,5cm.<br /> 3.2.1.2. Môi trường nuôi cấy<br /> <br /> Môi trường cơ bản (MS): Muối đa lượng, vi<br /> lượng, vitamin, axit amin theo Murashige and<br /> Skoog (Murashige and Skoog, 1962).<br /> Môi trường MS cải tiến (Modified MS mMS): Như MS (1962) nhưng tăng nồng độ<br /> B1 lên: 1,0 mg/l + 30g/l đường + 6,0 g/l<br /> thạch, pH = 5,8.<br /> Môi trường tạo chồi cấp I: Môi trường mMS<br /> + 0,5mg/l BAP, pH = 5,8.<br /> Môi trường nhân chồi: Môi trường giống<br /> như môi trường tạo chồi cấp I, riêng nồng độ<br /> BAP, Kinetin, nước dừa có sự thay đổi tuỳ theo<br /> mục đích thí nghiệm.<br /> 3.2.1.3. Phản ứng của các giống mía khác<br /> nhau trên môi trường khởi tạo<br /> <br /> Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với13 giống<br /> thu thập được (My5514; ROC 10; HB1<br /> (ROC23); HB2 (); ROC26; QĐ 93-159; QĐ 94;<br /> VĐ 79; VĐ 55; VĐ 00326; Br7515; Br2;<br /> Br3280) trên môi trường khởi tạo để kích thích<br /> sự bật chồi mới. Tuy nhiên, do đề tài mới bắt đầu<br /> tiến hành từ tháng 7 các giống được đưa vào ở<br /> các giai đoạn khác nhau. Trong đó các giống<br /> My5514; ROC 10; HB1 (ROC23); HB2 ();<br /> ROC26; QĐ 93-159; QĐ 94 được đưa từ cuối<br /> tháng 8, Br7515; Br2; Br3280 đưa cuối tháng 10<br /> và VĐ 79; VĐ 55; VĐ 00326 đưa vào giữa tháng<br /> 12 nên kết quả nghiên cứu vẫn đang trong giai<br /> đoạn theo dõi.<br /> Kết quả theo dõi sơ bộ cho thấy các giống<br /> khác nhau có khả năng tái sinh chồi phụ rất khác<br /> nhau. Sau một tuần các giống ROC10, My5514,<br /> HB2, Br3280 tỏ ra có khả năng tái sinh mạnh hơn<br /> cả. Trong khi đó sự hình thành chồi mới ở giống<br /> QĐ 93-159, QĐ 94, Br2 xảy ra rất chậm. Sau hơn<br /> ba tuần nuôi cấy, 100% chồi đỉnh và chồi nách<br /> nuôi cấy ở ba giống ROC10; My5514, Br3280 đã<br /> bật nhiều chồi mới. Đối với giống QĐ 93-159,<br /> QĐ 94, Br2, sau 1 tuần nuôi cấy không thấy bật<br /> chồi mới, sang tuần thứ 3 mới có hiện tượng bật<br /> chồi. Nhưng tỷ lệ bật chồi rất thấp và chồi bị<br /> vàng. Khả năng tái sinh kém của một số giống có<br /> thể liên quan đến hiện tượng hoá đen môi trường<br /> do các hợp chất phenolic.<br /> 841<br /> <br /> VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br /> <br /> Hiện tượng này là đặc điểm khá đặc thù ở<br /> các giống và biểu hiện rõ nhất ở nhóm giống<br /> QĐ 93-159, QĐ 94, chồi tiết ra các hợp chất<br /> phenolic và các sản phẩm thứ cấp làm đen môi<br /> trường. Phenol tiết ra bao bọc xung quanh chồi,<br /> kìm hãm tế bào sinh sản và sinh trưởng. Chúng<br /> tôi đã thử nhiều tổ hợp các môi trường khác<br /> nhau, bổ sung thêm than hoạt tính vào môi<br /> trường nuôi cấy và các chất chống oxy hoá như<br /> axit ascorbic, antioxidant, để khử hiện tượng đen<br /> do các hợp chất chứa phenol tiết ra. Kết quả cho<br /> thấy phương pháp tốt nhất để loại trừ các hợp<br /> chất chứa phenol vẫn là cấy chuyển thường<br /> xuyên sang môi trường mới. Chồi đỉnh sau khi<br /> cấy 1 tuần, tách bỏ phần mô và tế bào bị đen, rồi<br /> chuyển chồi sang môi trường mới để loại trừ tác<br /> dụng của các hợp chất phenolic. Heinz và cộng<br /> sự (1997) cũng đã khắc phục hiện tượng hoá đen<br /> bằng biện pháp tương tự.<br /> So sánh khả năng tái sinh của hai loại chồi<br /> khác nhau cho thấy ban đầu chồi nách có khả<br /> năng tạo chồi phụ sớm hơn so với chồi đỉnh.<br /> Nhưng đến tuần thứ 3, ở một số giống, tỷ lệ bật<br /> chồi phụ của các chồi đỉnh lại vượt lên so với<br /> chồi nách và đạt tỷ lệ 100%.<br /> Sau 4 tuần nuôi cấy, khả năng tái sinh khác<br /> nhau giữa chồi đỉnh và chồi nách thể hiện rõ rệt,<br /> mỗi một chồi nách chỉ tạo 1-2 chồi, còn từ một<br /> chồi đỉnh có thể tạo ra 45-58 chồi nhỏ. Vì vậy,<br /> chồi đỉnh tỏ là vật liệu nuôi cấy tốt hơn chồi<br /> nách về cả 2 phương diện. Ít nguy cơ mang theo<br /> bệnh truyền nhiễm hơn và cho tái sinh chồi phụ<br /> mạnh hơn.<br /> 3.2.2. Nghiên cứu tạo vật liệu sạch bệnh thông<br /> qua tái sinh mô sẹo ở một số giống mía<br /> <br /> Tế bào mô sẹo đã được tạo ra bằng nuôi cấy<br /> mẫu lá non sát đỉnh sinh trưởng (Ahloowalia and<br /> <br /> Maretzki,1983; Guidedoni,1986; Taylor et al.,<br /> 1993). Môi trường MS (1962) có chứa các hàm<br /> lượng 2,4D khác nhau đã được sử dụng để tạo mô<br /> sẹo từ mẫu lá non. Nồng độ 2,4D tối ưu sử dụng<br /> để tạo và bảo quản mô sẹo thay đổi phụ thuộc vào<br /> giống. Thông thường nồng độ auxin ở môi trường<br /> tạo mô sẹo cao hơn so với môi trường nhân và bảo<br /> quản mô sẹo (Guidedoni,1986). Các chất tương tự<br /> auxin như Picloram cũng được sử dụng để tạo mô<br /> sẹo. Ho và Vasil (1983) cho biết có 3 loại mô sẹo<br /> khác nhau tái sinh từ lá mía non: Mô sẹo phôi hoá<br /> (Embryogenic mô sẹo) khác với 2 loại kia ở chỗ<br /> có cấu trúc cứng, bề mặt nhẵn, tế bào nhỏ, tròn và<br /> giàu tế bào chất. Hai loại còn lại Non Embryogenic mô sẹo thường xốp, tế bào to và dài.<br /> * Môi trường thí nghiệm:<br /> <br /> - Môi trường tạo mô sẹo: Môi trường MS +<br /> 15% nước dừa + (0-5 mg/l) 2,4D thay đổi (0;<br /> 0,5mg/l; 1mg/l; 2mg/l; 3mg/l; 4mg/l; 5mg/l),<br /> pH = 5,8.<br /> - Môi trường nhân mô sẹo: Môi trường MS +<br /> 2,4D hàm lượng thấp hơn so với môi trường tạo<br /> mô sẹo (0,5 - 1,5mg/l) + đường (20 - 30 g/l) +<br /> 15% nước dừa, pH = 5,8.<br /> - Môi trường tái sinh (tạo chồi) từ mô sẹo:<br /> Môi trường MS + (0 - 2,5mg/lBAP + 0,2<br /> Kinetine + 15% nước dừa , pH = 5,8.<br /> * Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D ở các<br /> nồng độ khác nhau kết hợp với 0,1 mg/l IBA lên<br /> quá trình phát sinh mô sẹo<br /> Lát cắt lá non sau khi cắt thành từng<br /> miếng vuông 0,5cm × 0,5cm cấy vào môi trường:<br /> mMS có bổ sung 2,4 -D với nồng độ thay đổi (0 5) mg/l. Mẫu lá đặt trên mặt thạch và nuôi trong<br /> điều kiện tối để tạo mô sẹo. Kết quả nghiên cứu<br /> được theo dõi sau 4 tuần, 8 tuần.<br /> <br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của 2,4 -D lên quá trình phát sinh mô sẹo ở hai giống mía ROC26 và HB1<br /> (tính theo tỷ lệ %)<br /> Sau 4 tuần nuôi cấy<br /> <br /> Sau 8 tuần nuôi cấy<br /> <br /> MT<br /> <br /> Nồng độ 2,4D<br /> (mg/l)<br /> <br /> Số mẫu cấy<br /> <br /> TD1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 45<br /> <br /> TD2<br /> <br /> 0,5<br /> <br /> 45<br /> <br /> 8,8<br /> <br /> 2,0<br /> <br /> 13,5<br /> <br /> 44,4<br /> <br /> TD3<br /> <br /> 1<br /> <br /> 45<br /> <br /> 13,3<br /> <br /> 35,5<br /> <br /> 22,2<br /> <br /> 55,5<br /> <br /> TD4<br /> <br /> 2<br /> <br /> 45<br /> <br /> 15,5<br /> <br /> 35,5<br /> <br /> 22,2<br /> <br /> 64,4<br /> <br /> TD5<br /> <br /> 3<br /> <br /> 45<br /> <br /> 28,8<br /> <br /> 73,3<br /> <br /> 63,1<br /> <br /> 86,6<br /> <br /> TD6<br /> <br /> 4<br /> <br /> 45<br /> <br /> 23,3<br /> <br /> 55,5<br /> <br /> 39,4<br /> <br /> 81,1<br /> <br /> TD7<br /> <br /> 5<br /> <br /> 45<br /> <br /> 20,5<br /> <br /> 27,6<br /> <br /> 26,1<br /> <br /> 45,5<br /> <br /> 842<br /> <br /> ROC26<br /> <br /> HB1<br /> <br /> ROC26<br /> <br /> HB1<br /> <br /> 1,8<br /> <br /> 2,1<br /> <br /> 2,3<br /> <br /> 2,7<br /> <br /> Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br /> <br /> Từ kết quả cho thấy nồng độ 2,4-D ảnh<br /> hưởng rất lớn đến quá trình hình thành calus.<br /> Trên môi trường đối chứng không chứa 2,4 - D<br /> thì các mẫu nuôi cấy không có phản ứng tạo mô<br /> sẹo và sau một thời gian mẫu sẽ bị đen và chết,<br /> nhưng khi bổ sung 2,4 - D với nồng độ thấp 0,5<br /> mg/l thì mô sẹo đã được hình thành và tỷ lệ tạo<br /> mô sẹo tăng lên khi tăng nồng độ 2,4D. Tỷ lệ mô<br /> sẹo tạo thành cao nhất trên môi trường có 2,4D ở<br /> nồng độ 3mg/l đạt tới 86,6% sau 8 tuần nuôi cấy<br /> ở giống ROC23 và 63,1% ở giống ROC26. Tuy<br /> nhiên khi tiếp tục tăng nồng độ 2,4-D trong môi<br /> trường nuôi cấy tỷ lệ tạo mô sẹo lại giảm dần. Ở<br /> nồng độ 5mg/l, sau 8 tuần nuôi cấy tỷ lệ tạo mô<br /> sẹo ở giống ROC26 giảm còn 26,1% và 45,5% ở<br /> giống HB1. Do lúc này nồng độ 2,4D lớn gây<br /> phản ứng ngược lại ức chế quá trình tạo mô sẹo,<br /> hình thành rễ nhiều, gây đục môi trường và một<br /> số mô sẹo bị chết đen trong môi trường.<br /> Các mô sẹo hình thành trên các môi trường<br /> này hầu hết là mô sẹo dạng cứng sau khi nuôi cấy<br /> khoảng 8 tuần đa số các mô sẹo tái sinh thành cây.<br /> Chúng tôi tiến hành thử nuôi cấy nuôi cấy<br /> mẫu lá trên các môi trường có 2,4D có bổ sung<br /> <br /> một số chất phụ gia khác như Malt extract hoặc<br /> thay đổi agar bằng chất nền khác như phytagel.<br /> Kết quả quan sát bước đầu chúng tôi nhận thấy<br /> các mô sẹo hình thành có dạng khối hạt tròn<br /> trắng dạng mô sẹo phôi hóa. Các kết quả nghiên<br /> cứu đang được tiếp tục theo dõi và nghiên cứu.<br /> 3.3. Tái sinh chồi, nhân nhanh chồi mía và tạo<br /> cây hoàn chỉnh in vitro<br /> 3.3.1. Nghiên cứu tái sinh và nhân nhanh chồi<br /> mía in vitro<br /> <br /> BAP đã được xác định là có vai trò rất lớn<br /> trong quá trình tái sinh chồi của mía (Hà Thị<br /> Thúy và cs., 2000). Tuy nhiên đối với các giống<br /> khác nhau, tác động của BAP có sự khác nhau.<br /> Davenpoort và cộng sự đã chứng minh được khi<br /> thí nghiệm Kinetin trên các loại thực vật khác<br /> nhau thì đều cho kết quả tái sinh chồi tốt hơn ở<br /> nồng độ 0,2 mg/l MT. Do vậy chúng tôi quyết<br /> định nghiên cứu thí nghiệm với nồng độ Kinetin<br /> không thay đổi trong suốt quá trình thí nghiệm là<br /> 0,2mg/l MT, BAP thay đổi nồng độ từ 0 2,5mg/l MT.<br /> <br /> Bảng 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến quá trình tái sinh chồi của hai giống mía ROC26 và HB1<br /> (sau 3 tuần nuôi cấy)<br /> MT<br /> B1<br /> B2<br /> B3<br /> B4<br /> B5<br /> B6<br /> CV (%)<br /> LSD0,5<br /> <br /> Nồng độ BAP<br /> (mg/l)<br /> <br /> Số mẫu<br /> cấy<br /> <br /> 0<br /> 0,5<br /> 1,0<br /> 1,5<br /> 2,0<br /> 2,5<br /> <br /> 150<br /> 150<br /> 150<br /> 150<br /> 150<br /> 150<br /> <br /> ROC26<br /> Số chồi thu được Hệ số nhân<br /> 518<br /> 3,4<br /> 680<br /> 4,5*<br /> 735<br /> 4,9*<br /> 987<br /> 6,5*<br /> 671<br /> 4,4*<br /> 650<br /> 4,3*<br /> 5,5<br /> 0,763019<br /> <br /> HB1<br /> Số chồi thu được Hệ số nhân<br /> 620<br /> 4,1<br /> 815<br /> 5,4*<br /> 840<br /> 5,6*<br /> 1.015<br /> 6,7*<br /> 936<br /> 6,2*<br /> 825<br /> 5,5*<br /> 5,8<br /> 0,898279<br /> <br /> Chất lượng<br /> chồi<br /> +<br /> +<br /> ++<br /> ++<br /> +<br /> <br /> * Chú giải: 5chồi × 5 cụm × 6 bình = 150 chồi<br /> (-) Chồi kém chất lượng; (+) Chồi bình thường; (++) Chồi tốt<br /> (*) Sai khác có ý nghĩa ở mức xác suất α = 0,05<br /> <br /> Từ kết quả thí nghiệm trên ta nhận thấy ở môi<br /> trường đối chứng với nồng độ BAP là 0mg/l MT<br /> thì quá trình phát sinh chồi có xảy ra nhưng với hệ<br /> số nhân thấp, chồi ngắn và không rõ chồi. Hệ số<br /> nhân giống ROC26 là 3,4, giống HB1 là 4,1.<br /> Khi nồng độ BAP tăng từ 0,5 mg/l đến 1<br /> mg/l thi chúng tôi nhận thấy ảnh hưởng của BAP<br /> lên hệ số nhân chồi là tương đối rõ rệt. Hệ số<br /> nhân tăng lên trung bình là 4,5 ở giống ROC26<br /> và 5,4 ở giống BH1.<br /> Nồng độ của BAP lên tới 1,5 mg/l MT cho<br /> hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,5 ở giống ROC26<br /> <br /> và 6,7 ở giống HB1, chất lượng chồi cũng rất tốt,<br /> chồi mập, xanh hơn và có chiều cao 5 - 8cm. Một<br /> ưu điểm nữa của vi nhân giống mía in vitro là<br /> cho hệ số nhân khá cao, điều này có ý nghĩa rất<br /> lớn trong việc tạo ra được hàng loạt các cây có<br /> đặc điểm sinh trưởng, phát triển giống nhau.<br /> Tuy nhiên khi tăng nồng độ BAP từ 2mg/l<br /> MT đến 2,5 mg/l MT hệ số nhân chồi lại không<br /> tăng mà giảm xuống chỉ còn trung bình là 4,3 ở<br /> giống ROC26 và 5,5 ở giống BH1. Nguyên nhân<br /> của hiện tượng này là do nồng độ BAP cao đã<br /> làm ức chế tới khả năng nhân chồi của hai giống<br /> 843<br /> <br />