Phân lập một số loại nấm, vi khuẩn gây bệnh trên lá phong lan giống dendnobium và giống phalaenopsis

18 KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT<br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ MÔI TRƯỜNG<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Phân lập một số loại nấm, vi khuẩn gây bệnh trên lá phong lan<br /> <br /> giống Dendnobium và giống phalaenopsis<br /> VÕ THỊ BÍCH THƯƠNG, NGUYỄN THỊ THÁI HÀ<br /> Phân hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM tại Gia Lai<br /> <br /> <br /> Mục tiêu chính của nghiên cứu là xác định các bệnh thường gặp ở phong<br /> lan giống Dendrobium và Phalaenopsis. Qua mô tả hình thái, phân loại nấm<br /> và vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp hình thái học. Kết quả cho thấy bệnh<br /> do vi khuẩn và nấm trên hai giống phong lan Dendrobium và Phalaenopsis<br /> đã phân lập được 6 chủng nấm (Alternaria sp.,Curvularia sp.,Collectotrichum<br /> sp.,Colletotrichum graminicola (Colletotrichum cereale), Colletotrichum<br /> gloeosporioides, Fusarium sp.) và 1 chủng vi khuẩn (Erwinia sp.) gây nên 7<br /> bệnh khác nhau.<br /> <br /> <br /> <br /> 1. Đặt vấn đề 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu<br /> Hoa Lan (Orchidaceae) được biết đến như 2.1. Nguyên vật liệu và môi trường<br /> một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua chúa Các mẫu lá bệnh của 2 giống Dendrobium<br /> vương giả. Ngoài vẻ đẹp rực rỡ về màu sắc, và Phalaenopsis (đối với mỗi loại bệnh ta thu<br /> quyến rũ về hình dáng, hoa lan còn được sử thập 20 lá bệnh) được thu thập. Mẫu lá sau khi<br /> dụng để tách chiết phục vụ cho một số ngành được thu thập sẽ được giữ trong túi giấy kín và<br /> công nghiệp mỹ phẩm và có nhiều giá trị nhất vận chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu được<br /> định trong y học. Trong các giống phong lan<br /> dùng trong ngày để phân lập.<br /> phổ biến ở Việt Nam hiện nay, Hoàng Lan<br /> (Dendrobium) và Hồ Điệp (Phalaenopsis) là hai Môi trường phân lập nấm gồm có: Môi<br /> giống cho hoa đẹp, phù hợp với thị hiếu người trường thạch nước cất (WA), môi trường thạch<br /> tiêu dùng nên được thị trường cả nước rất ưa đường khoai tây (PDA), môi trường Czapek,<br /> chuộng. Hiện nay, Hoàng Lan (Dendrobium) và môi trường chọn lọc Phytophthora (PSM), môi<br /> Hồ Điệp (Phalaenopsis) đã được nhân giống trường PDA một phần tư độ mạnh có bổ sung<br /> theo công nghệ nuôi cấy mô và được hoàn kháng sinh.<br /> thiện quy trình chăm sóc vào năm 2008. Tuy Môi trường phân lập vi khuẩn: Môi trường<br /> nhiên, một nguyên nhân làm suy giảm chất King’s B (KbM).<br /> lượng cũng như tính thẩm mỹ của chậu lan<br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> thương phẩm là vấn đề sâu bệnh hại. Cho nên<br /> việc chú trọng đến nghiên cứu về bệnh trên Phân lập nấm gây bệnh<br /> hai giống lan Dendrobium và Phalaenopsis là Quy trình phân lập nấm gây bệnh: Lau sạch<br /> rất cần thiết để đưa ra các giải pháp phòng và buồng cấy vi sinh bằng cồn êtyl 900. Nhúng<br /> điều trị bệnh thích hợp. dụng cụ (kẹp, kéo hoặc dao mổ) trong cồn<br />  KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT 19<br /> êtyl 900 và hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn. Rửa Dùng kéo đã hấp vô trùng cắt lá bệnh thành<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> SỐ 06 NĂM 2019<br /> sạch mẫu đối với lá và thân: rửa trong nước vô nhiều phần nhỏ, cho vào bình tam giác có<br /> trùng để loại bỏ đất, bụi và các tạp chất khác; chứa 100ml nước cất vô trùng. Lắc đều cho vi<br /> đối với rễ: rửa bằng nước vô trùng 3 lần trong khuẩn phân tán từ vết bệnh ra môi trường nước.<br /> lọ nhỏ. Thêm 1 giọt thuốc tẩy vào lọ trong lần Chuẩn bị 6 ống nghiệm có đánh số theo thứ tự<br /> rửa đầu tiên. Khử trùng bề mặt mô lá hoặc thân 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. Dùng micropipet<br /> bằng cách dùng giấy mềm (giấy ăn) đã nhúng cho vào mỗi ống nghiệm 9ml nước cất vô trùng.<br /> cồn êtyl 700 lau mặt lá hoặc bằng cách nhúng Dùng micropipet hút 1ml dung dịch mẫu bệnh<br /> nhanh lá dày vào cồn êtyl 700 trong 5 giây, rửa từ bình tam giác cho vào ống nghiệm 10-1, lắc<br /> lại trong nước vô trùng và để khô trên giấy đều. Tiếp tục dùng micropipet hút 1ml dung<br /> thấm vô trùng. Đối với rễ: nhúng rễ trong cồn dịch từ ống nghiệm 10-1 cho vào ống nghiệm<br /> êtyl 700, rửa nhanh trong nước vô trùng và để 10-2 . Làm tương tự đến ống nghiệm 10-6 . Dùng<br /> khô trên giấy thấm đã khử trùng. Dùng dụng micropipet hút 0,1ml dung dịch từ ống nghiệm<br /> cụ đã khử trùng cắt những miếng cấy nhỏ (2 x 10-5 và ống nghiệm 10-6 cho vào các đĩa petri<br /> 2mm) từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô chứa môi trường KbM hoặc WA. Dùng que gạt<br /> bệnh (lá), miếng dài 1 - 2mm ở phần ranh giới Drigalxki gạt đều dung dịch trên bề mặt đĩa<br /> giữa mô bệnh và mô khỏe (rễ). Sau đó cấy lên petri. Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ từ 25 - 300 C trong<br /> môi trường nghèo dinh dưỡng như thạch nước 1 - 2 ngày. Sau 1 - 2 ngày, chọn những khuẩn<br /> cất (WA) hoặc môi trường chọn lọc, đặt những lạc đặc trưng mọc rời rạc trên đĩa petri để cấy<br /> miếng cấy gần mép đĩa. Ấn nhẹ miếng cấy để truyền.<br /> chúng tiếp xúc tốt với mặt thạch. Đặt đĩa cấy<br /> Dùng que cấy đầu tròn đã khử trùng chạm<br /> ở nhiệt độ khoảng 250C, lí tưởng là trong điều<br /> vào khuẩn lạc được chọn và cấy lên môi trường<br /> kiện ánh sáng. Kiểm tra đĩa cấy hằng ngày, khi<br /> các tản nấm phát triển từ những miếng cấy, cấy King’s B bằng phương pháp cấy ria góc hoặc cấy<br /> truyền chúng (chú ý cắt ở mép ngoài tản nấm) ria liên tục theo hình sau:<br /> sang môi trường như PDA hay WA có chứa các<br /> miếng mô cây đã khử trùng. Các miếng mô cây<br /> đã khử trùng kích thích sự hình thành bào tử,<br /> giúp cho việc giám định tác nhân gây bệnh.<br /> Làm thuần nấm bằng cách cấy đơn bào tử nảy<br /> mầm hoặc cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm.<br /> Đối với các loại nấm sản sinh ra du động Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ từ 25 - 300 C trong 2<br /> bào tử như Phytophthora có thể được phân lập ngày. Cấy truyền một khuẩn lạc đơn mọc từ đĩa<br /> từ giá thể bằng cách bẫy như sau: Cho khoảng cấy mới sang 1 ống nghiệm chứa môi trường<br /> 100g giá thể vào một cốc nhựa. Đổ nước vô King’s B đổ nghiêng. Đây là những mẫu thuần.<br /> trùng vào cốc sao cho ngập khoảng 5 - 10cm. Lây bệnh nhân tạo<br /> Thả vào cốc những mẫu bộ phận tươi của cây<br /> Để kiểm tra các chủng nấm và vi khuẩn đã<br /> trồng mẫn cảm với bệnh, các vật liệu bẫy này sẽ<br /> phân lập được có phải là tác nhân gây bệnh, ta<br /> nổi trên mặt nước. Đặt cốc nguyên vị trí trong<br /> tiến hành lây bệnh nhân tạo. Có thể tiến hành<br /> 2 - 4 ngày. Nấm sau 2 - 3 ngày từ mép vết bệnh<br /> như sau: Dùng que cấy hay kim tiêm tạo viết<br /> đã phát triển trên vật liệu bẫy. Rửa sạch bằng<br /> thương trên lá hoặc trên thân. Gắn một miếng<br /> nước vô trùng và khử trùng bề mặt, dùng môi<br /> thạch nhỏ từ mẫu tác nhân gây bệnh đã làm<br /> trường chọn lọc để phân lập.<br /> thuần vào vị trí vết thương. Dùng que cấy hay<br /> Phân lập vi khuẩn gây bệnh kim tiêm tạo viết thương trên lá hoặc trên thân<br /> Quy trình phân lập vi khuẩn gây bệnh: cây đối chứng nhưng không gây bệnh. Dùng<br /> 20 KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT<br /> nylon bọc vết thương lại. Tưới ẩm mỗi ngày. Hình 1. Triệu chứng bệnh cháy đen đầu lá<br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ MÔI TRƯỜNG<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Kiểm tra so sánh những cây được lây bệnh và trên lan Dendrobium<br /> cây đối chứng. So sánh các triệu chứng này với (a) Vết bệnh ban đầu<br /> các triệu chứng đã quan sát trên mẫu bệnh<br /> (b) Vết bệnh sau 2 - 3 tuần<br /> trước đó.<br /> 3.1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh: Phân lập<br /> Cũng có thể sử dụng phương pháp phun các lá bị bệnh, thu được 2 chủng nấm (kí hiệu<br /> dịch bào tử lên lá cây hoặc tưới dịch bào tử vào Den1 và Den2).<br /> đất để lây bệnh nhân tạo cho cây.<br /> Bảng 1: Đặc điểm khuẩn lạc chuẩn Den 1<br /> Phân loại các chủng vi sinh vật gây bệnh trên môi trường PDA<br /> bằng phương pháp hình thái học Khuẩn lạc chủng Den1<br /> Hình dạng Kích thước Màu sắc Hệ sợi khí sinh<br /> trên môi trường PDA<br /> Các chủng nấm đã phân lập được cấy trên Có hình Phủ kín đĩa Khuẩn lạc màu Màu trắng, dài<br /> đĩa thạch PDA. Quan sát các đặc điểm hình tròn<br /> tâm<br /> đồng petri 90 mm xanh lục, tạo<br /> trong 10 ngày các vân tròn<br /> (ở giữa khuẩn<br /> lạc), ngắn hơn<br /> màu nâu đen (ở rìa khuẩn lạc)<br /> thái, màu sắc, bào tử, thể bình, giá sinh bào ở mặt dưới đĩa<br /> petri<br /> tử,... và định danh chúng bằng các khóa phân<br /> loại nấm sợi của Robert A. Samson (1984); Đặc điểm bào tử vô tính sinh ra trên môi<br /> Katsuhiko Ando (2002) và thư viện hình ảnh trường PDA: Bào tử mọc từ đỉnh tế bào trên<br /> nấm Mycology Online. cùng của cành sinh bào tử, được bao bởi 2 lớp<br /> màng. Bào tử non chỉ được phân cách bằng<br /> Các chủng vi khuẩn được cấy trên môi<br /> các vách ngăn ngang. Bào tử trưởng thành có<br /> trường King’s B, quan sát các đặc điểm hình thái<br /> thêm các vách ngăn dọc. Khi chín là một quả<br /> khuẩn lạc. Sau đó nhuộm Gram, quan sát đặc<br /> thể nhiều nhân có vách ngang và dọc.<br /> điểm vi khuẩn dưới kính hiển vi và định danh.<br /> 3. Kết quả và thảo luận<br /> 3.1. Các bệnh điều tra được trên giống lan<br /> Dendrobium và nguyên nhân gây bệnh<br /> 3.1.1. Bệnh cháy đen đầu lá<br /> 3.1.1.1. Triệu chứng bệnh<br /> (a) (b)<br /> Đầu tiên, ở đỉnh lá lan Dendrobium xuất<br /> Hình 2. Bào tử vô tính Dend1 sinh ra trên<br /> hiện đốm tròn màu nâu sậm, hơi trong. Đốm<br /> môi trường PDA (x100)<br /> này dần lan rộng ra làm toàn bộ đỉnh lá chuyển<br /> sang màu nâu sậm. Vết bệnh có thể kéo dài (a) Bào tử non nảy chồi từ đỉnh của cành<br /> chiếm 1/4 đến 1/3 chiều dài lá. Ranh giới giữa sinh bào tử<br /> vết bệnh và phần khỏe của lá có màu vàng. (b) Bào tử trưởng thành (phía trên), bào<br /> Sau khoảng 2 - 3 tuần, phần lá bị bệnh khô tử mới nảy chồi từ đuôi của một bào tử khác<br /> lại chuyển sang màu nâu đen rồi chuyển sang (phía dưới)<br /> đen. Ranh giới giữa phần bệnh và phần khỏe Định danh: Chủng Den1 được xác định là<br /> của lá có màu đen. Bệnh gây hỏng đầu lá và Alternaria sp.<br /> làm lá rụng sớm.<br /> Bảng 2: Đặc điểm khuẩn lạc chuẩn Den 2<br /> trên môi tường PDA<br /> Hệ sợi khí Khuẩn lạc chủng Den2 trên<br /> Hình dạng Kích thước Màu sắc<br /> sinh môi trường PDA<br /> Hình tròn Đường kính Khuẩn lạc Ở giữa khuẩn<br /> đồng tâm khuẩn lạc có màu lạc mọc cao<br /> đạt 6cm sau xanh lục, thành ụ với<br /> 1 tuần nuôi tạo sắc tố màu nâu, ở<br /> cấy xanh đen rìa khuẩn lạc<br /> ở mặt đáy có màu trắng<br /> đĩa petri đến xanh lục<br /> (a) (b) nhạt.<br />  KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT 21<br /> Đặc điểm bào tử vô tính sinh ra trên môi 3.1.2.2. Nguyên nhân gây bệnh<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> SỐ 06 NĂM 2019<br /> trường PDA: Bào tử mọc từ nách hoặc từ đỉnh Qua phân lập các lá bệnh, thu được 1<br /> của cành sinh bào tử, có 2 lớp màng tế bào.<br /> chủng nấm (kí hiệu Den3).<br /> Bào tử non và trưởng thành đều chỉ có các vách<br /> ngăn ngang (3 vách ngăn), không có vách ngăn Bảng 3: Đặc điểm khuẩn lạc Den3 trên<br /> dọc. Bào tử trưởng thành có hình dạng cong do môi trường PDA<br /> Hình Khuẩn lạc chủng Den3<br /> tế bào thứ 3 phát triển to hơn các tế bào còn lại. dạng<br /> Kích thước Màu sắc Hệ sợi khí sinh<br /> trên môi trường PDA<br /> <br /> Có dạng Đường kính Tạo sắc tố cam Bông xốp, vùng trung tâm<br /> tròn đồng khuẩn lạc ở cả mặt trên màu xanh lục, vùng rìa<br /> tâm đạt 7,4 cm và mặt đáy khuẩn lạc màu trắng. Trên<br /> sau 10 ngày của đĩa petri bề mặt khuẩn lạc hình thành<br /> nuôi cấy các hạt tròn màu xanh lục<br /> sẫm (đường kính 1 - 2mm).<br /> <br /> <br /> <br /> Đặc điểm của bào tử hình thành trên môi<br /> (a) (b) trường PDA: Bào tử hình thành từ cành bào tử<br /> phân sinh (hình thành trên sợi nấm). Bào tử<br /> Hình 3. Bào tử vô tính Dend2 sinh ra trên dạng hình trụ 2 đầu tù (giống quả dưa chuột),<br /> môi trường PDA (x100)<br /> đơn bào, không có vách ngăn, màu sắc trong.<br /> (a) Bào tử non mọc ra từ nách của cành<br /> sinh bào tử<br /> (b) Hình dạng bào tử trưởng thành<br /> Định danh: Chủng Den2 được xác định là<br /> Curvularia sp.<br /> 3.1.2. Bệnh đốm vòng (thán thư)<br /> 3.1.2.1. Triệu chứng bệnh<br /> Hình 5. Bào tử Den3 hình thành trên môi<br /> Ban đầu, trên lá xuất hiện các chấm nhỏ<br /> trường PDA (x100)<br /> màu nâu vàng, sau đó tiếp tục phát triển rộng<br /> dần ra thành những đốm tròn có màu nâu đậm. Định danh: Chủng Den3 được xác định là<br /> Sau một thời gian ở giữa vết bệnh chuyển dần Colletotrichum gloeosporioides.<br /> sang màu xám và xuất hiện những vân tròn 3.1.3. Bệnh thối nâu<br /> đồng tâm. Trên vết bệnh xuất hiện các chấm<br /> 3.1.3.1. Triệu chứng bệnh<br /> nổi lên màu nâu đen, đó là đĩa bào tử. Ranh giới<br /> giữa vết bệnh và phần lá khỏe thường có màu Đầu tiên, trên lá xuất hiện những đốm nhỏ<br /> nâu sẫm đến đen. Lá héo và rụng nhanh chóng. sũng nước, tròn hoặc bầu dục, thường nằm<br /> gần giữa lá. Khi bệnh tiến triển, màu các đốm<br /> thay đổi từ nâu nhạt tới nâu hạt dẻ rất đậm.<br /> Đốm lan rộng về mọi phía, cuối cùng làm thối<br /> toàn bộ lá. Nếu đốm xuất hiện ở phần gốc lá<br /> (a) (b) (c) sẽ làm thối hỏng hệ mạch dẫn, làm lá héo và<br /> Hình 4. Triệu chứng bệnh đốm vòng (thán rụng rất nhanh.<br /> thư) trên lan Dendrobium<br /> (a) Vết bệnh xuất phát từ đỉnh lá với các<br /> chấm nâu đen (đĩa bào tử) nổi lên giữa nền vết<br /> bệnh màu xám<br /> (b) Vết bệnh xuất phát từ mép lá với những (a) (b) (c)<br /> vân tròn rất rõ Hình 6. Triệu chứng bệnh thối nâu trên<br /> (c) Lá bệnh héo khô nhanh chóng lan Dendrobium<br /> 22 KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT<br /> (a) Vết bệnh xuất hiện trên lá non làm lá thành những đốm lớn màu nâu đen. Sau một<br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ MÔI TRƯỜNG<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> héo vàng rất nhanh thời gian, trung tâm vết bệnh chuyển dần sang<br /> (b) Vết bệnh trên lá già với màu nâu sậm màu vàng xám. Tại vết bệnh hình thành những<br /> hơn vân tròn đồng tâm nhăn nheo. Ranh giới giữa<br /> vết bệnh và phần lá còn lại thường có màu đen,<br /> (c) Vết bệnh lan tới đỉnh sinh trưởng làm<br /> xung quanh viền đen là phần lá bị héo vàng,<br /> thối cả ngọn<br /> tiếp đến phần lá khỏe màu xanh.<br /> 3.1.3.2. Nguyên nhân gây bệnh Qua phân<br /> lập các mẫu lá bệnh, thu được 1 chủng vi khuẩn<br /> (kí hiệu Den4).<br /> Bảng 4: Đặc điểm của khuẩn lạc vi khuẩn<br /> Den4 trên môi trường King’s B (KbM)<br /> (a) (b)<br /> Khuẩn lạc vi khuẩn Den 4 trên<br /> Hình dạng Màu sắc<br /> môi trường KbM sau 2 ngày Hình 8. Triệu chứng bệnh đốm vòng trên<br /> Tròn, lồi, nhầy, Khuẩn lạc có<br /> lan Phalaenopsis<br /> bóng, mép màu vàng nhạt.<br /> khuẩn lạc tròn Ở trung tâm có (a) Vết bệnh xuất phát từ mép lá<br /> nhẵn màu sậm hơn<br /> so với rìa khuẩn (b) Vết bệnh xuất phát từ đỉnh lá<br /> lạc.<br /> 3.2.1.2. Nguyên nhân gây bệnh: Qua phân<br /> Đặc điểm hình thái vi khuẩn Den4: Bằng lập các lá bệnh, thu được 1 chủng nấm sợi (kí<br /> phương pháp nhuộm Gram và quan sát dưới hiệu Pha1)<br /> kính hiển vi quang học ở bội giác x100. Vi khuẩn Bảng 5: Đặc điểm khuẩn lạc Pha1 trên môi<br /> Den4 có những đặc điểm sau: Den4 là vi khuẩn trường PDA<br /> Khuẩn lạc chủng Pha 1 trên<br /> Gram âm (bắt màu hồng khi nhuộm Gram). Có Hình dạng<br /> Tròn đồng tâm,<br /> Kích thước<br /> Đường kính<br /> Màu sắc<br /> Khuẩn lạc có<br /> Hệ sợi khí sinh<br /> Màu trắng hồng, bông xốp.<br /> môi trường PDA<br /> <br /> có những nếp đạt 7cm sau màu trắng sữa. Trên bề mặt khuẩn lạc hình<br /> dạng hình que, nằm riêng lẽ hay dính nhau nhăn chạy dọc<br /> từ tâm ra rìa<br /> 1 tuần nuôi<br /> cấy.<br /> Mặt đáy đĩa<br /> petri có những<br /> thành nhiều đốm đen kích<br /> thước nhỏ, tập trung nhiều<br /> khuẩn lạc vân tròn xanh nhất ở vùng trung tâm.<br /> thành từng cặp. lục xen kẽ<br /> hồng nhạt<br /> <br /> <br /> <br /> Đặc điểm bào tử Pha1 hình thành trên môi<br /> trường PDA: Bào tử đơn bào, không có vách<br /> ngăn, màu trong. Hình thoi, cong ở 2 đầu. Mọc<br /> trên các cuống bào tử đính hình trụ đơn bào,<br /> trong suốt.<br /> <br /> <br /> Hình 7. Vi khuẩn Den4 chụp dưới hính hiển<br /> vi quang học (x100)<br /> Định danh: Chủng Den4 được xác định là Hình 9. Bào tử Pha1 hình thành trên môi<br /> vi khuẩn Erwinia sp. trường PDA (x100)<br /> 3.2. Các bệnh điều tra được trên giống lan Định danh: Chủng Pha1 được xác định<br /> Phalaenopsis và nguyên nhân gây bệnh là Colletotrichum graminicola (Colletotrichum<br /> 3.2.1. Bệnh đốm vòng cereale)<br /> 3.2.1.1. Triệu chứng bệnh 3.2.2. Bệnh héo Fusarium<br /> <br /> Ban đầu, trên lá xuất hiện các chấm nhỏ 3.2.2.1. Triệu chứng bệnh<br /> màu nâu, sau đó tiếp tục phát triển rộng dần Đầu tiên, trên lá xuất hiện các triệu chứng<br />  KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT 23<br /> héo, lá mất đi độ dày vốn có, trở nên mỏng, 3.2.3. Bệnh đốm vàng lá<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> SỐ 06 NĂM 2019<br /> nhăn nheo, chuyển dần từ màu xanh sang vàng 3.2.3.1. Triệu chứng bệnh<br /> nhạt. Cuối cùng, lá héo hoàn toàn, có màu vàng<br /> sậm, xoắn lại và rụng. Bệnh thường xảy ra trước Ban đầu trên lá xuất hiện các chấm nhỏ<br /> tiên với các lá già ở phía dưới rồi lan dần đến màu vàng, lan rộng dần ra theo hình tròn hoặc<br /> các lá phía trên. hình không đều. Các chấm này lõm xuống so<br /> với bề mặt lá. Sau một thời gian, chính giữa<br /> đốm bệnh khô lại và chuyển sang màu nâu đen.<br /> <br /> <br /> <br /> (a) (b) (c)<br /> Hình 10. Triệu chứng bệnh héo Fusarium<br /> trên lan Phalaenopsis<br /> (a) Triệu chứng bệnh ban đầu (b) Toàn bộ (a) (b)<br /> lá bị héo vàng (c) Lá xoắn lại và rất dễ rụng (lá Hình 12. Triệu chứng bệnh đốm vàng lá<br /> phía dưới), lá phía trên bắt đầu xuất hiện những<br /> trên lan Phalaenopsis<br /> triệu chứng bệnh.<br /> (a) Triệu chứng bệnh ban đầu<br /> 3.2.2.2. Nguyên nhân gây bệnh : Qua phân<br /> lập các lá bệnh, thu được 1 chủng nấm sợi (kí (b) Đốm hóa nâu đen ở chính giữa<br /> hiệu Pha2) 3.2.3.2. Nguyên nhân gây bệnh: Phân lập<br /> Bảng 6: Đặc điểm của khuẩn lạc Pha2 trên các lá bệnh, thu được 1 chủng nấm sợi (kí hiệu<br /> môi trường PDA Pha3)<br /> Khuẩn lạc chủng Pha 2<br /> Hình dạng Kích thước Màu sắc Hệ sợi khí sinh<br /> trên môi trường PDA Bảng 7: Đặc điểm khuẩn lạc Pha3 trên môi<br /> Tròn đồng tâm, Đường kính Chất hòa tan Hệ sợi khí sinh<br /> phân thành 3 tầng.<br /> Ở trung tâm, các sợi<br /> khuẩn lạc đạt<br /> 5,2cm sau 1<br /> tạo nên màu<br /> vàng sậm ở<br /> phát triển mạnh<br /> có màu trắng và<br /> trường PDA<br /> nấm khí sinh mọc tuần nuôi cấy. đáy đĩa petri vàng nhạt<br /> Hệ sợi khí Khuẩn lạc chủng Pha 3<br /> cao nhất, thấp nhất Hình dạng Kích thước Màu sắc<br /> là vùng rìa khuẩn lạc. sinh trên môi trường PDA<br /> Tròn không Đường kính Khuẩn lạc Màu trắng,<br /> đều đạt 8,2 cm có màu ngắn<br /> Đặc điểm của bào tử Pha2 trên môi trường sau 1 tuần trắng, mặt<br /> nuôi cấy dưới đĩa<br /> PDA: Quan sát dưới kính hiển vi quang học, phát petri màu<br /> trắng sữa<br /> hiện được 2 loại bào tử: Các bào tử lớn có màu<br /> trong, dạng hình thoi với 2 đầu cong (1 đầu ít Đặc điểm của bào tử Pha3 sinh ra trên môi<br /> cong và 1 đầu cong nhiều hơn). Bào tử có 3 vách trường PDA: Bào tử trong suốt, hình trụ hơi bo<br /> ngăn ngang. Các bào tử nhỏ có màu trong, dạng tròn ở 2 đầu. Chiều dài gấp đôi chiều ngang.<br /> hình thoi tròn 2 đầu, không có vách ngăn ngang. Bào tử đơn bào, có 1 nhân màu sậm. Được giải<br /> phóng ra từ các bọc bào tử.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 11. Bào tử chủng nấm Pha2 trên môi Hình13. Bào tử Pha3 trên môi trường PDA<br /> trường PDA (x100) (x100)<br /> Định loại: Chủng Pha2 được xác định là Định danh: Chủng Pha3 được xác định là<br /> Fusarium sp. Collectotrichum sp.<br /> 24 KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT<br /> 3.2.4. Bệnh thối mềm Định danh: Chủng Pha4 được xác định là<br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ MÔI TRƯỜNG<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 3.2.4.1. Triệu chứng bệnh Erwinia sp.<br /> <br /> Đầu tiên, trên lá xuất hiện các vết tròn Kết luận<br /> hoặc hình dạng không cố định màu xanh nhạt, Bệnh do vi khuẩn và nấm trên hai giống<br /> trong. Các vết này lan rất nhanh, vùng bị bệnh phong lan Dendrobium và Phalaenopsis diễn<br /> úa mềm, sũng nước và có mùi hôi. Nếu vết bệnh ra liên tục trong năm nhưng ở mức độ khác<br /> xuất phát gần gốc lá, nó có thể làm thối phần nhau. Trên hai giống lan Dendrobium và<br /> gốc lá, gây rụng sớm. Nếu xuất phát từ đỉnh lá, Phalaenopsis đã phân lập được 6 chủng nấm<br /> nó sẽ làm thối toàn bộ lá. (Alternaria sp., Curvularia sp., Collectotrichum<br /> sp., Colletotrichum graminicola (Colletotrichum<br /> cereale), Colletotrichum gloeosporioides,<br /> Fusarium sp.) và 1 chủng vi khuẩn (Erwinia sp.)<br /> gây nên 7 bệnh khác nhau.Vi khuẩn Erwinia<br /> sp. là nguyên nhân gây ra bệnh thối trên cả<br /> Hình 14. Triệu chứng bệnh thối mềm trên hai giống lan Dendrobium và Phalaenopsis. Chi<br /> lan Phalaenopsis nấm Collectotrichum là nguyên nhân chính của<br /> 3.2.4.2. Nguyên nhân gây bệnh: Qua phân bệnh đốm lá trên hai giống lan Dendrobium<br /> lập các mẫu lá bệnh, thu được 1 chủng vi khuẩn và Phalaenopsis với 3 bệnh gây ra bởi 3 loài<br /> (kí hiệu Pha4). khác nhau. Bệnh gây hại lớn nhất trên lan<br /> Dendrobium là bệnh cháy đen đầu lá do nấm<br /> Đặc điểm của khuẩn lạc vi khuẩn Pha4 trên Alternaria sp. và Curvularia sp. gây nên. Bệnh<br /> môi trường King’s B (KbM): Hình dạng, có dạng gây hại lớn nhất trên lan Phalaenopsis là bệnh<br /> hình tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn<br /> héo Fusarium do nấm Fusarium sp. gây nên.<br /> nhẵn. Màu sắc: khuẩn lạc có màu vàng nhạt.<br /> Ở trung tâm có màu sậm hơn so với ngoài rìa.<br /> Đặc điểm hình thái vi khuẩn Pha4: Bằng TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> phương pháp nhuộm Gram và quan sát dưới 1. James H. Blake, Meg Williamson, Kathy Ellingson<br /> (2006), Index of Plant Diseases in South Carolina, Clemson<br /> kính hiển vi quang học ở bội giác x100. Vi khuẩn Extension.<br /> Pha4 có những đặc điểm sau: Pha4 là vi khuẩn 2. J. Duff (2002), Orchid Diseases in the Northern Territory,<br /> Department of Resources - Primary Industry, Northern Territory.<br /> Gram âm (bắt màu hồng khi nhuộm Gram). Có 3. J.S. Hu, S. Ferreira, M. Wang (1993), “Detection of<br /> dạng hình que, nằm riêng lẽ hay dính nhau Cymbidium Mosaic Virus, Odontoglossum Ringspot Virus,<br /> Tomato Spotted Wilt Virus, and Potyvirus Infexting Orchids in<br /> thành từng cặp. Hawaii”, Plant Disease, Vol (77), 464 - 468.<br /> 4. Z. Latiffah, M.Z. Nur Hayati, S. Baharuddin and Z.<br /> Maziah (2009), “Indentification and Pathogenicity of Fusarium<br /> Species Associated with Root Rot and Stem Rot of Dendrobium”,<br /> Asian Journal of Plant Pathology, Vol (1), 14 - 21.<br /> 5. John W. Miller (1990), “Bacterial Brown Spot of Orchid<br /> causes by Pseudomonas cattleyae”, Plant Pathology Circular,<br /> No. 330.<br /> 6. S. Tanaka, H. Nishii, S. Ito, and M. Kameya-Iwaki<br /> (1997), “Detection of Cymbidium Mosaic Potexvirus and<br /> Hình 15. Khuẩn lạc vi khuẩn Pha4 trên môi Odontoglossum Ringspot Tobamovirus from Thai Orchids<br /> by Rapid Immunofilter Paper Assay”, Plant Disease, Vol (81),<br /> trường King’s B (KbM) 167 - 170.<br /> 7. J.Y. Uchida and M. Aragaki (1991), “Phytophthora<br /> Diseases of Orchids in Hawaii”, Research extension series, Vol<br /> (129).<br /> 8. J. Y. Uchida and M. Aragaki (1991), “Fungal diseases<br /> of Dendrobium flowers”, Research extension series, Vol (133).<br /> 9. Janice Uchida (1995), “Bacterial diseases of<br /> Dendrobium”, Research extension series, Vol (158).<br /> <br /> <br /> Hình 16. Vi khuẩn Pha4 dưới kính hiển vi<br /> quang học (x100)<br />