Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ trên một số cây trồng cạn

Chia sẻ: Leon Leon | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

157
lượt xem 27
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bacillus thuộc nhóm vi khuẩn sống phổ biến trong đất. Một số chủng Bacillus đã được sử dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học trừ côn trùng gây hại cây trồng như Bacillus thuringiensis var Kurstaki trừ sâu tơ, Bacillus thuringiensis var Kurstaki trừ muỗi, các chế phẩm này được sản xuất với khối lượng lớn phục vụ sản xuất

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ trên một số cây trồng cạn

PHÂN L P, TUY N CH N CH NG VI KHU N Bacillus Đ I KHÁNG N M Fusarium oxysporum GÂY B NH HÉO RŨ TRÊN M T S CÂY TR NG C N Vũ Thuý Nga Summary Isolation and selection of Bacillus antagonistic to wilt caused by Fusarium oxysporum The result of study showed that some Bacillus strains can antagonistic wilt caused Fusarium oxysporum. The result of identification by sequence rARN 16S method showed that the sequence rARN 16S of 5.1 strain has 100% base similar Bacillus subtilis strain, the sequence rARN 16S of M strain has 99% base similar Bacillus velezensis and the sequence rARN 16S of B17 has 99,1% base similar Bacillus polyfermenticus. According to European Comunity, species are selected have high biosafety and it is promissing to apply in common. All of them can grow very good in MT1, 0 King and PDA medium at pH 6,5-7 and temperate 25-30 C. Keywords: Bacillus, strain, wilt, antagonistic, Bacillus polyfermenticus, Bacillus velezensis, Bacillus subtilis. I. TV N sung vào qu gen vi sinh v t m t s ch ng Bacillus thu c nhóm vi khuNn s ng ph Bacillus có kh năng c ch n m Fusarium bi n trong t. M t s ch ng Bacillus ã oxysporum gây b nh cây tr ng c n có th ư c s d ng s n xu t các ch phNm ng d ng s n xu t phân bón sinh h c ph c sinh h c tr côn trùng gây h i cây tr ng v s n xu t. như Bacillus thuringiensis var Kurstaki tr sâu tơ, Bacillus thuringiensis var Bralensis II. V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U tr mu i, các ch phNm này ã ư c s n xu t v i kh i lư ng l n ph c v s n xu t. 1. V t li u nghiên c u M t s ch ng Bacillus khác còn có kh - Các m u t, phân chu ng hoai m c, năng c ch m t s lo i n m gây b nh cây m u cây tr ng thu c h cà, h b u bí, h tr ng cũng ang ư c các nhà khoa h c u ư c thu th p t m t s nơi như: Hà quan tâm nghiên c u nh m khai thác có N i, B c Giang, Thanh Hóa, Hà Tây, Hòa hi u qu kh năng này. Công trình nghiên Bình và Vĩnh Phúc. c u ư c th c hi n theo hư ng phân l p tuy n ch n m t s ch ng Bacillus có kh - Ch ng n m b nh Fusarium năng c ch lo i n m gây b nh héo rũ cây oxysporum gây b nh cho t, dưa h u, l c tr ng c n Fusarium oxysporum, là lo i ký ư c lưu gi trong b gi ng qu gen vi sinh sinh gây h i nghiêm tr ng nhi u lo i cây v t nông nghi p t i B môn Vi sinh v t - tr ng, r t khó phòng tr b ng thu c hoá Vi n Th như ng Nông hóa. h c. Bài báo trình bày k t qu nghiên c u - Gi ng l c L50 do Trung tâm u - bư c u phân l p, tuy n ch n nh m b Vi n Cây lương th c và Cây th c phN cung m
c p. Gi ng dưa h u H c M Nhân 224, t - Phương pháp ánh giá trên cây trong cay F1 nh p n i t Hàn Qu c do Trung tâm i u ki n phòng thí nghi m và nhà lư i. Gi ng cây tr ng Trung ương 1 cung c p. Ti n hành thí nghi m tr ng cây trong nhà - Môi trư ng phân l p, nuôi c y, nhân lư i i v i gi ng l c L50, gi ng dưa h u gi ng vi sinh v t (VSV) như: King, MT1, H c M Nhân 224, gi ng t cay F1 trên n n PDA, Czapeck, Ashby, Pikovskaya). t kh trùng. Công th c thí nghi m ư c l p l i 5 l n v i khay ho c r ch a 8 - 10 kg t. 2. Phương pháp nghiên c u Các ch ng vi khuN Bacillus và n m b nh n - Phân l p vi khuN Bacillus: Các m u n Fusarium oxysporum ư c nhi m vào t, r t, cây và phân ư c thu th p, b o qu n cây con ho c h t ã n y m m v i m t nhi t phòng. Sau ó l y 10 gram m u tương ương nhau t 108 CFU/g t. Ti n nghi n m n cho vào bình tam giác ch a 90 ml hành theo dõi trong th i gian thí nghi m 45 - nư c c t kh trùng, x lý nhi t cao 60 ngày, ánh giá ch tiêu tr ng lư ng khô 0 80 - 100 C trong th i gian 5 - 10 phút. C y thân lá và xác nh t l cây b nh. trên môi trư ng King, thu nh n khuN l c n - S li u thí nghi m ư c x lý theo l n u, ti p t c làm s ch nhi u l n ư c chương trình ph n m m IRRISTAT 4.0. khuN l c thu n khi t, th ho t tính n i kháng và gi l i các khuN l c có ho t tính n III. K T QU VÀ TH O LU N cao làm các thí nghi m ti p theo. Thu th p, phân l p, tuy n ch n và ánh - c i m sinh h c c a các ch ng VSV giá ho t tính sinh h c c a các ch ng ư c xác nh theo các phương pháp nghiên Bacillus i kháng n m b nh Fusarium c u vi sinh v t h c thông thư ng. oxysporum. - Phân lo i theo phương pháp truy n ã thu th p ư c 103 m u t. Ti n th ng, h th ng BIOLOG và phương hành phân l p, tuy n ch n và xác nh ư c pháp PCR. m t s ch ng Bacillus có ho t tính i - Phương pháp ánh giá ho t tính i kháng n m b nh Fusarium oxysporum kháng n m b nh theo 10TCN 867:2006. tương i cao và n nh (B ng 1). B ng 1. K t qu phân l p và tuy n ch n các ch ng Bacillus có ho t tính i kháng Ký hi u Kh năng Vòng đ i kháng n m Fusarium oxysporum (mm) TT ch ng t o màng Gây b nh trên t Gây b nh trên l c Gây b nh trên dưa h u 1 B17 + 20,5 18,0 21,0 2 M + 21,5 19,5 22,0 3 5.1 + 20,0 15,5 19,0 +: Có kh năng t o màng S li u B ng 1 cho th y các ch ng ư cl a ch n u có vòng i kháng n m b nh m c cao, t t 15,5 n 22 mm và n nh qua các l n ánh giá.
2. c i m sinh h c, phân lo i các ch ng vi khu n Bacillus phân l p và tuy n ch n ã xác nh ư c các c i m sinh h c c a các ch ng vi khuNn Bacillus ã ư c phân l p và tuy n ch n. K t qu ư c trình Hình 1. Vòng i kháng n m Fusarium bày trong B ng 2 cho th y ây là các ch ng oxysporum c a các ch ng Bacillus có kh năng t o bào t sau 48 gi nuôi c y. B ng 2. c i m sinh h c c a các ch ng vi khu n Bacillus Ch ng vi khu n Bacillus phân l p và tuy n ch n Đ c đi m sinh hoc B17 M 5.1 Hình d ng t bào Hình que Hình que Hình que Hình d ng khu n l c Khu n l c màu vàng nh t, Khu n l c khô, màu Khu n l c màu tr ng hơi b m t nhăn, có vòng tròn tr ng vàng, mép không vàng, b m t khô, hơi đ ng tâm gi a đ u, nhân có vòng tròn nhăn, mép không đ u Bào t Xu t hi n nhi u sau 48 gi Xu t hi n nhi u sau 48 Xu t hi n nhi u sau 48 nuôi c y gi nuôi c y gi nuôi c y Ph n ng gram + + + Nhi t đ thích h p 25 - 350C 25 - 350C 25 - 350C pH 6-8 6-8 6-8 Quan h v i ôxy Hi u khí Hi u khí Hi u khí Kh năng phân gi i casein Y u Không Y u Kh năng phân gi i kitin sau 38 37 32 48 gi nuôi c y (mm) Ph n ng catalaza + + + +: Có ph n ng Trên cơ s phương pháp nh tên VSV xác nh an toàn c a các ch ng b ng k thu t phân t (16S ARN riboxom), Bacillus sau khi ư c phân l p và tuy n h th ng nh danh BIOLOG và h th ng ch n, chúng tôi ã so sánh các ch ng VSV phân lo i Bergey’s ã xác nh ư c tên nêu trên v i danh m c vi khuNn trong phân c a các vi khuNn Bacillus phân l p, tuy n nhóm các tác nhân sinh h c theo nh hư ng an toàn công ngh sinh h c c a ch n trong nghiên c u (B ng 3) CHLB c và C ng ng châu Âu (Sichere Biotechnologie: Eingruppierung B ng 3. K t qu xác nh tên và an toàn biologischer Agenzen: Bakterien- 1998). sinh h c c a các ch ng vi khu n Bacillus K t qu (B ng 3) cho th y: 3 ch ng vi khuNn Bacillus ư c phân l p và tuy n Ký M cđ STT hi u Tên vi sinh v t an toàn ch n thu c nhóm các vi khuNn có an ch ng CNSH toàn cao ( nguy hi m c p 1). Theo 1 B17 Bacillus polyfermenticus 1 Hư ng d n s 90/679/EWG ngày 26 tháng 11 năm 1990 c a C ng ng châu Âu thì 2 M Bacillus velezensis 1 VSV thu c nguy hi m c p 1 là các 3 5.1 Bacillus subtilis 1 VSV không có kh năng gây b nh i v i ngư i và ng v t.
3. M t s i u ki n sinh trư ng và phát 6,5 - 7 và nhi t 25 - 300C, không phát tri n c a các ch ng Bacillus tri n ho c phát tri n y u trong i u ki n pH Ti n hành nuôi c y các ch ng phân l p th p 4 - 4,5. Chúng u phát tri n ư c ư c trên môi trư ng dinh dư ng, k t qu nhi t cao 370C, ho t tính c ch n m cho th y trên môi trư ng MT1, King, PDA b nh Fusarium oxysporum tương i n các ch ng vi khuNn Bacillus phát tri n m nh nh trong các l n thí nghi m (B ng 5). và hình thành các khuNn l c i n hình, trên B ng 5. nh hư ng c a pH và nhi t n môi trư ng Pikovskaya và Ashby chúng kh năng phát tri n c a các ch ng vi khu n không phát tri n ho c phát tri n y u (B ng 4). Bacillus 0 B ng 4. Kh năng phát tri n c a khu n l c Ch ng pH Nhi t đ ( C) vi khu n Bacillus trên m t s môi trư ng vi khu n 4 - 4,5 6,5 - 7 8 - 8,5 25 30 37 nghiên c u B17 +/- ++ + ++ ++ + Ch ng Kh năng phát tri n trên môi trư ng M +/- ++ + ++ ++ + vi 5.1 - ++ + ++ ++ + khu n MT1 PDA Ashby King Pikovskaya Ghi chú: ++: Phát tri n m nh, khuNn l c i n hình. B17 ++ ++ - ++ +/- +/-: Phát tri n y u. M ++ ++ - ++ +/- +: Phát tri n bình thư ng. 5.1 ++ ++ - ++ - -: Không phát tri n, khuNn l c không i n hình. Ghi chú: ++: Phát tri n m nh, khuNn l c i n hình. +/-: Phát tri n y u. 4. ánh giá ho t tính i kháng n m gây +: Phát tri n bình thư ng. b nh Fusarium oxysporum c a các ch ng -: Không phát tri n, khuNn l c không i n hình. vi khu n Bacillus i v i m t s cây Ti n hành xác nh m t s i u ki n tr ng nhi t cũng như pH nh hư ng n s K t qu ánh giá ho t tính i kháng phát tri n c a các ch ng vi khuNn phân l p c a các ch ng Bacillus i v i n m ư c. Trên cơ s các k t qu thu ư c có Fusarium oxysporum trên cây t, dưa h u th nh n th y c 3 ch ng B17, M, 5.1 u và l c th hi n trong B ng 6. có th phát tri n m nh trong i u ki n pH B ng 6. nh hư ng c a các ch ng Bacillus n sinh trư ng c a m t s cây tr ng Cây l c Cây t Cây dưa h u Tr ng Tr ng Tr ng TT Công th c thí nghi m T l cây T l cây T l cây lư ng lư ng lư ng héo ch t héo ch t héo ch t khô thân khô thân khô thân (%) (%) (%) lá (g/cây) lá (g/cây) lá (g/cây) 1 Đ i ch ng (không nhi m VSV) 2,965 0 2,614 0 1,795 0 2 Nhi m n m b nh F. oxysporum - 92,7 - 96,6 - 98,0 3 Nhi m ch ng B17 3,181 0 2,562 0 1,767 0 4 Nhi m ch ng M 3,223 0 0 1,815 0 5 Nhi m ch ng 5.1 3,160 0 2,574 0 1,810 0 6 Nhi m ch ng B17+ F. oxysporum 3,040 7,3 2.735 7,0 1,837 8,2 7 Nhi m ch ng M + F. oxysporum 3,045 6,7 2,641 7,1 1,793 7,5 8 Nhi m ch ng 5.1+ F. oxysporum 3,145 8,3 2,581 7,4 1,799 7,8 CV% 13,3 7,2 1,3 LSD0,05 0,5401 0,335 0,39
T l cây b b nh héo rũ các công sai khác so v i i ch ng v i m c tin c y th c nhi m vi khuNn Bacillus B17, M, 5.1 cho phép. T l cây ch t do ư c nhi m vi u th p hơn so v i i ch ng nhi m n m sinh v t u gi m hơn so v i i ch ng. b nh Fusarium oxysporum và ch t t 6,7 n 8,3. Tr ng lư ng khô thân lá các 2. ngh công th c nhi m vi khuNn i kháng u Vi khuN n Bacillus i kháng n m b nh không sai khác so v i công th c i ch ng Fusarium oxysporum có ti m năng l n trong không nhi m. Do v y có th nói nhi m vi nghiên c u ki m soát sinh h c các ngu n sinh v t i kháng B17, M, 5.1 không nh b nh trên cây tr ng, do ó c n ư c ti p t c hư ng n sinh trư ng c a cây. nghiên c u thêm v cơ ch i kháng. IV. K T LU N VÀ N GHN TÀI LI U THAM KH O 1. K t lu n 1 guy n Lân Dũng, 1976. Th c t p vi ã phân l p, tuy n ch n ư c 3 ch ng sinh v t. NXB. i h c và THCN, Hà vi khuN n Bacillus ó là ch ng B17, M và N i. 5.1 có ho t tính i kháng v i n m b nh 2 guy n Lân Dũng, 1978. M t s Fusarium oxysporum. Trình t gen rARN phương pháp nghiên c u vi sinh v t h c 16S c a ch ng 5.1 gi ng 100% t p 1, 2, 3. Nhà xu t b n Khoa h c K (1400/1400) v i o n 16S c a vi khuN n thu t, Hà N i. Bacillus subtilis. Trình t gen rARN 16S 3 Ph m Chí Thành, 1988. Phương pháp c a ch ng M gi ng 99% (1333/1339) v i thí nghi m ng ru ng. Giáo trình, o n 16S c a vi khuN n Bacillus velezensis. Trư ng i h c Nông nghi p 1, Hà Ch ng B17 có 99,1% bazơ gi ng v i loài N i. Bacillus polyfermenticus. ây là nh ng ch ng có an toàn cao thu c các vi sinh 4 10TC 867: 2006. Vi sinh v t - Phương v t không có kh năng gây b nh i v i pháp ánh giá ho t tính i kháng n m ngư i và ng v t. gây b nh vùng r cây tr ng c n. Các ch ng vi khuN n Bacillus B17, M, gư i ph n bi n: Bùi Huy Hi n 5.1 u phát tri n m nh và hình thành các khuN n l c i n hình trên môi trư ng: MT1, King, PDA trên môi trư ng Pikovskaya và Ashby chúng không phát tri n ho c phát tri n y u. C 3 ch ng u có th phát tri n m nh trong i u ki n pH 6,5 - 7 và nhi t 25 - 300C. Chúng không phát tri n ho c phát tri n y u trong i u ki n pH th p 4 - 4,5 nhưng phát tri n ư c trong i u ki n nhi t cao 370C. Các ch ng vi khuN n Bacillus phân l p u không nh hư ng n sinh trư ng c a cây thí nghi m. Tr ng lư ng khô thân lá c a cây l c, t và dưa h u công th c nhi m vi khuN n Bacillus B17, M, 5.1 không
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 6