Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HOẠT CHẤT<br />
KHÁNG NẤM CÓ TRONG CAO CHIẾT TỪ LÁ TRẦU KHÔNG.<br />
Nguyễn Thu Gương*, Nguyễn Vũ Giang Bắc*, Lê Thị Lệ Uyên**, Nguyễn Đinh Nga*<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Mục tiêu: phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất kháng nấm có trong cao Trầu không.<br />
Vật liệu và phương pháp:<br />
Cao trầu không (cao TK): được chiết xuất từ lá Trầu không thu hái ở Hóc Môn, TP.HCM. Cao TK cho tác<br />
động kháng nấm men, nấm da, một số vi khuẩn Gram dương và Gram âm.<br />
Phương pháp phân lập hoạt chất kháng nấm từ cao TK: Sử dụng sắc ký cột với sự hỗ trợ của sắc ký lớp<br />
mỏng, kỹ thuật hiện hình sinh học, phương pháp khuếch tán và phương pháp pha loãng để xác định hoạt tính<br />
kháng nấm của hoạt chất.<br />
Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất kháng nấm trong cao TK bằng sắc ký lớp<br />
mỏng, sắc ký khí, khối phổ và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H NMR và 13C NMR).<br />
Kết quả và bàn luận:<br />
Đã phân lập và xác định được hoạt chất kháng nấm có trong cao TK là hydroxychavicol. Kết quả này phù hợp<br />
với các nghiên cứu trước đây về hoạt chất cho tác động kháng nấm – kháng khuẩn có trong cao chiết từ lá Trầu<br />
không ở Ấn Độ, Mã lai,…<br />
Từ khóa: Cao Trầu không, hydroxy chavicol.<br />
<br />
ABSTRACT<br />
ISOLATING AND DETERMINING CHEMICAL STRUCTURE OF ANTIFUNGAL PRINCIPLE AGENT<br />
IN BETLE EXTRACT<br />
Nguyen Thu Guong, Nguyen Vu Giang Bac, Le Thi Le Uyen, Nguyen Dinh Nga<br />
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 235 - 239<br />
Objectives: Isolation and determination of chemical structure of antifungal agent in the betle extract.<br />
Material and methods: Betle extract was produced from leaves of Piper betle L. Piperaceae, harvested in<br />
Hoc Mon, District 12, HCM city. The antifungal agent in betle extract was isolated by column chromatography<br />
in support with thin layer chromatography (TLC), autobiography, disk diffusion and broth dilution method.<br />
Chemical structure of the antifungal agent in betle extract were determined by using TLC, GC, GC-MS, 1H<br />
NMR and 13C NMR.<br />
Outcome: The antifungal agent in betle extract was determined as hydroxy chavicol. These results may be<br />
used in verify raw material and betle products.<br />
Key words: Betle extract, hydroxy chavicol.<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Trầu không (Piper betle L. Piperaceae) được<br />
trồng nhiều nơi ở Việt Nam. Lá Trầu không đã<br />
được dùng nhai với cau để làm chắc răng, thơm<br />
<br />
miệng. Ngoài ra, y học cổ truyền còn dùng lá<br />
Trầu không chữa cảm, giảm đau trong bong gân,<br />
làm lành vết thương, se niêm mạc, kích thích tiết<br />
men gan, làm lành vết thương, kích thích sinh<br />
<br />
* Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br />
ĐT: 0908836969<br />
Tác giả liên lạc: PGS. TS. Nguyễn Đinh Nga<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Học<br />
<br />
Email: nganguyendinh@yahoo.com<br />
<br />
235<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br />
<br />
dục, trị hắc lào, lang ben,…<br />
Trong một số nghiên cứu ở các nước Đông<br />
Nam Á như Ấn Độ, Mã Lai,.. các tác giả đã phân<br />
lập được từ cao lá Trầu không, chiết với nước<br />
hoặc cồn ethyl hợp chất hydroxychavicol(Error!<br />
Reference source not found.), và chứng minh đây là hợp chất<br />
chính cho tác động kháng khuẩn, đặc biệt là<br />
những vi khuẩn gây hôi miệng, gây sâu răng(4);<br />
kháng Aspergillus, nấm da, C. albicans, C.<br />
glabrata(Error! Reference source not found.) và kháng ung thư(1).<br />
Ở Việt Nam, cao chiết từ lá Trầu không và<br />
tinh dầu Trầu không đã được chứng minh<br />
kháng C. albicans in vitro(3), Betelvine (cao chiết từ<br />
lá Trầu không) phối hợp với sucrategel cho hiệu<br />
quả giảm đau trên các bệnh nhân viêm dạ dày<br />
mạn tính có Helicobacter pylori(6).<br />
Nhằm tạo cơ sở cho việc xây dựng tiêu<br />
chuẩn cao trầu không, hướng ứng dụng làm<br />
thuốc kháng nấm, mục tiêu chính của đề tài<br />
nhằm “Phân lập và xác định cấu trúc hóa học<br />
của hoạt chất kháng nấm có trong cao chiết từ lá<br />
Trầu không”.<br />
<br />
VẬT LIỆU -PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br />
Nguyên liệu<br />
Cao Trầu không<br />
Cao trầu không được chiết xuất từ bột lá<br />
Trầu không thu hái ở Hóc Môn, quận 12, TP.<br />
HCM theo qui trình sau: Bột lá trầu được ngâm<br />
lạnh với ethanol 96% theo tỷ lệ 1:10 trong 24h.<br />
Dịch chiết ethanol được cô ở 40 oC với áp suất<br />
giảm đến còn khoảng 1/10 thể tích ban đầu. Cao<br />
chiết 1:1 được loại chlorophyll bằng ether dầu<br />
hỏa và lắc phân bố với dichloromethan, dịch<br />
chiết dichloromethan được thu hồi dung môi ở<br />
50 oC để có cao Trầu không (cao TK). Cao TK<br />
chiết theo qui trình trên cho tác động kháng C.<br />
albicans, Trichophyton mentagrophytes, T. rubrum,<br />
T. tonsurans, Microsporum gypseum, Malassezia<br />
furfur, với MIC từ 0,064–0,512 mg/ml.<br />
Vi nấm sử dụng trong các thí nghiệm:<br />
Candida albicans ATCC 10231<br />
<br />
Phương pháp nghiên cứu<br />
236<br />
<br />
Phân lập hoạt chất kháng nấm có trong cao<br />
Trầu không<br />
Hoạt chất kháng nấm trong cao TK được<br />
phân lập bằng sắc ký cột<br />
Điều kiện sắc ký: Cột 30 cm x 0,5 cm; Chất hấp<br />
phụ: silica – gel G; cỡ hạt: 60 µm 10g hoạt hóa ở<br />
105 oC/ 1 giờ ; Lượng mẫu: 0,6 g cao CH2Cl2<br />
tương ứng với 30 g dược liệu khô; Dung môi<br />
khai triển CH2Cl2, CH2Cl2-EtOAc, MeOH; Tốc độ<br />
chảy: 11 giây/ giọt; Thể tích mỗi ống hứng: 2 ml.<br />
Gộp các phân đoạn có cùng tính chất trên sắc ký<br />
lớp mỏng, khảo sát tác động kháng nấm bằng<br />
phương pháp khuếch tán và kỹ thuật hiện hình<br />
sinh học để xác định phân đoạn chứa hoạt chất<br />
kháng nấm trong cao Trầu không.<br />
Kỹ thuật hiện hình sinh học: Phân đoạn cho<br />
tác động kháng nấm từ sắc ký cột được phân<br />
tách bằng sắc ký lớp mỏng và xác định vết sắc ký<br />
cho tác động kháng nấm. Điều kiện thực hiện:<br />
Bản mỏng Silicagel F 254 (Merck), dày 0,25 mm,<br />
20 x 20 cm; Dung môi khai triển: n- Hexan –<br />
EtOAc – MeOH (4: 2: 1); Phát hiện các vết bằng<br />
cách soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm; Vi<br />
nấm thử nghiệm: Candida albicans ATCC 10231;<br />
Môi trường thử nghiệm: thạch Sabouraud<br />
Xác định mức độ tinh khiết của hoạt chất<br />
kháng nấm bằng sắc ký lớp mỏng 2 chiều (Chiều<br />
1: CH2Cl2 – EtOAc (8:2); Chiều 2: n-Hexan –<br />
Dietylete (4:6)); sắc ký khí và phổ UV-Vis.<br />
Xác định cấu trúc của hoạt chất kháng nấm<br />
trong cao TK bằng phổ khối, 1H NMR và 13C<br />
NMR.<br />
Tác động kháng Candida albicans của cao<br />
Trầu không và hoạt chất kháng nấm được xác<br />
đinh bằng phương pháp pha loãng theo<br />
hướng dẫn của CLSI M27-A2. Môi trường sử<br />
dụng: Mueller Hinton broth bổ sung xanh<br />
methylen và glucose.<br />
<br />
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br />
Phân lập hoạt chất kháng nấm trong cao TK<br />
Phân lập hoạt chất kháng nấm trong cao TK<br />
Sau khi cao TK (0,6 g) được triển khai qua cột<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br />
đã thu được 10 phân đoạn, chỉ có PĐ 1 ở dạng<br />
dầu, màu vàng xanh (206,7 mg) và PĐ 2, tinh thể<br />
trắng xám, dễ chảy lỏng, Rf = 0,54, chiếm 307,4<br />
mg cho tác động kháng C. albicans với đường<br />
kính vòng kháng nấm là 28 mm, các phân đoạn<br />
còn lại không cho tác động kháng nấm. Sắc ký<br />
đồ của phân đoạn 2 trên sắc ký lớp mỏng sạch và<br />
tinh hơn phân đoạn 1 nên được sử dụng trong<br />
các nghiên cứu tiếp theo.<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Kiểm tra phân đoạn chứa hoạt chất kháng nấm<br />
(PĐ 2) bằng sắc ký lớp mỏng và kỹ thuật hiện<br />
hình sinh học<br />
Kết quả ở hình 1 cho thấy phân đoạn chứa<br />
hoạt chất kháng nấm chỉ cho 1 vết duy nhất ở sắc<br />
ký đồ sắc ký lớp mỏng (SKLM) một chiều (Rf =<br />
0,54) và hai chiều. Vết này cho vòng kháng nấm<br />
ở kỹ thuật hiện hình sinh học.<br />
<br />
VK<br />
<br />
1<br />
<br />
1<br />
2<br />
<br />
2<br />
<br />
A<br />
<br />
Hình 1: Phân đoạn chứa chất kháng<br />
nấm cho 1 trên sắc ký đồ SKLM và cho<br />
vòng kháng nấm xác định bằng kỹ<br />
thuật hiện hình sinh học.<br />
<br />
B<br />
<br />
Hình 2: Sắc ký đồ sắc ký 2 chiều hoạt chất chiết từ cao TK (A: Phát<br />
hiện vết bằng UV 254 nm; B: Phát hiện bằng thuốc thử VS)<br />
<br />
Kiểm tra hợp chất kháng nấm bằng UV – vis<br />
và sắc ký khí<br />
Kết quả ở hình 3 và 4 cho thấy sắc ký đồ GC<br />
của hợp chất kháng nấm trong cao TK chỉ cho<br />
một đỉnh có thời gian lưu 35,56 và phổ UV – Vis<br />
của chất này cũng chỉ có 1 đỉnh hấp thu duy nhất<br />
tại 282 nm.<br />
<br />
Hình 4: Phổ UV –Vis của hợp chất kháng nấm<br />
<br />
Xác định MIC của hợp chất phân lập từ cao<br />
TK<br />
<br />
Hình 3: Sắc ký đồ GC của hợp chất kháng nấm<br />
<br />
Từ kết quả sắc ký lớp mỏng 1 chiều, 2 chiều,<br />
kỹ thuật hiện hình sinh học, phổ UV-Vis, sắc ký<br />
khí và MIC cho thấy hợp chất có trong phân<br />
đoạn phân tách từ cao TK chỉ chứa một chất,<br />
chất này là hoạt chất chính cho tác động kháng<br />
nấm có trong lá Trầu không.<br />
Bảng 1: Nồng độ MIC của chất kháng nấm và cao TK<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Học<br />
<br />
237<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
STT Độ dịch chuyển Dạng Hằng số<br />
Số<br />
Vị trí<br />
hóa học (ppm) đỉnh ghép (Hz) proton proton<br />
7<br />
5,041-5,007<br />
D<br />
1<br />
H-3’<br />
<br />
trên C. albicans<br />
Chất thử<br />
Cao TK<br />
Chất kháng nấm trong cao TK<br />
<br />
MIC (mg/ ml)<br />
0,512<br />
0,256<br />
<br />
Xác định cáu trúc hóa học của hoạt chất<br />
kháng nấm trong cao TK<br />
Bảng 2: Dịch chuyển hóa học trong phổ 1H NMR của<br />
chất kháng nấm có trong cao TK<br />
<br />
8<br />
<br />
5,004-4,996<br />
<br />
D<br />
<br />
9<br />
<br />
3,178-3,164<br />
<br />
D<br />
<br />
8,595<br />
<br />
S<br />
<br />
3<br />
4<br />
5<br />
6<br />
<br />
6,647-6,631<br />
6,561-6,557<br />
6,426-6,406<br />
5,924-5,843<br />
<br />
D<br />
ds<br />
dd<br />
M<br />
<br />
8Hz<br />
2Hz<br />
2Hz, 8Hz<br />
<br />
1<br />
<br />
OH<br />
<br />
1<br />
1<br />
1<br />
1<br />
<br />
H-6<br />
H-3<br />
H-5<br />
H-2’<br />
<br />
H-3’<br />
<br />
1<br />
<br />
H-1’<br />
<br />
Bảng 3: Dịch chuyển hóa học trong phổ 13C NMR của<br />
chất kháng nấm có trong cao TK.<br />
STT<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
6<br />
7<br />
8<br />
9<br />
<br />
STT Độ dịch chuyển Dạng Hằng số<br />
Số<br />
Vị trí<br />
hóa học (ppm) đỉnh ghép (Hz) proton proton<br />
1<br />
8,705S<br />
1<br />
OH<br />
2<br />
<br />
7Hz<br />
<br />
1<br />
<br />
Độ dịch chuyển hóa học (ppm)<br />
145,076<br />
143,390<br />
138,292<br />
130,432<br />
118,993<br />
115,810<br />
115,475<br />
115,033<br />
38,910<br />
<br />
Vị trí C<br />
C-2<br />
C-1<br />
C-2’<br />
C-4<br />
C-5<br />
C-6<br />
C-3<br />
C-3’<br />
C-1’<br />
<br />
3'<br />
2'<br />
1'<br />
4<br />
<br />
5<br />
<br />
3<br />
<br />
6<br />
1<br />
<br />
2<br />
<br />
OH<br />
<br />
OH<br />
<br />
Hình 5. Phổ khối của hợp chất kháng nấm trong cao TK. 2-hydroxy chavicol<br />
Các kết quả thu được này có thể được ứng dụng<br />
Qua phân lập và xác định hoạt chất kháng<br />
trong kiểm nghiệm nguyên liệu và các sản phẩm<br />
nấm có trong cao TK, các dữ liệu phổ khối (hình<br />
chiết xuất từ lá Trầu không.<br />
5), 1H NMR và 13C NMR của hoạt chất kháng<br />
nấm trong cao TK, với độ dịch chuyển hóa học ở<br />
bảng 2 và bảng 3, cho thấy cấu trúc hóa học của<br />
chất kháng nấm trong cao TK phù hợp với cấu<br />
trúc của 2-hydroxychavicol với công thức<br />
nguyên C9H10O2, MW là 150 (7). Kết quả này phù<br />
hợp với các nghiên cứu trước đây về hoạt chất<br />
cho tác động kháng nấm – kháng khuẩn có trong<br />
cao chiết từ lá Trầu không ở một số nước Châu Á<br />
như Ấn Độ (2), Mã lai (4), …..<br />
<br />
KẾT LUẬN<br />
Lá trầu không đã được sử dụng nhiều trong<br />
y học cổ truyền Việt Nam từ xưa đến nay nhưng<br />
vẫn chưa được nghiên cứu một cách có hệ thống.<br />
<br />
238<br />
<br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO<br />
1.<br />
<br />
2.<br />
<br />
3.<br />
<br />
4.<br />
<br />
5.<br />
<br />
Hemamalini V, Dass Prakash MV, Sivaramakrishnan1 S<br />
(2012), “Evaluation of the In vitro antioxidant, AntiEnteropathogenic and Anticancer Efficacy of Natural and<br />
Synthetic Hydroxychavicol”, Int J Med Res.,1(5): 250-254.<br />
Kushagra N et al. (2011), “Piper betle L.: A review on its<br />
ethnobotany, phytochemistry, pharmacological profile and<br />
profiling by new hyphenated technique DART-MS (Direct<br />
Analysis in Real Time Mass Spectrometry)”, Journal of<br />
Pharmacy Research, 4(9): 2991-2997.<br />
Nguyễn Đinh Nga, Nguyễn Văn Thanh (2010), “Thành phần<br />
và tác động kháng Candida spp. của tinh dầu và cao chiết từ<br />
lá Trầu không Việt Nam”, Tạp chí Dược Học, 410: 27-30.<br />
Nalina T and Rahim ZHA, (2007), “The Crude Aqueous<br />
Extract of Piper betle L. and its Antibacterial Effect Towards<br />
Streptococcus mutans”, American Journal of Biotechnology<br />
and Biochemistry 3 (1): 10-15.<br />
Rahul S. et al. (2009), “Antibacterial Activity of Fresh leaves of<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br />
<br />
6.<br />
<br />
7.<br />
<br />
Piper betle Linn”, The Pharma Research, 01: 110-113.<br />
Tạ Thu Thủy, Nguyễn Văn Toại (2011), “Đánh giá tác dụng<br />
giảm đau của phác đồ BETELVINE (TRẦU KHÔNG) +<br />
SUCRATEGEL (BS) trong điều trị chứng viêm dạ dày mạn<br />
tính nhiễm HP (vị quản thống)”, Y học thực hành, 7(774): 159.<br />
Properties of Hydroxy chavicol, http://chemeo.com/cid/33057-2.<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Học<br />
<br />
Ngày nhận bài báo:<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
11.12.2012<br />
<br />
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 22.12.2013<br />
Ngày bài báo được đăng:<br />
<br />
10.03.2014<br />
<br />
239<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
