Phân lập và xác định gen BPMS trên NST 20p11.23 là gen ứng viên gây béo phì trong hội chứng MOMO

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH GEN BPMS TRÊN NST 20p11.23<br /> LÀ GEN ỨNG VIÊN GÂY BÉO PHÌ TRONG HỘI CHỨNG MOMO<br /> Vũ Phi Yên*, Taine Laurence**, Trần Công Toại*, Briault Sylvain***<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn ñề: Béo phì là một bệnh lý phức tạp, hiện nay ñã trở thành một ñại dịch mới tầm cỡ toàn cầu. Việc<br /> nghiên cứu xác ñịnh ñầy ñủ các gen liên quan ñến béo phì rất ñược trông ñợi nhằm giúp chúng ta nắm ñược bức<br /> tranh tổng quan về cơ chế bệnh sinh của bệnh lý này, nhằm phát triển các chiến lược dự phòng và ñiều trị hiệu<br /> quả. Nhìn chung, các dạng béo phì hội chứng thường có liên quan ñến bất thường nhiễm sắc thể.<br /> Mục tiêu: Chúng tôi nghiên cứu tìm gen gây béo phì bệnh lý từ một chuyển ñoạn ñồng hợp<br /> t(16;20)(q21;p11.23) trên một bé trai với hội chứng MOMO, một hội chứng hiếm với béo phì là triệu chứng quan<br /> trọng nhất.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Xác ñịnh chính xác hai ñiểm gãy bằng các phương pháp lai FISH, PCR ñoạn<br /> dài, phân tích trình tự. Nghiên cứu gen ứng viên bằng các phương pháp phân tích tin sinh học in silico, RT-PCR,<br /> RACE-PCR trên các mô ñích như não, mô mỡ.<br /> Kết quả: Sau khi xác ñịnh ñược chính xác hai ñiểm gãy và khảo sát các gen trong vòng 1,5 Mb quanh hai<br /> ñiểm gãy, chúng tôi nghiên cứu một gen mới bị cắt ñứt bởi ñiểm gãy NST 20 và ñề nghị gọi tên là BPMS<br /> (BreakPoint in the MOMO Syndrome), có biểu hiện mô tương hợp với bệnh sinh của béo phì, và mất biểu hiện<br /> trên bệnh nhân. Chúng tôi ñề nghị xem ñây là gen ứng viên gây hội chứng MOMO do vị trí và sự mất biểu hiện<br /> của gen này trên bệnh nhân. Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi về cấu trúc hoàn chỉnh của BPMS, ñặc biệt là<br /> các isoform của gen này trong não cung cấp những hiểu biết nền tảng cho việc nghiên cứu các chức năng của gen<br /> này trong tương lai.<br /> Từ khóa: Béo phì bệnh lý, Phân lập từ vị trí, Điều hòa cảm giác thèm ăn, hội chứng MOMO.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF THE BPMS GENE ON CHROMOSOME 20P11.23 AS<br /> CANDIDATE GENE FOR A SYNDROMIC OBESITY: MOMO SYNDROME<br /> Vu Phi Yen, Taine Laurence, Tran Cong Toai, Briault Sylvain<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 - 2010: 195 - 201<br /> Introduction: Obesity is a complex disease which has become a new and dangerous global epidemic. The<br /> identification of genes involved in obesity is expected to increase our understanding of its pathogenesis.<br /> Frequently, syndromic cases of obesity are associated with chromosomal anomalies.<br /> Objective: We report on the clinical, cytogenetic and molecular findings in a boy with MOMO syndrome, a<br /> rare syndrome with morbid obesity, and our positional cloning strategy to identify the candidate genes from his<br /> homozygous translocation t(16;20)(q21;p11.23).<br /> Results: The fine mapping work identified the breakpoint of chromosome 20, which disrupts a new gene:<br /> BPMS (BreakPoint in the MOMO Syndrome). We suggest that BPMS is a candidate gene for this syndromic<br /> obesity in basing on its position and its loss of expression in the patient. The results of our explorations of its<br /> complete structure and its isoforms in the brain laid the groundwork for the further investigation on its functions.<br /> Keywords: Morbid obesity, Positional cloning, Appetite regulation, MOMO syndrome<br /> béo phì chiếm ña số trong cộng ñồng thường là kết<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> quả<br /> sự tương tác giữa cơ ñịa di truyền của một cá thể<br /> Béo phì là một bệnh lý phức tạp trong ñó yếu tố<br /> (1)<br /> và<br /> các<br /> yếu tố môi trường (xã hội, thói quen ăn uống,<br /> di truyền góp phần từ 40 – 70% . Các trường hợp<br /> lối sống)(10). Những trường hợp béo phì nghiêm trọng<br /> Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam.<br /> Khoa Di truyền Y học, Bệnh viện Pellegrin, Bordeaux, Pháp.<br /> ***INSERM Đơn vị nghiên cứu 619, Trường Đại học François Rabelais, Tours, Pháp.<br /> Địa chỉ liên hệ: TS.BS.Vũ Phi Yên ĐT: 0907.822.538<br /> Email: vuphiyen@pnt.edu.vn<br /> *<br /> <br /> **<br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Kỹ Thuật Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2010<br /> <br /> 195<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010<br /> ñược nghiên cứu sâu giúp phát hiện nhiều gen quan<br /> trọng trong ñiều hòa cán cân năng lượng của cơ<br /> thể(2,9). Tổn thương các gen này gây nhiều bệnh lý béo<br /> phì ñơn gen trầm trọng và xuất hiện sớm ở trẻ em(9).<br /> Trong trường hợp bình thường, cán cân năng<br /> lượng của cơ thể ñược ñiều hòa rất chặt chẽ, chủ yếu<br /> thông qua việc ñiều hòa cảm giác no và ñói hay thèm<br /> ăn(4,6). Khi cơ thể cần năng lượng, nội tiết tố Ghrelin<br /> ñược tiết ra từ dạ dày, tác ñộng lên thụ thể ñặc hiệu ở<br /> vùng dưới ñồi, kích thích tổng hợp hai loại<br /> neuropeptid NPY và AgRP gây cảm giác ñói, thèm<br /> ăn(4,6). Các yếu tố gây cảm giác no quan trọng là<br /> Leptin (nội tiết tố từ tế bào mỡ), Serotonin (từ các tế<br /> bào thần kinh tiết serotonin) cũng tác dụng lên thụ thể<br /> ñặc hiệu của chúng ở vùng dưới ñồi, kích thích tổng<br /> hợp Proopiomelanocortin (POMC)(4). POMC ñược xử<br /> lý thành alpha MSH, chất này tác ñộng lên các thụ thể<br /> MC3R và MC4R, gây cảm giác no(4,7). Ngoài ra, các<br /> gen tham gia vào sự hình thành phôi học của các nhân<br /> thần kinh của vùng dưới ñồi (ví dụ như gen SIM1),<br /> một khi bị tổn thương cũng gây béo phì bệnh lý (12).<br /> Phần lớn các gen quan trọng kể trên ñã trở thành tâm<br /> ñiểm của các chiến lược ñiều trị. Nhưng hiện nay,<br /> ñiều trị béo phì bệnh lý vẫn còn ñem lại kết quả khá<br /> hạn chế, gợi ý rằng còn nhiều gen quan trọng trong<br /> bệnh sinh của béo phì chưa ñược khám phá. Cũng vì<br /> lý do này, một chiến lược toàn diện chẩn ñoán nguyên<br /> nhân của béo phì chưa thể ñược hoàn thiện do chưa<br /> hiểu biết ñầy ñủ về bệnh sinh, vì vậy hiện nay việc<br /> chẩn ñoán bệnh lý này vẫn còn chủ yếu dựa trên lâm<br /> sàng. Trong bối cảnh này, chúng ta rất cần nghiên cứu<br /> tìm các gen còn lại, những “mắt xích còn thiếu” trong<br /> bức tranh chung về ñiều hòa cán cân năng lượng của<br /> cơ thể.<br /> Bên cạnh các bệnh lý béo phì ñơn gen, có các<br /> dạng béo phì hội chứng, trong ñó triệu chứng béo phì<br /> là tiêu chuẩn chẩn ñoán quan trọng nhất. Tổn thương<br /> di truyền trong các trường hợp này thường là tổn<br /> thương một gen ñiều hòa, hoặc tổn thương nhiễm sắc<br /> thể. Hội chứng MOMO là một hội chứng hiếm với 3<br /> trường hợp ñược báo cáo trên thế giới (ñến thời ñiểm<br /> chẩn ñoán của bệnh nhân trong nghiên cứu của chúng<br /> tôi)(5,13). MOMO là các chữ viết tắt của Macrosomia,<br /> Obesity, Macrocephaly, and Ocular Abnormalities:<br /> chứng khổng lồ, béo phì, ñầu to, và bất thường mắt.<br /> Với các trường hợp ñã ñược báo cáo, các triệu chứng<br /> như chậm phát triển tâm thần vận ñộng, xương ñùi<br /> cong…cũng ñược ghi nhận, và không có các trường<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> hợp bệnh khác trong gia ñình, cha mẹ không ñồng<br /> huyết. Do ñó, các tác giả ñầu tiên ñặt giả thiết rằng<br /> ñây là bệnh di truyền trội.<br /> <br /> Mục tiêu nghiên cứu<br /> Phân lập gen ứng viên gây ra hội chứng béo phì<br /> bệnh lý, trên một bệnh nhân có chuyển ñoạn ñồng hợp<br /> giữa các nhiễm sắc thể 16 và 20 và mắc hội chứng<br /> MOMO.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU<br /> Bệnh nhân<br /> Bệnh nhân ñầu tiên ñược khảo sát là một bé trai<br /> người Pháp gốc du mục, con ñầu tiên của cặp cha mẹ<br /> ñồng huyết (mức ñộ 2) (Hình 1). Khi sinh, bệnh nhân<br /> ñủ tháng, ghi nhận chứng khổng lồ (cân nặng 4,85 kg,<br /> +3 ñộ lệch chuẩn). Kể từ 18 tháng, bệnh nhân ăn rất<br /> nhiều và từ 2 tuổi ñược theo dõi do béo phì. Khám<br /> lâm sàng tại khoa Di truyền Y khoa (bệnh viện<br /> Pellegrin, Bordeaux) ghi nhận: bệnh nhân 6 tuổi rưỡi,<br /> cân nặng 74 kg (+ 20 ĐLC), cao 124 cm (+ 1,5 ĐLC),<br /> chu vi vòng ñầu 57 cm (+ 4 ĐLC)<br /> (<br /> <br /> Hình 2). Bệnh nhân có triệu chứng bất thường<br /> mắt (cận thị, loạn thị, thiểu sản thần kinh thị), thiểu<br /> sản bộ phận sinh dục, xương ñùi cong, cao huyết áp,<br /> chậm phát triển trí tuệ. Ngoài ra, bệnh nhân có một số<br /> dấu hiệu dị dạng nhỏ: mũi tròn hình củ hành, gốc mũi<br /> rộng, mắt xếch hình hạnh nhân, tật ngón ngắn. Tiền<br /> sử gia ñình ghi nhận bệnh nhân có người anh họ, cũng<br /> có cha mẹ ñồng huyết (mức ñộ 2), và biểu hiện lâm<br /> sàng tương tự. Tuy nhiên, chúng tôi không thu nhận<br /> ñược bệnh nhân này tham gia nghiên cứu (do không<br /> liên lạc ñược với gia ñình) (Hình 1).<br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Kỹ Thuật Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2010<br /> <br /> 196<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010<br /> <br /> Hình 1: Cây gia hê bệnh nhân ñầu tiên nghiên cứu<br /> Tập hợp các triệu chứng lâm sàng trên hướng<br /> chẩn ñoán ñến hội chứng MOMO. Các chẩn ñoán<br /> phân biệt là hội chứng Prader-Willi và hội chứng<br /> nhiễm sắc thể X dễ gãy, lưỡng bội cùng nguồn cha<br /> hoặc mẹ (uniparental disomy) ñều ñược xét nghiệm<br /> và loại trừ. Nhiễm sắc thể ñồ cho thấy cha và mẹ bệnh<br /> nhân cùng có chuyển ñoạn t(16;20)(q21;p11.23), và<br /> bệnh nhân nhận ñược cả hai NST 16 chuyển ñoạn và<br /> cả hai NST 20 chuyển ñoạn, nói cách khác, bệnh nhân<br /> có chuyển ñoạn ñồng hợp t(16;20)(q21;p11.23).<br /> Hướng ñến thu thập nhiều bệnh nhân hơn phục vụ<br /> cho phân lập gen, chúng tôi thực hiện kêu gọi hợp tác<br /> quốc tế nhằm có ñược ADN các bệnh nhân mắc hội<br /> chứng này. Kết quả thu nhận ñược thêm 9 bệnh nhân<br /> từ Pháp, Bỉ, Brasil. Các kết quả thí nghiệm trên bệnh<br /> nhân ñược so sánh với kết quả của một nhóm chứng,<br /> gồm 50 bệnh nhân tại bệnh viện Pellegrin, Bordeaux,<br /> nhập viện vì các lý do khác béo phì, tuổi nhỏ hơn 15<br /> và cân nặng bình thường (BMI trong khoảng 20 - 25).<br /> <br /> Hình 2: (2a) Bệnh nhân lúc 6 tuổi rưỡi. (2b) X quang<br /> xương ñùi trái<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Đối với bệnh nhân ñầu tiên ñược khảo sát, các tế<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> bào lympho trong máu ngoại vi ñược nuôi cấy, thu<br /> hoạch làm NST ñồ và FISH, chiết tách ADN và ARN<br /> (với các bộ kit Promega và Ambion); một phần các tế<br /> bào lympho ñược bất tử hóa bằng virus Ebstein Barr<br /> và lưu giữ lâu dài, duy trì nguồn tế bào bệnh nhân.<br /> Đối với nhóm chứng, ADN và ARN ñược chiết xuất<br /> từ các tế bào lympho trong máu ngoại vi (với các bộ<br /> kit Promega và Ambion). Đối với 9 bệnh nhân<br /> MOMO ñược thu thập thêm, ADN ñược chiết xuất từ<br /> các tế bào lympho trong máu ngoại vi (với bộ kit<br /> Promega).<br /> (1). Xác ñịnh chính xác hai ñiểm gãy NST 16 và<br /> 20 trong chuyển ñoạn t(16;20)(q21;p11.23) bằng các<br /> phương pháp:<br /> - Thực hiện nhiều ñợt FISH tìm các ñoạn mồi<br /> nằm vắt ngang hai ñiểm chuyển ñoạn. Các ñoạn mồi<br /> FISH sử dụng là các BAC (Bacterial artificial<br /> chromosome) (Invitrogen) ñược phóng ñại trong E.<br /> coli nuôi trong môi trường Luria Broth; phân lập và<br /> tinh sạch bằng phương pháp cột ái lực ADN (bộ kit<br /> Qiagen); và ñánh dấu huỳnh quang bằng kỹ thuật tổng<br /> hợp các mạch ñứt gãy (bộ kit Abbott). Các ñợt FISH<br /> này nhằm thu hẹp vùng mục tiêu nghiên cứu.<br /> Phân tích các vùng mục tiêu ñã thu hẹp bằng<br /> nhiều ñoạn PCR ñoạn dài (bộ kit Roche) và tổng hợp<br /> các ñoạn nối 16 – 20 trên các nhiễm sắc thể chuyển<br /> ñoạn.<br /> Giải trình tự các ñoạn nối 16 – 20 trên các nhiễm<br /> sắc thể chuyển ñoạn (bộ kit Applied Biosystems).<br /> (2). Khảo sát các gen quanh hai ñiểm gãy và chọn<br /> gen ứng viên<br /> Các gen trong vòng 1,5 Mb quanh hai ñiểm gãy<br /> ñều ñược khảo sát về sự biểu hiện trong các mô (mô<br /> não và mô mỡ, Clontech), theo từng giai ñoạn phát<br /> triển, các chức năng ñã biết và tương tác. Các thông<br /> tin ñược thu thập từ các ngân hàng dữ liệu di truyền<br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Kỹ Thuật Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2010<br /> <br /> 197<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010<br /> lớn như NCBI, Ensembl, UCSC, Aceview.<br /> Các gen này ñược khảo sát tìm biểu hiện trên tế<br /> bào lymphô của người chứng bằng RT-PCR (với các<br /> bộ kit Invitrogen và Applied Biosystems) và so sánh<br /> với biểu hiện trên bệnh nhân.<br /> (3). Nghiên cứu gen ứng viên<br /> Gen ứng viên ñược nghiên cứu in silico (dùng các<br /> ứng dụng BLAST, Pfam); khảo sát các biểu hiện trên<br /> tế bào lympho của người chứng, so sánh với bệnh<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> nhân, tìm sự biểu hiện trong mô não và mô mỡ bằng<br /> RT-PCR, RT-PCR ñịnh lượng (với các bộ kit<br /> Invitrogen, Applied Biosystems và Stratagene).<br /> Cấu trúc hoàn chỉnh của gen ứng viên ñược tìm<br /> bằng kỹ thuật RACE-PCR (với các bộ kit Invitrogen<br /> và Clontech).<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Xác ñịnh hai ñiểm gãy NST 16 và 20<br /> <br /> Hình 3: Giải trình tự hai ñiểm gãy<br /> <br /> Hình 4: Kết quả RT-PCR các gen quanh ñiểm gãy<br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Kỹ Thuật Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2010<br /> <br /> 198<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Hình 5: Quá trình phân lập gen dựa theo vị trí và cấu trúc ñầy ñủ của gen RP5-872K7.2<br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Kỹ Thuật Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2010<br /> <br /> 199<br /> <br />