Phân loại và nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018<br /> <br /> PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ<br /> TỪ MÔ DÂY RỐN<br /> Lê Thị Bích Phượng*; Đỗ Minh Trung**; Lê Văn Đông**<br /> Đỗ Quyết**; Đồng Khắc Hưng**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: phân lập và nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn. Đối tượng và phương<br /> pháp: mẫu dây rốn (n = 5) thu nhận tại Khoa Sản, Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh, được xử lý cắt<br /> 2<br /> thành những mảnh mô nhỏ kích thước khoảng 2 mm và nuôi cấy trong môi trường chuyên biệt<br /> để phân lập tế bào. Tế bào sau khi phân lập nuôi cấy tăng sinh được kiểm tra tính gốc thông<br /> qua các chỉ tiêu như khả năng bám dính trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy, biểu hiện các dấu ấn bề<br /> mặt cho dòng tế bào gốc trung mô trong giai đoạn nuôi cấy. Đánh giá tính an toàn của quá trình<br /> phân lập qua kết quả kiểm tra nhiễm sắc thể đồ, nội độc tố và mycoplasma. Kết quả: phân lập<br /> và nuôi cấy được tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn, tế bào thu nhận được có khả năng bám<br /> dính vào bề mặt bình nuôi cấy, tế bào có dạng thuôn dài, giống với nguyên bào sợi, biểu hiện<br /> dương tính với các dấu ấn CD44, CD73, CD90 (> 95%) và âm tính với các dấu ấn CD14,<br /> CD45, HLADR (< 5%). Kết quả đánh giá tính an toàn của mẫu tế bào MSC phân lập được,<br /> kết quả âm tính với nội độc tố và mycoplasma. Kết luận: đã phân lập và nuôi cấy được tế bào<br /> gốc trung mô từ mô dây rốn, tế bào đạt các tiêu chí của tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn và<br /> đảm bảo tính an toàn để ứng dụng trong điều trị lâm sàng.<br /> * Từ khóa: Tế bào gốc trung mô; Mô dây rốn; Phân lập tế bào gốc trung mô.<br /> <br /> Isolation and Culture of Mesenchymal Stem Cells from Umbilical<br /> Cord Tissues<br /> Summary<br /> Objectives: To isolate and culture umbilical cord tissue mesenchymal stem cells. Subjects<br /> and method: Using human umbilical cords (n = 5) for isolated mesenchymal stem cells were<br /> collected from the Obstetrics Department, Vanhanh General Hospital. After harvested, cords<br /> 2<br /> were segmented into small pieces about 2 mm in size, cultured in a specialized medium for<br /> isolation of mesenchymal stem cells. These stem cells were tested stemness based on criteria<br /> such as their ability to stick on the surface of culture flasks, expression of surface markers of<br /> mesenchymal stem cell lines during the culturing period. Safety evaluation was investigated by<br /> examining karyotype, and the presence of endotoxin, mycoplasma. Results: Umbilical cord mesenchymal stem cells samples were successfully solated and cultured. The obtained<br /> cells have ability to attach to the surface of culture flasks and having fibroblast-like shape.<br /> * Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh<br /> ** Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 10/03/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 15/05/2018<br /> Ngày bài báo được đăng: 25/06/2018<br /> <br /> 22<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018<br /> These cells were positive with markers: CD44, CD73, CD90 (> 95%) and negative with marker<br /> CD14, CD45, HLADR and passed the safety test with endotoxicity and mycoplasma.<br /> Conclusions: We were successful in isolation, expansion of umbilical cord - mesenchymal stem<br /> cells. The cell population met the criteria of UC-MSC and ensure safety for use in treatment.<br /> * Keywords: Mesenchymal stem cell; Umbilical cord tissue; Isolation of mesenchymal<br /> stem cells.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tế bào gốc trung mô (TBGTM) là một<br /> nguồn tế bào gốc được sử dụng phổ biến<br /> trong liệu pháp tế bào và liệu pháp gen [1].<br /> Tương tự các kiểu tế bào gốc khác,<br /> TBGTM là nhóm tế bào gốc đa tiềm năng,<br /> có khả năng tự làm mới cao. TBGTM có<br /> thể biệt hóa in vitro hay in vivo thành cả<br /> hai dòng tế bào thuộc và không thuộc<br /> trung mô.<br /> <br /> TBGTM ngày càng được ứng dụng rộng<br /> rãi trong các thử nghiệm lâm sàng điều trị<br /> bệnh về miễn dịch và thoái hóa như bệnh<br /> mô ghép chống túc chủ (Graft versus host<br /> disease - GVHD), bệnh Crohn, bệnh tiểu<br /> đường, suy thận, bệnh lý thần kinh như<br /> chấn thương tủy sống... [5, 6] và gần đây<br /> là trong nghiên cứu về liệu pháp gen đích<br /> trong điều trị ung thư [7]. Kết quả thử nghiệm<br /> khả quan về tính an toàn và hiệu quả<br /> của liệu pháp điều trị, đặc biệt không ghi<br /> nhận tác dụng phụ lâu dài hay hình thành<br /> khối u hoặc loại thải tế bào trong quá trình<br /> điều trị thử nghiệm [8].<br /> <br /> Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy,<br /> dây rốn người là nguồn giàu TBGTM [2].<br /> So với các nguồn khác, mẫu dây rốn có<br /> các ưu điểm: thu nhận mẫu dây rốn<br /> tương đối dễ dàng, không gặp phải các<br /> rào cản về vấn đề đạo đức y khoa như<br /> trường hợp thu nhận tế bào gốc phôi;<br /> không gây xâm lấn, không ảnh hưởng tới<br /> cả sản phụ và trẻ sơ sinh; số lượng tế<br /> bào nhiều hơn và đặc điểm tự làm mới<br /> cũng nhanh hơn [2, 3] và có thể sử dụng<br /> cả nguồn dây rốn sẵn có từ việc lưu trữ<br /> tại các ngân hàng tế bào gốc.<br /> <br /> Với những kết quả đã được thử nghiệm<br /> cùng với nhu cầu điều trị hiện nay,<br /> TBGTM từ mô dây rốn thật sự là một giải<br /> pháp an toàn, tiện lợi, kịp thời cho bệnh<br /> nhân (BN) mắc bệnh hiểm nghèo và<br /> không đủ điều kiện thu nhận tế bào tự<br /> thân cho lộ trình điều trị bằng tế bào gốc.<br /> Đảm bảo tiết kiệm thời gian và giảm thiểu<br /> nguy cơ gây xâm lấn tới sức khỏe, tinh thần<br /> BN trong thời gian điều trị.<br /> <br /> Với những đặc tính ưu việt như trên,<br /> cùng tính sinh miễn dịch thấp, biểu hiện<br /> thấp HLA lớp I và không biểu hiện HLA<br /> lớp II nên TBGTM là một giải pháp hữu<br /> hiệu cho liệu pháp điều trị ghép tế bào<br /> gốc đồng loài [4].<br /> <br /> Xuất phát từ những vấn đề trên,<br /> nghiên cứu đã: Tiến hành phân lập và<br /> nuôi cấy tăng sinh TBGTM từ mô dây rốn<br /> tại Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh nhằm<br /> tạo nguồn tế bào phục vụ cho nghiên cứu<br /> và ứng dụng trong điều trị.<br /> 23<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018<br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng nghiên cứu.<br /> Mẫu dây rốn (n = 5) sử dụng cho phân<br /> lập nuôi cấy TBGTM được thu nhận trong<br /> điều kiện vô trùng tại Khoa Sản, Bệnh viện<br /> Đa khoa Vạn Hạnh, thỏa mãn các điều<br /> kiện: sản phụ < 30 tuổi, sinh con đủ tháng;<br /> kết quả xét nghiệm âm tính với HIV, HAV,<br /> HBV, HCV và giang mai; dây rốn trơn,<br /> nhẵn, hồng.<br /> Dây rốn sau khi thu nhận được đặt<br /> trong dung dịch nước muối vô trùng (natri<br /> clorid 0,9%), bảo quản ở điều kiện nhiệt<br /> độ khoảng 40C và chuyển mẫu về phòng<br /> thí nghiệm, thời gian lưu mẫu tối đa không<br /> quá 72 giờ.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> <br /> 5% C02. Theo dõi khả năng bám dính của<br /> mẫu mô sau 24 giờ và 72 giờ trải mẫu.<br /> Thay môi trường 3 ngày/lần. Đến khi tế<br /> bào xuất hiện, mọc dày bao quanh mảnh<br /> mô, tiến hành tách tế bào và chuyển qua<br /> các bình nuôi mới để nuôi và tiếp tục nuôi<br /> cấy mẫu mô trong bình nuôi chứa môi<br /> trường MSC Cult Clinic completed mới.<br /> * Nuôi cấy TBGTM:<br /> Nuôi TBGTM trong môi trường MSC<br /> Cult, thay môi trường 3 ngày/lần và tiến<br /> hành cấy chuyền khi tế bào bám dính,<br /> tăng sinh mật độ đạt khoảng 70 - 80%<br /> diện tích bề mặt bình nuôi cấy. Tách tế bào<br /> bằng enzym Detachment (RegenmedLab,<br /> Việt Nam), ly tâm ở tốc độ 2.500 vòng/<br /> 5 phút. Tiến hành cấy chuyển tế bào với<br /> tỷ lệ 1:2 hoặc 1:3, cấy chuyển TBGTM tới<br /> lần cấy chuyển thứ 4.<br /> <br /> * Nuôi cấy mô dây rốn phân lập tế<br /> bào gốc:<br /> <br /> * Đánh giá chất lượng quần thể tế bào<br /> phân lập:<br /> <br /> Mẫu mô được phân lập theo quy trình<br /> chuyển giao từ Viện Tế bào gốc, Đại học<br /> Khoa học Tự nhiên: tiến hành giải xoắn<br /> dây rốn, cắt tại những chỗ xoắn thành<br /> từng đoạn ngắn, xẻ dọc mỗi đoạn ngắn,<br /> mở trải ra thành tấm, cạo lớp màng phía<br /> trên, loại bỏ sạch mạch máu, cắt mẫu mô<br /> thành các mảnh nhỏ có kích thước nhỏ<br /> khoảng 2 mm2. Rửa mẫu mô trong nước<br /> muối sinh lý vô trùng từ 2 - 3 lần, trải vào<br /> bình nuôi (flasks 75 cm2). Bổ sung vào<br /> bình nuôi 8 ml môi trường MSC Cult Clinic<br /> completed (RegenmedLab, Việt Nam),<br /> lắc nhẹ cho mẫu mô dàn đều mà không<br /> cụm lại với nhau. Nuôi cấy ở nhiệt độ 37ºC,<br /> <br /> Tế bào được nuôi cấy và phân lập<br /> theo quy trình tại Phòng Thí nghiệm Tế<br /> bào gốc, Đơn vị Tế bào gốc Vạn Hạnh.<br /> Chuyển mẫu kiểm tra, đánh giá chất lượng<br /> độc lập tại Viện Tế bào gốc, Đại học<br /> Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh.<br /> <br /> 24<br /> <br /> * Xác định các dấu ấn của TBGTM:<br /> Xác định dấu ấn của tế bào gốc thông<br /> qua các kháng nguyên bề mặt tế bào, ở<br /> lần cấy chuyển thứ 4 (P4), tế bào được<br /> tách ra và nhuộm với panel kháng thể đơn<br /> clon kháng CD44, CD73, CD90, CD14,<br /> CD45, HLADR. Kết quả phân tích bằng<br /> kỹ thuật flowcytometry trên hệ thống FACS<br /> Calibur (Becton Dickinson).<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018<br /> <br /> và trải tế bào trên lame kính. Quan sát và<br /> <br /> enzym, chuyển ADP thành ATP. Dựa vào<br /> đo ATP thông qua kết quả đo mật độ<br /> quang với máy Luminometter có thể xác<br /> định sự hiện diện hay vắng mặt của<br /> mycoplasma.<br /> <br /> chụp hình nhiễm sắc thể (NST), sắp xếp các<br /> <br /> Sau khi đặt các vật liệu thí nghiệm về<br /> <br /> bộ NST sử dụng phần mềm metasystem.<br /> <br /> nhiệt độ phòng, ly tâm 2 ml dịch nuôi tế<br /> <br /> NST đồ thực hiện trên lần cấy chuyển<br /> <br /> bào ở 1.500 vòng/5 phút. Chuyển 100 µl<br /> <br /> thứ 5, khi mật độ tế bào đạt gần 80%,<br /> <br /> dịch huyền phù trong vào cuvetter máy<br /> <br /> tiến hành thay môi trường mới và bắt đầu<br /> <br /> Luminometter, thêm 100 µl dung dịch<br /> <br /> kiểm tra NST.<br /> <br /> MycoAlert reagent vào mỗi ống, đợi 5 phút,<br /> <br /> * Kiểm tra nhiễm sắc thể đồ:<br /> Tế bào được nuôi cấy và làm ngừng<br /> phân bào tại pha metaphase bằng colcicin.<br /> Sau đó, nhuộm với thuốc nhuộm Giemsa<br /> <br /> Nhuộm G-banding. Nhúng lần lượt mẫu<br /> <br /> đọc kết quả Reading A bằng máy<br /> <br /> lame trong trypsin 37ºC, PBS lạnh trong<br /> <br /> Luminometter. Thêm 100 µl MycoAlert<br /> <br /> 10 giây, thuốc nhuộm Giemsa trong 4 phút.<br /> <br /> substrate vào mỗi mẫu, đợi 10 phút,<br /> <br /> Để mẫu lame 2 phút ở nhiệt độ phòng và<br /> <br /> đọc kết quả Reading B. Xác định sự tồn<br /> <br /> dùng bình tia rửa phần thuốc nhuộm thừa.<br /> <br /> tại của mycoplasma qua tỷ số Reading<br /> <br /> Xử lý tiêu bản bằng hệ thống IKAROS.<br /> <br /> B/Reading A như sau:<br /> <br /> * Kiểm tra nội độc tố bằng chế phẩm LAL:<br /> Nội độc tố (endotoxin) được kiểm tra<br /> bằng kỹ thuật tạo gel với Limulus Amebocyte<br /> Lysate - LAL (Lonza) theo quy trình của<br /> FDA (Mỹ). Trộn đều chế phẩm LAL với mẫu<br /> tế bào cần kiểm tra. Sau thời gian ủ 60 phút,<br /> <br /> + Nếu B/A < 0,9: kết quả âm tính cho<br /> mycoplasma.<br /> + Nếu B/A từ 0,9 - 1,2: lặp lại thí nghiệm<br /> sau 24 giờ.<br /> + Nếu B/A > 1,2: kết quả nhiễm<br /> mycoplasma (dương tính).<br /> <br /> cẩn thận lấy từng ống mẫu thử, ghi lại<br /> phản ứng trong mỗi ống. Mẫu dương tính<br /> với nội độc tố sẽ tạo gel, còn mẫu âm tính<br /> thì không.<br /> * Kiểm tra mycoplasma:<br /> Kiểm tra mycoplasma bằng phương pháp<br /> đánh giá hoạt tính enzym đặc hiệu của<br /> mycoplasma sử dụng bộ kít MycoAlert<br /> mycoplasma detection, kít chứa các cơ<br /> chất và chất giải phóng enzym ra khỏi<br /> mycoplasma. Những cơ chất sẽ tác động<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> Kết quả nuôi cấy mô dây rốn phân lập<br /> tế bào gốc: sau 24 giờ các mảnh mẫu mô<br /> được nuôi cấy bắt đầu bám dính vào bề<br /> mặt bình nuôi cấy, số lượng đạt khoảng<br /> 30 - 50%, sau 72 giờ các mẫu mô bám<br /> dính hoàn toàn vào bề mặt bình nuôi cấy<br /> và sau 5 - 7 ngày, các tế bào di cư xuất<br /> hiện ra tại rìa mảnh mô (hình 1A).<br /> 25<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018<br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> C<br /> <br /> D<br /> <br /> Hình 1: Sự di cư của TBGTM từ mẫu mô dây rốn trong thời gian nuôi cấy 5 - 21 ngày.<br /> (Hình 1A: Sau 7 ngày nuôi; hình 1B: Sau 10 ngày nuôi;<br /> hình 1C: Sau 14 ngày nuôi; hình 1D: Tế bào P1 sau 4 ngày cấy chuyển)<br /> TBGTM thu được từ mẫu mô dây rốn có khả năng bám dính trên bề mặt dụng cụ<br /> nuôi cấy, dạng thuôn dài gần giống với hình dạng của nguyên bào sợi (hình 1D).<br /> Sau 14 - 21 ngày, tế bào trong bình mô nuôi cấy trải đều, mật độ đạt khoảng 70%,<br /> đây là thời điểm có thể tiến hành đợt cấy chuyền đầu tiên (P0 cấy ra P1) (hình 1B-C).<br /> Bảng 1: Kết quả kiểm tra các marker của TBGTM từ mô dây rốn bằng flowcytometry.<br /> Marker dương tính (%)<br /> <br /> Mẫu TBGTM<br /> từ mô dây rốn<br /> <br /> 26<br /> <br /> Marker âm tính (%)<br /> <br /> CD44<br /> <br /> CD73<br /> <br /> CD90<br /> <br /> CD14<br /> <br /> CD45<br /> <br /> HLADR<br /> <br /> Mẫu 1<br /> <br /> 95,64<br /> <br /> 97,50<br /> <br /> 98,57<br /> <br /> 5,98<br /> <br /> 3,80<br /> <br /> 0,24<br /> <br /> Mẫu 2<br /> <br /> 99,94<br /> <br /> 99,74<br /> <br /> 99,86<br /> <br /> 0,73<br /> <br /> 0,06<br /> <br /> 0,01<br /> <br /> Mẫu 3<br /> <br /> 99,94<br /> <br /> 98,21<br /> <br /> 99,77<br /> <br /> 0,72<br /> <br /> 0,26<br /> <br /> 0<br /> <br /> Mẫu 4<br /> <br /> 99,64<br /> <br /> 96,65<br /> <br /> 98,02<br /> <br /> 4,81<br /> <br /> 0,38<br /> <br /> 0,51<br /> <br /> Mẫu 5<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,37<br /> <br /> 99,63<br /> <br /> 3,04<br /> <br /> 4,33<br /> <br /> 0,64<br /> <br />