Phân tích đồng phân quang học của atenolol trong viên nén bằng phương pháp sắc ký lỏng (HPLC)

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> <br /> PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CỦA ATENOLOL<br /> TRONG VIÊN NÉN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG (HPLC)<br /> Lê Thị Thu Cúc*, Thái Hồng Hạnh*, Lê Khánh Trúc Diễm*, Trần Mỹ Thiên Thanh*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học của atenolol bằng phương pháp<br /> sắc ký lỏng (HPLC).<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là đồng phân (S)-atenolol. Trong quá trình<br /> thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tách đồng phân như cột sắc ký, thành phần và tỉ lệ dung<br /> môi sẽ được khảo sát nhằm chọn được điều kiện phân tích thích hợp.<br /> Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình phân tích bao gồm khảo sát tính<br /> phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ chính xác và độ đúng.<br /> Kết quả: Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học của atenolol, với các điều kiện<br /> sắc ký như sau: cột sắc ký Lux Cellulose-1, pha động là hệ dung môi n-hexan-ethanol-diethylamin (80:20:0,1;<br /> tt/tt/tt), detector UV ở bước sóng 220 nm. Độ phân giải giữa hai đồng phân lớn hơn 3,0, Khoảng tuyến tính 25 –<br /> 1000 μg /ml. Phương pháp độ chính xác và độ lặp cao với RSD < 2% và độ phục hồi từ 98 – 102%.<br /> Kết luận: Bằng phương pháp HPLC, đã xây dựng và thẩm định được quy trình phân tích đồng phân quang<br /> học của atenolol. Phương pháp được ứng dụng để kiểm tra các chế phẩm chứa đồng phân quang học của atenolol<br /> trên thị trường.<br /> Từ khóa: đồng phân atenolol, (S)-atenolol, Lux Cellulose-1<br /> ABSTRACT<br /> ENANTIOMERIC SEPARATION OF ATENOLOL IN TABLETS BY HIGH PERFORMANCE LIQUID<br /> CHROMATOGRAPHY METHOD<br /> Le Thi Thu Cuc,Thai Hong Hanh, Lê Khanh Truc Diem, Tran My Thien Thanh<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 3- 2018: 400- 405<br /> <br /> Objective: This paper describes validated direct liquid chromatographic chiral methods for enantiomeric<br /> separation and quantitative determination of atenolol.<br /> Methods: The subject of this study is (S)-atenolol. The aims of our study are: research of chromatographic<br /> conditions (column, mobile phase, ….) to separate the two isomers of atenolol. The validation of an analytical<br /> method is the process by which it is established that the performance characteristics of the method, such as<br /> Precision, Accuracy, Specificity, Linearity, Limit of Detection (LOD), meet the requirements for the intended<br /> applications.<br /> Results: A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed for the chiral separation<br /> of atenolol. The two enantiomers were separated on a Lux Cellulose-1 column. The mobile phase was n-hexane-<br /> ethanol-diethylamine (80:20:0.1; v/v/v), UV detection was at 220 nm. The resolution of the enantiomers was more<br /> than 3.0, The range of quantification for both enantiomers was 25-1000 μg.mL-1, Relative standard deviation of the<br /> method was below 2% (n=6), the recovery range was 98-102%.<br /> <br /> * Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: TS.DS. Lê Thị Thu Cúc, ĐT: 0909337330, Email: thucuc_vkn@yahoo.com.vn<br /> <br /> <br /> 400 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Conclusion A high performance liquid chromatographic (HPLC) procedure for separation of the atenolol<br /> enantiomers was established and validated. The method showed applicable to quantitative determination of<br /> atenolol enantiomers in pharmaceutical preparations.<br /> Keywords: Atenolol enantiomers, (S)-atenolol, Lux Cellulose-1<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ Trang thiết bị<br /> Các đồng phân đối quang có thể khác nhau Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao SHIMADZU<br /> về tính chất dược động học, dược lý học hay độc UFLC 20A, Detector Diod Array SPD-20AD.<br /> tính. Không hiếm các trường hợp chỉ một đối Cột Lux Cellulose-1 (cellulose tris(3,5-<br /> quang có hoạt tính trong khi đối quang kia lại dimethylphenyl carbamat) (250 x 4,6 mm; 5 μm).<br /> gây độc cho cơ thể. Trong hướng dẫn của FDA Cột Lux Cellulose-2 (cellulose tris(3-cloro-4-<br /> (Mỹ), MHW (Nhật) hay EMEA (châu Âu) đều methylphenyl carbamat) (250 x 4,6mm; 5 μm).<br /> nhấn mạnh việc tách riêng các đối quang và<br /> Cột Lux Amylose-2 (amylose tris(5-cloro-2-<br /> đánh giá sự đóng góp của mỗi đối quang tới tác<br /> methylphenyl carbamat) (250 x 4,6mm; 5 μm).<br /> dụng của thuốc. Điều này cho thấy việc tách<br /> Cân phân tích điện tử Mettler Toledo AT200,<br /> đồng phân quang học đang trở thành một xu<br /> bể siêu âm Hwashin, bình định mức, pipet chính<br /> hướng, và thực tế, nó là một trong những vấn đề<br /> xác, ống đong, cốc có mỏ,...<br /> được quan tâm nghiên cứu hàng đầu trong lĩnh<br /> vực kiểm nghiệm dược phẩm (1,2,5). Các thiết bị phân tích và dụng cụ phân tích<br /> đã được hiệu chuẩn đạt quy định theo GLP và<br /> Atenolol là chất thuộc nhóm chẹn beta, do<br /> ISO/IEC 17025.<br /> cấu trúc của atenolol có carbon bất đối nên<br /> chúng có hai đồng phân đối quang. Hai đối Hóa chất, dung môi<br /> quang của atenolol là (S)-atenolol và (R)- n-Hexan, 2-propanol (IPA), ethanol (EtOH),<br /> atenolol, trong đó chỉ có dạng (S) là dạng có hoạt diethylamin (DEA): dùng cho HPLC (J.T.Baker).<br /> tính. Mặt khác, sự hiện diện của dạng (R) còn Chất chuẩn<br /> gây tác dụng phụ. Các biệt dược của atenolol<br /> Atenolol: Viện Kiểm nghiệm thuốc TPHCM,<br /> trên thị trường phần lớn là dạng racemic. Tuy<br /> số lô QT163 010515, hàm lượng 98,47%.<br /> nhiên, do dạng đồng phân (S) có hoạt tính mạnh<br /> hơn dạng racemic, nên hiện nay cũng đã xuất (S)-Atenolol: Sigma-Aldrich, số lô 330892,<br /> hiện các chế phẩm dạng đồng phân riêng lẻ trên hàm lượng 99,0%.<br /> thị trường. Phương pháp nghiên cứu<br /> Tiếp theo công trình nghiên cứu về lĩnh vực Thay đổi thành phần và tỉ lệ pha động, nhằm<br /> tách đồng phân quang học, trong bài báo này, chọn được điều kiện phân tích đáp ứng các yêu<br /> chúng tôi giới thiệu kết quả phân tích đồng phân cầu với các thông số: hai pic đồng phân phải tách<br /> quang học (S)-atenolol bằng phương pháp sắc ký nhau hoàn toàn với độ phân giải Rs > 1,5; đáp<br /> lỏng hiệu năng cao (HPLC). ứng đầu dò cao, hệ số bất đối As của pic nằm<br /> trong khoảng 0,8 - 1,5, Sau khi tìm được điều<br /> ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU.<br /> kiện phân tích thích hợp, tiến hành thẩm định<br /> Đối tượng nghiên cứu quy trình phân tích bao gồm: khảo sát tính phù<br /> Viên nén atenolol STADA (atenolol 50 mg). hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính,<br /> Viên nén (S)-atenolol 25 mg (Nhà sản xuất: giới hạn phát hiện, độ chính xác và độ đúng(4).<br /> Emcure pharm Ltd. India). Chuẩn bị mẫu<br /> Trang thiết bị, hóa chất, dung môi Dung dịch mẫu chuẩn atenolol (500 μg/ml): Cân<br /> chính xác khoảng 25 mg atenolol chuẩn, cho vào<br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 401<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> bình định mức 50 ml, thêm khoảng 35 ml Nhận xét: Điều kiện 1, 2, 3 và 4: không phân<br /> methanol, siêu âm 5 phút, lắc đều, để nguội, biệt được các dạng đồng phân.<br /> thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng Điều kiện 5: hai pic đồng phân tách hoàn<br /> lọc PTFE 0,45 μm. toàn với RS = 3,89 (pic 1 có thời gian lưu 9,92 phút<br /> Dung dịch mẫu chuẩn (S)-atenolol (250 μg/ml): và pic 2 có thời gian lưu 12,80 phút).Như vậy,<br /> Cân chính xác khoảng 5 mg (S)-atenolol chuẩn, điều kiện thích hợp để phân tách đồng phân<br /> cho vào bình định mức 20 ml, thêm khoảng 10 quang học atenolol là: Cột sắc ký Lux Cellulose-1<br /> ml methanol, siêu âm 5 phút, lắc đều, để nguội, (250 x 4,6 mm; 5 μm). Pha động n-hexan-EtOH-<br /> thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng DEA (80:20:0,1). Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Nhiệt<br /> lọc PTFE 0,45 μm. độ cột: 30 oC. Thể tích tiêm mẫu: 20 μl. Bước sóng<br /> Dung dịch mẫu thử (S)-atenolol: Cân 20 viên phát hiện: 220 nm (Hình 1).<br /> (S)-atenolol, xác định khối lượng trung bình Thẩm định phương pháp<br /> viên. Nghiền 20 viên thành bột mịn, cân lượng Khảo sát tính phù hợp hệ thống<br /> bột viên tương ứng với khoảng 25 mg (S)-<br /> Bảng 2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của<br /> atenolol, cho vào bình định mức 100 ml, thêm<br /> phương pháp (n=6).<br /> khoảng 50 ml methanol, siêu âm 5 phút, lắc đều, Chuẩn (S)-atenolol Chuẩn atenolol<br /> để nguội, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc % %RS %<br /> Rt %RSD RSD Rt<br /> đều, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 μm. As D RSD As Rs<br /> (phút) (Rt) (phút)<br /> (S) (Rt) (S)<br /> Dung dịch mẫu thử atenolol: Cân 20 viên<br /> Pic 1 9,922 0,09 0,13 1,2<br /> atenolol, xác định khối lượng trung bình viên. 12,74 0,14 0,39 1,5 12,80 0,07 0,10 3,9<br /> Pic 2 1,3<br /> Nghiền 20 viên thành bột mịn, cân lượng bột 2 9<br /> viên tương ứng với khoảng 50 mg atenolol, cho Kết quả thống kê cho thấy, sau 6 lần sắc ký<br /> vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 50 ml thông số thời gian lưu (Rt) và diện tích pic (S)<br /> methanol, siêu âm 5 phút, lắc đều, để nguội, của mỗi pic đồng phân có RSD < 2%; giá trị độ<br /> thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua phân giải (RS) lớn hơn 1,5 và hệ số đối xứng (AS)<br /> màng lọc PTFE 0,45 μm. nằm trong khoảng 0,8 - 1,8, Vậy phương pháp<br /> Dung dịch mẫu placebo: chuẩn bị như dung đạt tính phù hợp hệ thống.<br /> dịch mẫu thử nhưng thay lượng bột thuốc bằng Tính đặc hiệu<br /> lượng tá dược tương ứng trong mẫu thử (viên Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu đối chiếu<br /> nén atenolol). và mẫu thử.<br /> Dung dịch mẫu trắng: Dung môi hòa tan mẫu Kết quả cho thấy mẫu trắng không có pic<br /> là methanol. trùng với pic chất phân tích. Thời gian lưu của<br /> KẾT QUẢ pic chính trong mẫu thử tương ứng với thời gian<br /> lưu của pic chính trong mẫu chuẩn (S)-atenolol.<br /> Khảo sát điều kiện sắc ký<br /> Khi thêm chuẩn (S)-atenolol vào mẫu chuẩn<br /> Bảng 1. Các điều kiện sắc ký khảo sát (3).<br /> atenolol thì diện tích pic (S)-atenolol (pic có thời<br /> Pha động Cột sắc ký<br /> Điều kiện 1 n-hexan-EtOH (80:20) Cột Lux Amylose-2<br /> gian lưu khoảng 12,8 phút) tăng cao so với ban<br /> Điều kiện 2 n-hexan-EtOH (80:20) Cột Lux Cellulose-2 đầu. Phổ tử ngoại tại thời gian di chuyển của các<br /> Điều kiện 3 n-hexan-EtOH (80:20) Cột Lux Cellulose-1 pic trong mẫu thử giống phổ tử ngoại của mẫu<br /> Điều kiện 4 n-hexan-EtOH-DEA Cột Lux Cellulose-2 chuẩn. Độ tinh khiết của các pic lớn hơn 99%.<br /> (80:20:0,1)<br /> Hai pic của hai dạng đồng phân có phổ UV<br /> Điều kiện 5 n-hexan- EtOH-DEA Cột Lux Cellulose-1<br /> (80:20:0,1) giống nhau. Vậy phương pháp có tính đặc hiệu.<br /> <br /> <br /> <br /> 402 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Điều kiện 1 (mẫu chuẩn atenolol) Điều kiện 2 (mẫu chuẩn atenolol)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Điều kiện 3 (mẫu chuẩn atenolol) Điều kiện 4 (mẫu chuẩn atenolol)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> mẫu chuẩn atenolol mẫu chuẩn (S)-atenolol<br /> Điều kiện 5<br /> Hình 1. Các sắc ký đồ khảo sát điều kiện sắc ký.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2 Sắc ký đồ của atenolol Hình 3 Sắc ký đồ của chuẩn atenolol + chuẩn (S)-<br /> (mẫu chuẩn atenolol) atenolol<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 403<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. Sắc ký đồ của (S)-atenolol Hình 5. Sắc ký đồ của (S)-atenolol<br /> (mẫu chuẩn) (mẫu thử)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 6. Sắc ký đồ của mẫu trắng(Placebo)<br /> Khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại và giới hạn phát hiện<br /> Bảng 3. Phương trình hồi quy, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện.<br /> Mẫu chuẩn atenolol Mẫu chuẩn<br /> (R)-atenolol (S)-atenolol (S)-atenolol<br /> y = 36254 x y = 6340 x y = 36363 x<br /> Phương trình hồi qui<br /> r = 0,9999 r = 0,9999 r = 0,9999<br /> Khoảng tuyến tính 25 - 1000 µg/ml<br /> 0,1 µg/ml<br /> Giới hạn phát hiện 0,1 µg/ml<br /> 0,1 µg/ml<br /> Nhận xét: kết quả thống kê cho thấy quy số tương quan cao.<br /> trình phân tích có khoảng tuyến tính rộng với hệ<br /> Độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ đúng<br /> Bảng 4. Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian.<br /> Ngày 1 Ngày 2<br /> Hàm lượng nhãn<br /> Số lần Diện tích Diện tích<br /> (mg) Hàm lượng (%) Hàm lượng (%)<br /> (S)-atenolol (S)-atenolol<br /> 1 8520666 97,98 8546438 98,21<br /> 2 8510447 97,93 8524867 98,94<br /> 3 8507666 98,10 8526652 98,04<br /> 50<br /> 4 8529722 97,71 8557384 97,99<br /> 5 8524258 98,12 8630053 97,58<br /> 6 8522024 98,05 8567671 97,37<br /> TB 97,98 98,02<br /> RSD (%) (n = 6) 0,15 0,56<br /> RSD (%) (n = 12) 0,39<br /> <br /> <br /> <br /> 404 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Bảng 5. Kết quả khảo sát độ đúng.<br /> Tỷ lệ chất<br /> Lượng (S)-atenolol Lượng (S)-atenolol Lượng tìm lại Tỷ lệ phục hồi<br /> chuẩn thêm vào Diện tích pic<br /> có sẵn (µg/ml) thêm vào (µg/ml) ( µg/ml) (%)<br /> (%)<br /> 80 122,54 98,21 8073610 98,13 99,92<br /> 122,53 98,21 8068921 98,01 99,80<br /> 122,51 98,21 8100476 98,89 100,70<br /> 100 122,75 122,76 9016724 123,70 100,76<br /> 122,37 122,76 8937105 121,90 99,30<br /> 122,61 122,76 9007193 123,58 100,67<br /> 120 122,57 147,32 9860928 146,95 99,75<br /> 122,42 147,32 9875210 147,49 100,12<br /> 122,51 147,32 9879384 147,52 100,13<br /> Trung bình 99,31<br /> RSD% 0,43<br /> Nhận xét: Phương pháp phân tích đạt độ kính trong 4,6 mm, kích thước hạt 5 μm. Pha<br /> đúng với tỷ lệ phục hồi nằm trong khoảng cho động là hệ dung môi n-hexan-EtOH-DEA<br /> phép 98%-102%. (80:20:0,1, v/v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút, nhiệt độ<br /> 30 oC, thể tích tiêm mẫu 20 μl, bước sóng phát<br /> BÀNLUẬN<br /> hiện 220 nm. Quy trình này có tính đặc hiệu, độ<br /> Với sắc ký pha thuận sử dụng pha tĩnh bất chính xác và độ lặp cao.<br /> đối, dung môi không phân cực như n-hexan<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> chứa một alcol như ethanol hay IPA thường<br /> 1. Alberto C., Luisa P., Alessandro M., Nicola M., Francesco D.<br /> được sử dụng. Vai trò của alcol là cạnh tranh (2011), “Recent applications in chiral high performance liquid<br /> với atenolol để gắn với pha tĩnh bất đối nhờ chromatography: A review”, Analytica Chimica Acta, 706, pp.205-<br /> 222,<br /> khả năng tạo liên kết hydro. Để tách các chất<br /> 2. Caner H., Groner E., Levy L., Agranat I. (2004), “Trends in the<br /> có nhóm acid, một lượng nhỏ các acid như development of chiral drugs”, Drug Discov. Today, 9(3), 105,<br /> DEA cũng được thêm vào pha động để làm 3. Dongmei W., Fang L., Zhen J., Li Y., and Xingjie G.o (2014),”<br /> Chiral Recognition Mechanisms of four β-Blockers by HPLC<br /> giảm thời gian lưu, tăng độ phân giải cũng with Amylose Chiral Stationary Phase”, Iran J Pharm Res, 13(2),<br /> như giảm hệ số kéo đuôi. Ngoài ra, sự có mặt pp.449-45,<br /> của DEA sẽ tăng khả năng tách đối quang vì 4. ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of<br /> analytical procedures: text and methodology, pp.1-13,<br /> nó có tác dụng ngăn sự kết hợp của các đối 5. Landoni MF, Soraci A. (2001), “Pharmacology of Chiral<br /> quang. Compounds: 2-Arylpropionic Acid Derivatives”, Current Drug<br /> Metabolism, 2, 37-51,<br /> KẾT LUẬN<br /> Bằng phương pháp HPLC sử dụng pha tĩnh Ngày nhận bài báo: 03/02/2018<br /> bất đối, chúng tôi đã tiến hành xây dựng và Ngày phản biện nhận xét bài báo: 02/03/2018<br /> thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang Ngày bài báo được đăng: 20/04/2018<br /> học (S)-atenolol, với các điều kiện như sau: cột<br /> sắc ký Lux Cellulose-1, chiều dài 250 mm, đường<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 405<br />