Phân tích trình tự vùng gen ty thể HV1 và HV2 trên dân tộc Chăm Việt Nam

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ VÙNG GEN TY THỂ HV1 VÀ HV2<br /> TRÊN DÂN TỘC CHĂM VIỆT NAM<br /> Trần Thị Thúy Hằng, Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định trình tự và phân tích tính đa hình nucleotid đơn (Single<br /> nucleotid polymorphisms - SNP) vùng gen ty thể HV1, HV2 trên dân tộc Chăm Việt Nam. Kỹ thuật giải trình<br /> tự gen được được áp dụng để phân tích 100 mẫu DNA của người dân tộc Chăm, kết quả được so sánh<br /> với trình tự chuẩn rCRS, từ đó phân tích tính đa hình nucleotid đơn (SNP) của vùng gen HV1 và HV2.<br /> Kết quả cho thấy đã xác định được trình tự hoàn chỉnh vùng gen HV1, HV2 và phát hiện được nhiều SNP<br /> ở các mẫu nghiên cứu. Xác định được tỷ lệ một số SNP hay gặp: SNP A73G và A263G, 315insC gặp ở<br /> 100% mẫu nghiên cứu, 309insC là 64%, T16189C là 56%, A16183C là 44%, C16223T là 37%, G16129A<br /> là 23%, T16304C là 21%, C16261T là 20%; C150T là 20%; A210G là 20%. Đây là số liệu đầu tiên,<br /> hoàn chỉnh về trình tự vùng gen ty thể HV1 và HV2 của dân tộc Chăm với số lượng mẫu tương đối lớn.<br /> Từ khóa: DNA ty thể, gen HV1, gen HV2, dân tộc Chăm.<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Vùng gen ty thể HV1 và HV2 được Anderson<br /> và cộng sự xác định năm 1981 nằm trong vùng<br /> điều khiển D-loop của DNA ty thể được gọi là<br /> vùng siêu biến 1 (HV1- Hypervariable region 1)<br /> có kích thước 359bp ở vị trí 16024 - 16383 và<br /> vùng siêu biến 2 (HV2 - Hypervariable region<br /> 2) có kích thước 315bp nằm ở vị trí 57 - 372<br /> [1]. Đây là vùng có tần số đột biến cao nhất<br /> trong hệ gen ty thể người [2].<br /> Cũng giống như hệ gen trong nhân, hệ gen<br /> ty thể mang những trình tự đa hình. Đa hình là<br /> sự khác biệt về chuỗi DNA giữa những cá thể,<br /> các nhóm, hoặc các quần thể. Nó bao gồm đa<br /> hình nucleotid đơn (SNP), các chuỗi lặp, thêm<br /> đoạn, mất đoạn và tái tổ hợp. Đa hình gen có<br /> Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên<br /> cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Email: khanhvan7364@gmail.com<br /> Ngày nhận: 02/03/2017<br /> <br /> thể là kết quả của quá trình tiến hóa hoặc được<br /> tạo nên bởi yếu tố bên ngoài (như virus hoặc<br /> chiếu xạ). Người ta cho rằng đa hình giúp ty<br /> thể ít nhạy cảm với sự thay đổi năng lượng, do<br /> đó tạo nhiều nhiệt và các gốc tự do, giúp con<br /> người thích ứng khi di cư tới nơi có khí hậu<br /> lạnh hơn như từ châu Phi sang châu Âu [3].<br /> Cho đến nay người ta đã thống kê được 623<br /> kiểu đa hình trên genom ty thể người, trong<br /> đó trên gen HV1 có 49 vị trí nucleotid thay đổi,<br /> trên gen HV2 có 105 vị trí nucleotid thay đổi<br /> được công bố trong (http://www.mitomap.org)<br /> năm 2013 [4 - 7].<br /> Những nghiên cứu gần đây, cho thấy đa<br /> hình trên gen HV1 và HV2 có liên quan đến<br /> nhiều bệnh, các bệnh ty thể thường gặp như:<br /> hội chứng Leigh, bệnh thần kinh Leber, bệnh<br /> LHON, hội chứng Kearns - Sayre, hội chứng<br /> Pearson, hội chứng NARP các bệnh liên quan<br /> đến quá trình chuyển hóa, lão hóa như: Đái<br /> <br /> Ngày được chấp nhận: 26/6/2017<br /> <br /> 8<br /> <br /> TCNCYH 108 (3) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> tháo đường, Alzheimer, Pakinson; các bệnh<br /> liên quan đến ung thư [8 - 12].<br /> Đề tài được thực hiện với mục tiêu: Xác<br /> định trình tự và phân tích tính đa hình nucleotid<br /> đơn vùng gen ty thể HV1, HV2 trên dân tộc<br /> Chăm Việt Nam.<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 1. Đối tượng<br /> 100 mẫu máu ngoại vi (chống đông bằng<br /> EDTA) của người bình thường, khỏe mạnh<br /> thuộc dân tộc Chăm Việt Nam (sống ở tỉnh<br /> Bình Thuận).<br /> 2. Phương pháp<br /> DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu<br /> máu toàn phần theo phương pháp sử dụng enzym protease K và phenol:chloroform:isoamyl<br /> alcohol.<br /> Sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại vùng<br /> gen HV1 và HV2:<br /> HV1F: 5’- CTC CAC CAT TAG CAC CCA<br /> AAG C -3’<br /> HV1-R: 5’- CCT GAA GTA GGA ACC AGA<br /> TG -3’<br /> HV2-F: 5’- GGT CTA TCA CCC TAT TAA<br /> CCA C -3’<br /> <br /> HV2-R: 5’- CTG TTA AAA GTG CAT ACC<br /> GCC A -3’<br /> Thành phần của phản ứng PCR: 1X đệm<br /> PCR; 2,5 mM dNTP; 0,2 µl mồi xuôi và ngược;<br /> 0,5 unit Taq polymerase; 50ng DNA và H2O,<br /> tổng thể tích 20 µl.<br /> Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94oC - 5<br /> phút; 30 chu kỳ [94oC- 30 giây, 54oC - 30 giây,<br /> 72oC - 30 giây]; 72oC - 5 phút; bảo quản mẫu<br /> ở 15o C.<br /> Giải trình tự gen theo qui trình BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster<br /> city, USA). Tiến hành trên máy 3100-Avant Genetic Analyzer của hãng ABI-PRISM. So sánh<br /> với trình tự GeneBank để xác định đa hình.<br /> Kết quả giải trình tự gen được đối chiếu và so<br /> sánh với trình tự chuẩn J01415 trên GeneBank<br /> (National center for biotechnology information,<br /> NCBI) phân tích bằng phần mềm CLC Main<br /> Workbench 6.01 để xác định đa hình hai vùng<br /> siêu biến HV1 và HV2.<br /> 3. Đạo đức nghiên cứu<br /> Đối tượng tham gia nghiên cứu hoàn toàn<br /> tự nguyện và có quyền rút khỏi nghiên cứu khi<br /> không đồng ý tiếp tục tham gia. Các thông tin<br /> cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật.<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> 1. Khuếch đại vùng gen HV1 và HV2<br /> DNA sau khi được tách chiết có chất lượng tốt sẽ được sử dụng để khuếch đại gen HV1 và HV2<br /> bằng các cặp mồi đặc hiệu với điều kiện thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như đã mô tả ở<br /> phần phương pháp.<br /> <br /> Hình 1. Sản phẩm khuếch đại vùng gen HV1 của (A) và HV2 (B)<br /> 1-22: 22 mẫu nghiên cứu người dân tộc Chăm. M: Thang chuẩn 100bp<br /> TCNCYH 108 (3) - 2017<br /> <br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Sản phẩm khuyếch đại vùng gen HV1 và HV2 có chất lượng tốt chỉ gồm một băng đặc hiệu có<br /> kích thước 543 bp và 422 bp.<br /> 2. <br /> <br /> Kết quả phân tích trình tự vùng gen HV1 và HV2<br /> <br /> 2.1. Trình tự nucleotid vùng gen ty thể HV1<br /> <br /> Hình 2. Các vị trí đa hình nucleotid đơn (SNP) của vùng gen HV1<br /> được đối chiếu với trình tự chuẩn do Anderson và cs công bố năm 1981 [1]<br /> <br /> Hình 3. Hình ảnh giải trình tự một số SNP vùng gen ty thể HV1<br /> của mẫu nghiên cứu mã số 12 (MS12)<br /> (SNP: C16278T; C16291A; T16297C)<br /> 10<br /> <br /> TCNCYH 108 (3) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 2.2. Trình tự nucleotid vùng gen ty thể HV2<br /> <br /> Hình 4. Các vị trí đa hình nucleotid đơn (SNP) của vùng gen HV2<br /> được đối chiếu với trình tự chuẩn do Anderson và cs công bố năm 1981 [1]<br /> <br /> Hình 5. Hình ảnh giải trình tự một số SNP vùng gen ty thể HV2<br /> của mẫu nghiên cứu mã số 15 (MS15)<br /> (SNP: 249DelA; A263G)<br /> <br /> TCNCYH 108 (3) - 2017<br /> <br /> 11<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 2.3. Đa hình nuleotid đơn (SNP) vùng gen<br /> ty thể HV1 và HV2<br /> Kết quả giải trình tự gen HV1 và HV2 của<br /> 100 mẫu nghiên cứu được tiến hành so sánh<br /> với trình tự chuẩn, cho thấy có khá nhiều vị trí<br /> đa hình so với trình tự chuẩn. Mẫu có ít vị trí<br /> đa hình nhất là 7, trong khi mẫu có nhiều vị trí<br /> đa hình nhất là 19. Chúng tôi cũng nhận thấy<br /> rằng, các vị trí đa hình tập trung nhiều hơn ở<br /> gen HV1.<br /> Các vị trí đa hình hay gặp ở các mẫu nghiên<br /> <br /> cứu là 309insC là 64%, T16189C là 56%,<br /> A16183C là 44%, C16223T là 37%, G16129A<br /> là 23%, T16304C là 21%, C16261T là 20%,<br /> C150T là 20%, A210G là 20%, đặc biệt là ba<br /> vị trí đa hình A73G, A263G và 315insC gặp ở<br /> 100% mẫu nghiên cứu. Các đột biến thay thế là<br /> phổ biến nhất, các nucleotid thêm vào thường<br /> là C trong khi các nucleotide mất thường là A.<br /> Các kết quả thu được về các vị trí đa hình trên<br /> hai vùng gen HV1 và HV2 phản ánh tốc độ đột<br /> biến rất cao của vùng gen này.<br /> <br /> Bảng 1. Bảng các vị trí đa hình thường gặp trên gen HV1 và HV2<br /> Gen HV1<br /> <br /> Tỷ lệ<br /> <br /> Tỷ lệ %<br /> <br /> Gen HV2<br /> <br /> Tỷ lệ<br /> <br /> Tỷ lệ %<br /> <br /> T16189C<br /> <br /> 56/100<br /> <br /> 56%<br /> <br /> A73G<br /> <br /> 100/100<br /> <br /> 100%<br /> <br /> A16183C<br /> <br /> 44/100<br /> <br /> 44%<br /> <br /> 315insC<br /> <br /> 100/100<br /> <br /> 100%<br /> <br /> C16223T<br /> <br /> 37/100<br /> <br /> 37%<br /> <br /> A263G<br /> <br /> 100/100<br /> <br /> 100%<br /> <br /> G16129A<br /> <br /> 23/100<br /> <br /> 23%<br /> <br /> 309insC<br /> <br /> 64/100<br /> <br /> 64%<br /> <br /> T16304C<br /> <br /> 21/100<br /> <br /> 21%<br /> <br /> A210G<br /> <br /> 20/100<br /> <br /> 20%<br /> <br /> C16261T<br /> <br /> 20/100<br /> <br /> 20%<br /> <br /> C150T<br /> <br /> 20/100<br /> <br /> 20%<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> Trình tự vùng gen ty thể HV1 và HV2 đã<br /> phân tích được có kích thước tương ứng là<br /> 543bp và 422bp theo trình tự chuẩn CRS/<br /> rCRS của gen ty thể. Trong thực tế, các tài<br /> liệu khác nhau xác định độ dài vùng gen HV1<br /> và HV2 là rất khác nhau. Vùng gen HV1 của<br /> trình tự chuẩn CRS có kích thước 359bp (từ<br /> vị trí 16024 – 16383) và vùng gen HV2 có kích<br /> thước 325bp (từ vị trí 057 – 372) [1]. Theo<br /> TWGDAM (Technical Working Groups for DNA<br /> Analysis Methods) cho rằng trình tự tối thiểu<br /> được chấp nhận cho vùng gen HV1 là từ vị trí<br /> 16024 – 16365 và cho vùng gen HV2 là từ vị<br /> trí 073 – 340. Trình tự chuẩn Cambridge sau<br /> khi chỉnh sửa (rCRS) cho thấy vùng điều khiển<br /> D-loop nằm từ vị trí 16104 đến 16569 và từ 1<br /> đến 191 và không chỉ rõ vị trí vùng gen ty thể<br /> 12<br /> <br /> HV1 và HV2 [4]. Như vậy, trong nghiên cứu<br /> này chúng tôi đã xác định được trình tự hoàn<br /> chỉnh của vùng gen HV1 và HV2.<br /> Trình tự của các mẫu nghiên cứu được đối<br /> chiếu và so sánh với trình tự chuẩn, kết quả<br /> cho thấy có rất nhiều đa hình nucleotid đơn<br /> (có từ 7 đến 19 SNP ở mỗi mẫu nghiên cứu).<br /> Nghiên cứu năm 1999, trên 50 người Việt Nam<br /> đã phát hiện được 20 đa hình vị trí các enzym<br /> cắt trên DNA ty thể, trong đó 3 vị trí của enzym<br /> HaeII - 13Viet, MspI - 19Viet, MspI - 20Viet là<br /> các đa hình mới [5]. Khi giải trình tự 2 vùng gen<br /> HV1 và HV2 trên 2 mẫu dân tộc Kinh, 2 mẫu<br /> dân tộc Tày và một mẫu dân tộc H’Mông, đã<br /> phát hiện 26 vị trí đa hình trên HV1 và 5 vị trí đa<br /> hình trên HV2 [6]. Sự đa hình trên hai vùng siêu<br /> biến HV1 và HV2 hầu hết là các đa hình đơn<br /> TCNCYH 108 (3) - 2017<br /> <br />