Phát hiện mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể y ở nam giới mắc hội chứng oat

Chia sẻ: Ngân Hà | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

72
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xác định tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y ở nam giới mắc hội chứng OAT. Hội chứng OAT (Oligo - Astheno - Teratozoospermia) là tình trạng tinh trùng trong tinh dịch có mật độ ít, độ di động yếu và tỷ lệ bất thường cao.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phát hiện mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể y ở nam giới mắc hội chứng oat

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC PHÁT HIỆN MẤT ĐOẠN NHỎ TRÊN NHIỄM SẮC THỂ Y Ở NAM GIỚI MẮC HỘI CHỨNG OAT Nguyễn Bá Sơn, Nguyễn Xuân Tùng, Lương Thị Lan Anh Trường Đại học Y Hà Nội Hội chứng OAT (Oligo - Astheno - Teratozoospermia) là tình trạng tinh trùng trong tinh dịch có mật độ ít, độ di động yếu và tỷ lệ bất thường cao. Hội chứng OAT chiếm khoảng 8,5% nam giới tới xét nghiệm tinh dịch đồ và chiếm 12,5% nam giới có tinh dịch đồ bất thường. Mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y là nguyên nhân rối loạn vật chất di truyền đứng thứ hai sau hội chứng Klinefelter gây vô sinh nam do ảnh hưởng tới quá trình tạo tinh trùng. Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y ở nam giới mắc hội chứng OAT. 327 nam giới mắc hội chứng OAT được lựa chọn vào nghiên cứu, sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR, M - PCR ). Kết quả cho thấy 40/327 nam giới mắc hội chứng OAT có mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y, chiếm tỷ lệ 12,2%, trong đó: mất đoạn AZFc chiếm tỷ lệ cao nhất là 80%, mất đoạn AZFd chiếm tỷ lệ 20%; không phát hiện được trường hợp mất đoạn AZFa, AZFb. Đối với mất đoạn AZFd, toàn bộ mất đoạn xảy ra ở vị trí sY152 và không phát hiện trường hợp nào mất ở vị trí PBY2. Mất đoạn xảy ra chủ yếu ở nhóm OAT mức độ nặng, chiếm 16%. Từ khóa: Mất đoạn nhỏ, nhiễm sắc thể Y, hội chứng OAT I. ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng OAT (Oligo - Astheno Teratozoospermia) là tình trạng tinh trùng trong tinh dịch có mật độ ít, độ di động yếu và tỷ lệ bất thường cao [1]. Theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization WHO) năm 2010, hội chứng OAT là tình trạng phối hợp của 3 biểu hiện sau trên tinh dịch đồ: Mật độ tinh trùng dưới 15 triệu/ml, tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới dưới 32% và tỷ lệ tinh trùng bình thường dưới 4% [2]. Hội chứng OAT chiếm khoảng 8,5% nam giới tới xét nghiệm tinh dịch đồ và 12,5% nam giới có tinh dịch đồ bất thường [3]. Dựa vào mật độ tinh trùng, Địa chỉ liên hệ: Lương Thị Lan Anh, Bộ môn Y sinh học Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội Email: lanhluong@gmail.com Ngày nhận: 09/03/2017 Ngày được chấp nhận: 26/6/2017 TCNCYH 108 (3) - 2017 hội chứng OAT được chia làm ba mức độ: Hội chứng OAT mức độ nhẹ (mật độ tinh trùng 10 15 triệu/ml); hội chứng OAT mức độ trung bình (mật độ tinh trùng 5 - 10 triệu/ml) và hội chứng OAT mức độ nặng (mật độ tinh trùng 0 - 5 triệu/ ml) [4]. Mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y là nguyên nhân rối loạn vật chất di truyền đứng thứ hai sau hội chứng Klinefelter gây vô sinh nam do ảnh hưởng tới quá trình tạo tinh trùng [5; 6]. Tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y chiếm khoảng 2 - 14% nam giới vô sinh [5; 7 - 10]. Trên nhiễm sắc thể Y có các các vùng gen đặc hiệu (vùng AZF - Azoospermia Factor) bao gồm AZFa, AZFb, AZFc, AZFd. Mỗi vùng AZF chứa nhiều gen khác nhau và mất đoạn trong các vùng này được xác định là nguyên nhân gây ra suy giảm sinh tinh trùng [5; 11] . Việc xác định các mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y giúp cho chẩn đoán chính xác, đặc biệt là 23 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC tư vấn di truyền và có hướng điều trị đúng đắn. Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xác định tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y ở nam giới mắc hội chứng OAT. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng nghiên cứu 327 nam giới trong độ tuổi sinh sản đã làm xét nghiệm tinh dịch đồ tại Trung tâm Tư vấn Di truyền, Bệnh viện Đại Học Y Hà Nội, xác định mắc hội chứng OAT; Mật độ tinh trùng dưới 15 triệu/ml, tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới dưới 32% và tỷ lệ tinh trùng bình thường dưới 4%. 2. Phương pháp: mô tả cắt ngang. Tiến hành nghiên cứu - Thu thập mẫu bệnh phẩm: 2-5ml máu chống đông bằng EDTA. - Tách DNA từ máu ngoại vi đã chống đông EDTA bằng phenol chloroform. - Tiến hành thực hiện 3 phản ứng multiplex PCR để xác đinh các mất đoạn AZFa,b,c,d bằng các cặp mồi sY84, sY86 (AZFa); sY127, sY134 (AZFb); sY254, sY255 (AZFc); sY152, BPY2 (AZFd) và hai chứng nội tại SRY và ZFY. Thành phần của các phản ứng được mô tả trong bảng 2 Bảng 1. Vị trí và trình tự gen của các đoạn mồi trong phản ứng multuplex PCR Vị trí Mồi sY84 AZFa sY86 sY127 AZFb sY134 sY254 AZFc sY255 sY152 AZFd BPY2 SRY sY14 ZFX/Y ZFX/Y 24 Trình tự Kích thước (bp) F: 5′-AGA AGG GTC CTG AAA GCA GGT-3′ 326 R: 5′-GCC TAC TAC CTG GAG GCT TC-3′ F: 5′-GTG ACA CAC AGA CTA TGC TTC-3′ 318 R: 5′ - ACA CAC AGA GGG ACA ACC CT - 3′ F: 5′-GGC TCA CAA ACG AAA AGA AA-3′ 274 R: 5′-CTG CAG GCA GTA ATA AGG GA-3′ F: 5′-GTC TGC CTC ACC ATA AAA CG-3′ 301 R: 5′-ACC ACT GCC AAA ACT TTC AA-3′ F: 5′-GGG TGT TAC CAG AAG GCA AA-3′ 380 R: 5′-GAA CCG TAT CTA CCA AAG CAG C-3′ F: 5′-GTT ACA GGA TTC GGC GTG AT-3′ 123 R: 5′-CTC GTC ATG TGC AGC CAC-3′ F: 5’- AGACAGTCTGCCATGTTCA-3’ 125 R: 5 ‘- CAGGAGGTACTTAGCAGT-3’ F: 5’ - TAATTCCTCTTTACGCATGACC-3’ 202 R: 5’- ATATCTCTGAGCACATACC -3’ F: 5′-GAA TAT TCC CGC TCT CCG GA-3′ 472 R: 5′-GCT GGT GCT CCA TTC TTG AG-3′ F: 5′-ACC RCT GTA CTG ACT GTG ATT ACA C-3′ R: 5′-GCA CYT CTT TGG TAT CYG AGA AAG T-3′ 495 TCNCYH 108 (3) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng 2. Các thành phần của phản ứng multiplex PCR Thành phần Phản ứng 1 Phản ứng 2 Phản ứng 3 Mastermix PCR 12,5 µL 12,5 µL 12,5 µL Mồi (2,5 pmol/µL) ZFY, sY86, sY127, sY254 ZFY, sY84, sY255 SRY, sY134, BPY2, sY152 DNA (30-45 ng/µL) 4 µL 4 µL 4 µL Nước cất Vừa đủ Vừa đủ Vừa đủ Tổng 25 µL 25 µL 25 µL Chu trình nhiệt: 95oC - 10 phút; 34 chu kỳ [94oC - 1 phút 10 giây, 56oC - 1 phút 30 giây, 72oC - 1 phú; 72oC - 10 phút; giữ lạnh 4oC. Sử dụng đối chứng âm, chứng nữ và chứng dương. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% trong TBE 1X với điện thế 100V trong 70 phút. Đánh giá kết quả theo thang DNA 100 bp của hãng Invitrogen, nhuộm bằng Ethidium Bromide để phát hiện kết quả. Hình 1. Hình ảnh minh họa kết quả phản ứng multiplex PCR 3. Đạo đức nghiên cứu Các số liệu và thông tin nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan đã được xác nhận và chấp thuận bởi cơ sở nghiên cứu. Những thông tin về bệnh nhân được giữ bí mật và chỉ phục vụ công tác nghiên cứu. III. KẾT QUẢ Biểu đồ 2. Tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y ở nam giới OAT TCNCYH 108 (3) - 2017 25 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Trong 327 nam giới mắc hội chứng OAT có 40 nam giới bị mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y, chiếm tỷ lệ 12,2%. Tỷ lệ không có mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể chiếm 87,8%. Bảng 3. Vị trí mất đoạn trên nhiễm sắc thể Y ở nam giới OAT Vị trí mất đoạn Số lượng Tỷ lệ % AZFa 0 0 AZFb 0 0 AZFc 13 32,5 AZFd 8 20,0 AZFc+d 19 47,5 Tổng số 40 100 Trong số 40 nam giới bị mất đoạn: không có ai bị mất đoạn AZFa, AZFb; mất đoạn AZFc+d chiếm tỷ lệ cao nhất: 19/40 (47,5%) tiếp theo là mất đoạn AZFc: 13/40 (32,5%) và mất đoạn AZFd: 8/40 (20%). Bảng 4. Phân bố mất đoạn AZF theo locus gen Mất đoạn AZF Vị trí STS* Số lần gen bị mất Tỷ lệ % sY254 32 35,2 sY255 32 35,2 sY152 27 29,6 BPY2 0 0 91 100 AZFc AZFd Tổng *: STS Sequence Tagged Site - trình từ gắn đuôi Trong số 40 nam giới bị mất đoạn, có 91 vị trí STS bị mất đoạn. Trong đó: sY254 và sY255 thuộc vùng AZFc chiếm tỷ lệ cao nhất là 35,2%; tiếp theo là sY152 thuộc vùng AZFd chiếm tỷ lệ 29,6%; không phát hiện được trường hợp nào mất BPY2 thuộc vùng AZFd; sY84 và sY86 của vùng AZFa; sY125 va sY134 của vùng AZFb. Bảng 5. Tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y theo mức độ hội chứng OAT Mất đoạn Đột biến Mức độ (số lượng) Số lượng Bình thường Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % OAT mức độ nhẹ (31) 2 6,5 29 93,5 OAT mức độ trung bình (54) 4 7,4 50 92,6 OAT mức độ nặng (212) 34 16,0 178 84,0 Tỷ lệ mất đoạn ở nhóm nam giới OAT mức độ nặng chiếm tỷ lệ cao nhất 16%, ở nhóm OAT mức 26 TCNCYH 108 (3) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC độ nhẹ chiếm tỷ lệ thấp nhất 6,5%. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Bảng 6. Phân bố mất đoạn AZF theo mức độ hội chứng OAT Mức độ OAT mức độ nhẹ OAT mức độ trung bình OAT mức độ nặng Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % AZFc 0 0 0 0 13 6,1 AZFd 0 0 3 5,6 5 2,3 AZFc+d 2 6,5 1 1,8 16 7,5 Tổng 31 100 54 100 212 100 Tỷ lệ mất đoạn AZFc đơn thuần trong nhóm OAT mức độ nặng là 13/212 (6,1%). Mất đoạn vùng AZFc đơn thuần nằm toàn bộ trong nhóm OAT mức độ nặng. Tỷ lệ mất đoạn vùng AZFd ở nhóm OAT mức độ trung bình chiếm tỷ lệ cao nhất 5,6%, tiếp theo là nhóm OAT mức độ nặng 2,3%, nhóm OAT mức độ nhẹ là 0%. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê, p > 0,05. Tỷ lệ mất đoạn AZFc+d ở nhóm OAT mức độ nặng chiếm tỷ lệ cao nhất 7,5%, tiếp theo là OAT mức độ nhẹ 6,5% và OAT mức độ vừa 1,8%. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê, p > 0,05. IV. BÀN LUẬN Phân tích DNA của 327 nam giới mắc hội chứng OAT cho thấy có 40 nam giới bị mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y, chiếm tỷ lệ 12,2%. Tỷ lệ này tương ứng với một nghiên cứu khác ở Việt Nam là 13,3% [12]. So với nghiên cứu khác trên nhóm nam giới OAT người Iran, tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y của chúng tôi cao hơn tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm Y của người Iran (9,52%) [8]. Sự chênh lệch tỷ lệ có thể do việc lựa chọn các cặp mồi để phát hiện đột biến của mỗi nghiên cứu là khác nhau, nguồn gốc dân tộc, địa lý của đối tượng nghiên cứu khác nhau. Trong số 40 nam giới bị mất đoạn, chúng tôi chưa thấy mất đoạn AZFa, AZFb. Mất đoạn AZFc, AZFd vẫn có thể tìm thấy tinh trùng trong TCNCYH 108 (3) - 2017 tinh dịch, tuy nhiên mật độ thấp và chất lượng tinh trùng kém. Mất hoàn toàn đoạn AZFa, AZFb dẫn tới không có tinh trùng trong tinh dịch [5]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, đối tượng nghiên cứu là nam giới mắc hội chứng OAT, do đó không phát hiện thấy mất đoạn AZFa, AZFb là điều dễ hiểu. Tuy nhiên, trong một số nghiên cứu của các tác giả khác nhau, trong nhóm OAT vẫn có một tỷ lệ nhỏ mất đoạn AZFa, AZFb (8%) [13; 9]. Điều này có thể giải thích là do trong trường hợp mất đoạn AZFa, AZFb hoàn toàn thì không thể tìm thấy tinh trùng nhưng nếu mất đoạn AZFa, AZFb không hoàn toàn vẫn có một tỷ lệ nhỏ tìm thấy tinh trùng trong tinh dịch với mật độ thấp và chất lượng kém. Với 40 trường hợp mất đoạn, mất đoạn AZFc+d chiếm tỷ lệ cao nhất (47,5%), tiếp sau là mất đoạn AZFc đơn thuần (32,5%) và mất đoạn AZFd đơn thuần (20%). So với nghiên cứu khác trên người Ấn Độ, tỷ lệ mất đoạn AZFc+d (chiếm tỷ lệ 67,7%) cao hơn so với tỷ lệ của chúng tôi [10]. Sự khác biệt này có thể do khác biệt về lựa chọn cỡ mẫu và sự khác biệt về chủng tộc. STS (Sequence Tagged Site) là một đoạn trình tự ngắn (200 - 500bp) duy nhất trong một bộ gen. Đoạn trình từ này được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR để phát hiện tất cả trình 27